Summary
肠道微生物可能通过特定或保守的机制 对其 宿主的健康产生积极或消极的影响。 秀丽隐杆线虫 是筛查此类微生物的便捷平台。本协议描述了对48种细菌分离株的高通量筛选，以影响线虫应激抵抗力，用作蠕虫健康的代表。
Abstract
秀丽隐杆线虫体积小、寿命短、遗传学简单，为研究微生物分离株对宿主生理学的影响提供了一个方便的平台。它在死亡时也会发出蓝色荧光，提供了一种方便的方法来精确定位死亡。该特性已被用于开发高通量无标记秀丽隐杆线虫生存测定（LFASS）。这些涉及设置在多孔板中的蠕虫种群的延时荧光记录，从中可以得出种群中位死亡时间。本研究采用LFASS方法一次筛选多种微生物分离株对秀丽隐杆线虫对严重热和氧化应激的易感性的影响。这里报告了这种微生物筛选管道，其特别可用于预筛选益生菌，使用严重的抗逆性作为宿主健康的代表。该协议描述了如何在多孔阵列中培养秀丽隐杆线虫肠道微生物群分离集合和同步蠕虫种群，然后再将它们组合用于测定。提供的示例涵盖了在两个平行的应力测定中对两个蠕虫菌株的47个细菌分离株和一个对照菌株的测试。然而，该方法管道易于扩展，适用于许多其他模式的筛选。因此，它提供了一种多功能设置，可以快速调查影响秀丽隐杆线虫健康的生物和生化条件的多参数景观。
Introduction
人体估计有10-100万亿个活的微生物细胞（细菌，古菌真菌），主要存在于肠道，皮肤和粘膜环境中1。在健康状态下，这些为宿主提供益处，包括维生素的产生、免疫系统的成熟、刺激对病原体的先天性和适应性免疫反应、调节脂肪代谢、调节应激反应等，对生长发育、疾病发作和衰老产生影响2，3，4，5.肠道微生物群在整个生命过程中也会发生相当大的变化。最剧烈的进化发生在婴儿期和幼儿期6，但随着年龄的增长也发生了显着变化，包括双歧杆菌丰度的降低以及梭状芽胞杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌科和肠球菌属的增加7。生活方式可以进一步改变肠道微生物组成，导致生态失调（有益细菌的丧失，机会性细菌的过度生长），导致各种疾病，如炎症性肠病，糖尿病和肥胖5，但也会导致阿尔茨海默氏症和帕金森病8，9，10，11。
这一认识对完善肠脑轴（GBA）的概念做出了重要贡献，其中肠道生理学（现在包括其中的微生物）和神经系统之间的相互作用被认为是动物代谢和生理功能的主要调节因子12。然而，微生物群在肠脑信号传导中的确切作用以及相关的作用机制远未得到充分了解13。由于肠道微生物群是健康衰老的关键决定因素，细菌如何调节衰老过程已成为激烈研究和争议的主题6，14，15。
随着蛔虫秀丽隐杆线虫与其他物种一样拥有真正的肠道微生物群，由拟杆菌、厚壁菌和放线菌16、17、18、19、20 主导，它迅速崛起为研究宿主-肠道共生相互作用的实验平台21，22，23，24，25，26 大大扩展了我们的调查库 26，27，28，29。特别是，秀丽隐杆线虫可用于研究基因-饮食、基因-药物、基因-病原体等相互作用的高通量实验方法，可以适应快速探索细菌分离株和鸡尾酒如何影响秀丽隐杆线虫的健康和衰老。
本协议描述了一种实验管道，用于立即筛选设置在多孔板中的细菌分离物或混合物阵列，以影响 秀丽隐杆线虫 抗应激性，作为健康的代表，可用于鉴定益生菌。它详细介绍了在使用荧光酶标仪处理蠕虫以进行自动抗应力分析之前，如何培养大量蠕虫种群并处理 96 孔和 384 孔板格式的细菌阵列（图 1）。该方法基于无标记自动生存测定（LFASS）30 ，该测定利用死亡荧光31现象，垂死的蠕虫产生蓝色荧光爆发，可用于确定死亡时间。蓝色荧光由储存在 秀丽隐杆线 虫肠道颗粒（一种溶酶体相关细胞器）中的邻氨基苯甲酸葡萄糖酯发出，当死亡时在蠕虫肠道中触发坏死级联反应时会破裂31。
图 1：对 秀丽隐杆线 虫抗逆性有影响的细菌分离株高通量筛选的实验工作流程 。 （A）蠕虫和细菌维护和测定设置的时间表。（B）96孔细菌板阵列的设置和处理。（C）384孔蜗杆板设置。 请点击此处查看此图的大图。
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Protocol
本研究并行使用的两种 秀丽隐杆线虫 菌株是布里斯托尔N2野生型和HT1890： daf-16（mgDf50），它们的生长速率相似。但是，该协议可以用具有相似增长率的两种菌株的任意组合进行复制。请注意，当并行测试其他菌株（例如，野生型和生长缓慢的 daf-2 突变体）时，必须考虑不同的生长速率，因此需要调整方案。以下协议中蠕虫和细菌的时间尺度和数量经过优化，可在四层的两种LFASS测定中对两种蠕虫菌株上的48种细菌分离株进行平行测试。如果要并行测试更多条件，则需要进行调整。 大肠杆菌 OP50细菌菌株是从明尼苏达大学Caenorhabditis遗传学中心（CGC）获得的。从舒伦堡实验室获得48种细菌分离株，并在LB琼脂上保存。
1. 秀丽隐杆线虫 在OP50上培养（第1-8天）
注意：目前的方法旨在在所有阶段在固体培养基上生长秀 丽隐杆线虫 雌雄同体，并避免不必要的饮食变化（即，使用替代生长较快的大 肠杆菌 菌株，如NA22或更丰富的生长培养基，如蛋盘）尽可能接近仍然广泛使用的标准生长条件32，33 。蠕虫生长温度（此处设置为15°C）取决于所使用的 秀丽隐杆线虫 菌株，可能需要调整（例如，避免或触发温度敏感表型或生物标志物的表达）。有关蠕虫饲养的信息，请参阅参考文献33。
- 准备八个直径为6厘米的NGM板（10 mL线虫生长培养基琼脂，NGM，补充文件1）32，33每个蠕虫菌株，并在室温下干燥1天。
- 通过将新鲜生长的溶原肉汤琼脂（LB琼脂，补充文件1）平板中的单个细菌克隆接种在50 mL锥形管中的25 mL OP50培养基（补充文件1）中，制备大肠杆菌OP50细菌的饱和液体培养物。在摇床培养箱中在37°C下培养培养过夜。
- 每株接种8个6cm NGM板，每板接种100μL 大肠杆菌 OP50饱和液体培养物，并在使用前将板在20°C下保持2天。
- 使用手术刀，从最近饥饿的NGM平板上切割并转移0.5cm的方形琼脂块和蠕虫到八个接种的6cm NGM平板中的每一个，并将这些平板在20°C下孵育3天（或直到蠕虫完成食物）。
- 每个蠕虫菌株准备五个 15 cm NGM 板（每个板 30 mL NGM 培养基），并接种 3 mL OP50。让板干燥，然后在37°C孵育过夜。将板保持在20°C，直到在后续步骤中使用。
- 使用 P-1000 移液器，将最多 3 mL 无菌 M9 缓冲液（补充文件 1）加入 6 cm NGM 板（步骤 1.1.）以重悬蠕虫，并将每个菌株的所有八个板中的蠕虫溶液收集在单个 15 mL 锥形管中。
- 在4°C下以142× g 离心2分钟。 使用 P-5000 移液器或配备无菌巴斯德移液器或吸头的水泵小心地除去上清液。加入 10 mL 无菌 M9 缓冲液以洗涤蠕虫颗粒。重复 2 次。
- 除去上清液（尽可能多）并使用移液管将蠕虫转移到15cm OP50接种的NGM板上（步骤1.5.）。加入 0.5 mL 浓缩的 OP50 培养物。
- 为了制备浓缩的OP50，将四个1L瓶LB中的每一个接种2mL的OP50起始培养物（在步骤1.2中制备），并在37°C和160× g的振荡培养箱中生长6小时。在3057× g 和20°C下沉淀细菌15分钟。弃去上清液，用6mL OP50培养基重悬细菌沉淀，并收集在无菌的50 mL锥形管中。
注意：细菌可以在4°C下储存长达1周。
- 通过每天用0.5mL浓缩OP50重新喂食蠕虫，在15°C下在15厘米直径的NGM板上生长每个蠕虫菌株3-4天。
- 一旦蠕虫接近完成食物，收集并在M9缓冲液中洗涤（步骤1.6.1.），将每个蠕虫菌株培养物转移到两个15cm NGM板（步骤1.5.），并在20°C下繁殖蠕虫，直到~95%的种群是妊娠成虫（野生型布里斯托尔N2大约需要24小时）。
注意：妊娠成虫的特征是蠕虫内存在卵，理想的盘子上也应该有大量未孵化的卵，没有太多的幼虫33。
- 一旦蠕虫接近完成食物，收集并在M9缓冲液中洗涤（步骤1.6.1.），将每个蠕虫菌株培养物转移到两个15cm NGM板（步骤1.5.），并在20°C下繁殖蠕虫，直到~95%的种群是妊娠成虫（野生型布里斯托尔N2大约需要24小时）。
2. 维持肠道微生物分离物收集（第 9 天）
- 在单个6cm LB琼脂平板上划线48细菌分离物，并在20°C下生长48小时。
注意：如果需要，细菌可以在25°C下生长24-36小时，但较长的20°C生长允许发现潜在的污染物。 - 同步大量秀丽隐杆线虫。
- 按照标准的卵子制备方法33 漂白妊娠成虫，并将卵转移到两个未播种的15cm NGM板上，在15°C下24小时，以使所有L1幼虫在后续步骤中孵化并同步生长。
注意：处理漂白剂溶液时要小心。
- 按照标准的卵子制备方法33 漂白妊娠成虫，并将卵转移到两个未播种的15cm NGM板上，在15°C下24小时，以使所有L1幼虫在后续步骤中孵化并同步生长。
3. 培养大型秀丽隐杆线虫培养物（第10天）
- 孵化后，将L1幼虫（来自步骤2.2.1）收集在干净的锥形15 mL管中的3-4 mL M9中。将四滴 10 μL 蠕虫溶液移液到载玻片或平板上，并在体视显微镜下以 16 倍放大倍率计算每滴蠕虫的数量。通过平均所有蠕虫溶液液滴的幼虫数量来确定溶液的蠕虫浓度。将此值乘以剩余体积，并估计每种菌株的总蠕虫计数。
注意：在此阶段，每个菌株需要46，000-50，000个L1幼虫，以便稍后填充384孔板或两个半板。- 对于每种菌株，将所有L1幼虫转移到两个15cm NGM平板（每板23，000-25，000 L1）上，先前接种3mL OP50（步骤1.5.）并重新接种0.5mL浓缩OP50。
- 在15°C下孵育，根据需要每天加满0.5mL浓缩的OP50，直到蠕虫达到L4阶段。
注意：L4 阶段的特征是肠略暗和半盘或新月形白色斑块，外阴最终形成32，33。 - 按照以下步骤制备96孔NGM-琼脂糖板。
- 通过向每个孔填充 125 μL NGM-琼脂糖（每次测定四个板）来制备 8 个 96 孔 NGM-琼脂糖板。
注意：如果在后续步骤中某些板被污染，建议再镀一些额外的板。需要两个酶标仪并行运行测定，但它们也可以从热应力测定开始连续运行，因为它可以运行短至 6 小时。对于这些平板，用琼脂糖代替<4%的灰琼脂（见 材料表），使NGM塞子上的干燥速度更慢、更均匀，并减少蠕虫挖洞以获得更好的回收率。 - 确保孔填充均匀且无气泡。使用设置为70°C的加热块（通过多孔板的塑料缓慢传热，NGM-琼脂糖只能加热到约55-60°C）以防止混合物在此过程中凝固。要去除孔内的气泡，请使用无菌火焰加热针头。
- 在倒置之前，让96孔板在无菌环境中在室温下凝固（盖子向下以防止冷凝），并在4°C下储存在干净的盒子中，直到需要为止。
- 通过向每个孔填充 125 μL NGM-琼脂糖（每次测定四个板）来制备 8 个 96 孔 NGM-琼脂糖板。
- 在第 11 天，检查步骤 3.2. 中的蠕虫，确保没有出现污染并且蠕虫仍然充满。
- 在第 12 天，检查步骤 3.1 中的蠕虫，确保没有出现污染并且蠕虫仍然充满。另外，检查蠕虫的发育阶段。
注意：蠕虫的性别/菌株和发育阶段，例如使用的L4或L4 + 24小时蠕虫，取决于蠕虫所接受的治疗。在这里，野生型雌雄同体暴露于L4的细菌分离物36小时。
4. 准备肠道微生物分离物集合以重新喂养蠕虫
- 从步骤2.1监测LB琼脂平板上的细菌生长。并继续在20°C下孵育。
注意：虽然它并不理想，但如果某些克隆没有生长或显示污染，可以将细菌从干净的库存中重新划线到6cm LB板上，并在25-28°C下生长24小时以准备实验。 - 为被测细菌集合定义96孔阵列布局，便于后续步骤中的系统板接种和数据分析（补充表1）。
- 从每个6cm细菌平板中收集细菌团块（步骤4.1.），并将其转移到含有1mL M9缓冲液的标记1.5 mL微量离心管中。通过使用一次性的2毫米直径的无菌塑料环或5毫米直径的金属环来执行此操作。通过浸入 100% 乙醇、燃烧并冷却 5 秒来对细菌菌株之间的金属环进行消毒。
- 涡旋微量离心管，直到细菌沉淀完全重悬（取决于细菌菌株，这可能需要~1-10秒）。
- 在室温下以 9，300 x g 旋转 5 分钟，除去 700 μL 上清液，并通过涡旋重悬细菌沉淀。
- 按照步骤 4.2 中规定的布局，将 200 μL 每种细菌悬浮液转移到空无菌 96 孔板的单个孔中。
- 使用该板，使用多通道移液管用10μL细菌溶液接种八个96孔NGM-琼脂糖板（在步骤3.3中制备），并在25°C下盖上盖子孵育24小时。不要密封板，以允许板干燥和细菌需氧生长，并避免过度冷凝。
- 密封步骤4.6中制备的96孔悬浮板。用干净的粘合剂密封膜（见 材料表），并在15°C下储存长达5天。这将根据需要用于蠕虫重新喂食。
5. LFASS热休克和氧化测定设置（第13-14天）
- 查看步骤3.5中的板，评估蠕虫的发育阶段。一旦 >90% 的蠕虫达到 L434，将蠕虫收集在 15 mL 锥形管中最多 10 mL 无菌 M9 溶液中。
- 通过在4°C下以142× g 旋转2分钟，除去上清液，并在每次洗涤之间加入10mL新鲜无菌M9以除去OP50细菌，广泛洗涤蠕虫（至少4倍）。将蠕虫颗粒重悬于 10 mL M9 中。
- 将 50 μL 蠕虫溶液转移到含有 950 μL M9 的低表面结合管（参见 材料表）中。轻轻混合试管内容物以避免蠕虫沉降后，快速使用湿润的低结合移液器吸头将 3-4 个单独的 10 μL 液滴转移到载玻片或 NGM 板上，并在体视显微镜下以 16 倍放大倍率（参见 材料表）计数蠕虫数量。平均3-4滴的计数，并确定蠕虫溶液中每微升的蠕虫数量（参见步骤3.1）。
- 调节 10 mL 管中的蠕虫浓度，以达到 8 μL 中的 ~120 个蠕虫。如果在步骤5.2中制备溶液。浓度不够，旋转蠕虫并相应地去除 M9，以达到每 120 μL 8 条蠕虫。
- 使用多通道移液管或重复移液管将 8 μL 蠕虫溶液（~120 个蠕虫）转移到步骤 4.7. 中的八个 96 孔 NGM-琼脂糖板的每个孔中。确保使用低保留吸头来限制蠕虫丢失。可能还需要切割尖端，以允许大型成虫限制成虫的机械应力。
注意：该测定需要至少 30 个活的健康蠕虫才能可靠地工作，但每孔约 100 个蠕虫效果最好。 - 将蠕虫和细菌接种的96孔NGM - 琼脂糖板在25°C孵育36小时。
- 在12-24小时之间检查板，确保蠕虫在整个过程中保持充满。如果需要重新喂食，将细菌重悬于步骤4.8.中储存在15°C的96孔细菌阵列板内，并将多达10μL相应的细菌溶液添加到96孔NGM-琼脂糖平板中，其中蠕虫在36小时潜伏期结束之前有饥饿的风险（饥饿的蠕虫会产生截然不同的结果， 所以这非常重要）。
注意：以下步骤需要在第 15 天进行。在开始测定之前，可能需要优化读数高度。最佳读数将在井底上方20-50μm处实现。这将取决于酶标仪的型号。有些提供Z扫描的可能性，而另一些则允许手动输入高度。在检测到最高蓝色荧光 （365 nm/430 nm） 信号的水平处设置最佳高度。一些酶标仪可能在针对贴壁细胞测定优化的固定高度下操作，可能不是LFASS测定的理想选择。 - 36小时后，将30μL的M9分配到96孔板的每个孔中。
注意：对于热应力测定，酶标仪需要达到执行测定所需的温度，并且可能需要提前打开。目前的协议使用42°C来最大化杀灭速度，但该方法适用于30°C以上的其他温度。 - 根据设置的布局，使用低保留吸头将蠕虫（约 20 μL）转移到 384 孔板中（考虑切断吸头的末端，以使大蠕虫减少成虫的机械应力）。
注意：对于本研究，此处描述的两种测定（热应力和氧化应激）使用两种不同的酶标仪设置，因此用于这两种测定的样品不得接种在同一384孔板中。 - 确保读数仪设置正确（表1）。
- 用更多的M9填充384孔板，目标是每孔的最终体积为60 μL。对于热应力测定，加入 40 μL M9，对于 t-BHP 诱导的氧化应激，在 6 μl t-BHP 中加入 34 μl M9（参见材料表）。
- 在添加t-BHP后2分钟内开始测定（理想情况下，所有蠕虫必须同时暴露于t-BHP，测定时间分辨率为2分钟）。如果不可能，请使用计时器估计在测定开始前移液t-BHP所花费的时间，以便以后调整中位死亡时间。
- 用透明盖子关闭盘子。用遮蔽胶带（胶带粘在板和盖子上）密封 384 孔板的边缘，确保胶带不会越过盖子或板下方。使用手术刀每隔一段时间在盖子和板之间切开胶带，以允许空气交换，同时最大限度地减少测定过程中的蒸发。
- 将板插入读板器（参见 材料表）并开始运行。目标是在365nm处激发，并在435nm处每2分钟检测一次发射，持续6-12小时（表1）。
注意：通常，6小时足以进行42°C热应激测定，8小时足以进行7%t-BHP氧化应激测定。
6. 酶标仪数据处理
- 将酶标仪中的原始荧光数据保存为逗号或制表符分隔的.txt、.csv或.xls/.xlsx格式，然后转换为xls /.xlsx格式。根据数据格式，重新组织它们以匹配 LFASS 分析所需的 Excel 工作表布局。按照参考文献 30 中提供的详细说明进行操作。
注意：虽然数据可以手动分析，对每个时间序列进行归一化并寻找死亡荧光达到半最大值的时间，但可以在运行LFASS例程30的Matlab中进行自动分析。 - 从 https://github.com/ABA80/LFASS 下载并安装 Matlab（版本 2014a 或更高版本）和 LFASS 软件包。请遵循其中提供的准则和注释。
注意： 图 1C 简要描述了该方法。运行LFASS例程需要Matlab。或者，可以将 Matlab 代码转换为 Oracle，但拟合函数除外，这是专有的。可以重写新的平滑和 sigmoid 函数，以便在完全开源的平台中使用。 - 在 LFASS 分析之间，将数据和结果移动到新位置，因为 LFASS 分析将处理数据文件夹中的所有文件并覆盖结果文件夹中的文件。
7. 数据检查
- 打开 excel 文件并根据 384 孔板上的孔位置标记行。 补充文件2 显示了为热休克测定生成的原始荧光数据的excel文件的示例。使用 384 孔板上的孔位置标记蠕虫和细菌菌株。
- 在 Matlab 分析之前，在 excel 中目视检查数据，绘制代表性孔随时间变化的荧光强度。根据所使用的酶标仪，数据可能会有噪点，但应显示清晰的峰值。特别：
- 确定一个荧光值，低于该值的峰与噪声不会有显著差异（在LFASS中设置这样的阈值将通过排除空孔来加快分析速度）。
- 注意荧光波动在上升之前减弱的最早时间点（动物可能会剧烈捶打长达30分钟，导致蓝色荧光读数快速波动）。
注意： 通过从曲线拟合窗口中排除这些早期时间点，可以改善峰值拟合。 - 请注意最小和最大荧光值预计下降的时间点（查看几个孔以确定这些范围），因为它们将用于曲线拟合。
- 检查孔之间荧光峰的振幅是否显着变化，在使用以下公式进一步分析之前对数据进行归一化：
归一化荧光孔n （t） = （荧光孔n [t] - 最小荧光孔 [Dt]） / （最大荧光孔 [Dt] - 最小荧光孔 [Dt]）
其中“n”是当前孔数，“t”是时间点，“Dt”是测定的一系列时间点。
8. LFASS数据处理
注：详情见 https://github.com/ABA80/LFASS 和参考文献30的补充材料。
- 在 LFASS 文件夹中创建两个子文件夹，一个用于要分析的数据，另一个用于结果，例如“我的数据”和“结果”。
- 数据检查后，将测定Excel数据文件复制到LFASS子文件夹“我的数据”中。
- 启动 MATLAB，导航到 LFASS 文件夹，在命令窗口中键入并运行 fitfolder （补充文件 3）。然后按照屏幕上的说明操作。
- 输入“fitfolder”后，系统会询问 excel 文件所在的文件夹的名称，例如“我的数据”。键入数据文件夹的名称（在本例中为“我的数据”）。
- 按照屏幕上的说明进行操作，提供请求的各种参数。
- 输入“2”作为当前协议中连续测量之间的时间间隔（指定此选项允许以分钟而不是时间点单位表示结果）。
注意：可以修改时间间隔以或多或少地执行荧光测量（以降低或增加时间分辨率），并且还取决于酶标仪的功能（即，对于无法执行足够快的测量的酶标仪，可能需要增加时间间隔）。确保始终将实验时间间隔与LFASS例程相匹配。 - 通过键入“0.95”（可以根据需要更改以改善拟合）来分配公差上限阈值，通过键入“0.05”（可以根据需要更改以改善拟合）来分配公差下限阈值以约束 Sigmoid 拟合。
注意：其他时间参数基于数据检查（步骤7.2）的用户注释。
- 输入“2”作为当前协议中连续测量之间的时间间隔（指定此选项允许以分钟而不是时间点单位表示结果）。
- 选择是否显示拟合和平滑曲线，方法是在出现提示时键入“y”表示“是”或键入“n”表示“否”。要目视检查收敛配合，请选择前者。
注意：后者对于可视化所有平滑数据很有用，但通常不会选择，因为它会生成太多弹出图。在此之后，Matlab 将执行 LFASS 例程，如果一次性处理多个 excel 文件，则可能需要 1-10 分钟。带有曲线的弹出窗口将根据步骤 8.6 中的选择出现。 补充文件 4A 显示了拟合曲线的示例。 - 选择是 （1） 分析标识为噪声的曲线，还是 （2） 使用 [y/n] 选项重新拟合不良的曲线。键入 y 进行批准，键入 n 表示拒绝。
注意： 建议批准重新拟合，尤其是在有许多拟合不良或未拟合的曲线的情况下。这将允许用户为屏幕上出现的每条曲线提供定制的曲线拟合参数，并且只要求 sigmoid 拟合的更早和更晚的边界。可以根据需要多次尝试。 - 分析数据后，关闭 Matlab 并打开 LFASS 文件夹。
- 单击 LFASS 子文件夹 我的结果，因为结果文件会自动保存为.txt结果文件夹中。
注意：Matlab 生成三个.txt文件：“批量拟合.txt”、“批处理和噪声拟合.txt”和“重新拟合.txt”。前两者被保存为预防措施，以防在改装过程中发生计算机崩溃或用户错误。包含最准确完整分析的文件是“重新拟.txt”。 - 使用Microsoft Excel打开文件 Refitted.txt 并另存为.xls以供进一步处理。 补充文件4B 显示了此类结果文件的示例。
注意：对于每个孔（按行组织），列中提供了三个值，这些值给出了蠕虫种群中位死亡时间的估计值：“原始”：报告在实验数据峰值的半最大值处相交的时间;“批量拟合”：报告在批量拟合曲线的半最大值处相交的时间;“改装”：报告在改装曲线的半峰相交的时间。 - 将文件保存为.xls格式作为副本保存在安全位置。如果不这样做，文件将在下次运行 LFASS 例程时被覆盖。
注意：然后可以进一步处理结果以进行图形或统计分析。
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Representative Results
LFASS 检测可同时对多种检测条件进行稳健、高通量和快速的筛查，例如筛查有助于抗逆和衰老的众多遗传和微生物群参数。实验只需 2-3 周即可获得包含多个测试条件的广泛数据集。L4 + 36 h成年野生型蠕虫种群在48个肠道微生物分离株上培养36 h后暴露于42 °C热应激和7%t-BHP诱导的氧化应激36 h。 该测定进行了四次，每种条件在每次测定中重复四次。在所有测试的条件下，热应力测定的中位死亡时间在40-130分钟之间变化，t-BHP诱导的氧化应激测定的中位死亡时间在90-240分钟之间变化。与氧化应激测定相比，成年早期热应激测定通常显示更一致的结果，日间和日内变异性更小，并且是后续寿命的更好预测因子30。以不同微生物饮食为食的蠕虫死亡中位时间的差异最终说明了肠道共生如何影响宿主的抗逆性。图 2 显示了布里斯托尔 N2 野生型蠕虫在两种感兴趣的肠道微生物群分离株和标准实验室菌株 OP50 上的 16 次生物学重复的典型结果。
图 2：在两种细菌分离株和对照菌株上生长的蠕虫的配对耐热/氧化应激测定的代表性结果。 （A）热应激测定。将野生型蠕虫喂食MYb11（卢里达假单胞菌）或MYb115（假单胞菌）细菌分离株或OP50对照细菌36小时。MYb11导致中位死亡时间明显较早（p < 0.001）。（B）氧化应激测定。在MYb11或MYb115细菌分离物或OP50对照细菌上喂食野生型蠕虫36小时。MYb11导致中位死亡时间显著提前（p < 0.05）。分四组样品分析120-150条蠕虫，每例实验一式四份进行。质量差/拟合数据不佳的井导致缺失值。箱线图表示表示单孔值、最小值、中值和最大值。*表示 p < 0.05 和 ***p < 0.001 时的统计显著性，具有单因子方差分析。请点击此处查看此图的大图。
| 一个 | |||
| 参数 | 设置 | 评论 | |
| 温度 | 25 °C | ||
| 荧光激发 | 365 纳米 | 10 nm 带宽 | |
| 荧光发射 | 430 纳米 | 20 nm 带宽 | |
| 闪光次数 | 8次闪光，1ms建立时间 | ||
| 获得 | 100 到 130 | 根据样品进行调整。在测定开始时瞄准 2-5 k 读取值 | |
| 滞后时间 | 1 微秒 | ||
| 积分时间 | 30 微秒 | ||
| 读取时间间隔 | 每2分钟一班 | 根据应力严重程度，可能需要调整持续时间和时间间隔（8小时在7%t-BHP下就足够了） | |
| 期间 | 8-12小时 | ||
| 读取方向 | 从下面 | ||
| B | |||
| 参数 | 设置 | 评论 | |
| 温度 | 42 °C | ||
| 荧光激发 | 365 纳米 | 10 nm 带宽 | |
| 荧光发射 | 430 纳米 | 20 nm 带宽 | |
| 闪光次数 | 8次闪光，1ms建立时间 | ||
| 获得 | 100 到 130 | 根据样品进行调整。在测定开始时瞄准 2-5 k 读取值 | |
| 滞后时间 | 1 微秒 | ||
| 积分时间 | 30 微秒 | ||
| 读取时间间隔 | 每2分钟一班 | 根据应力严重程度，可能需要调整持续时间和时间间隔（在42°C下6小时就足够了） | |
| 期间 | 6-12小时 | ||
| 读取方向 | 从下面 | ||
表1：氧化和热应激测定设置。 本研究中使用的荧光板读数仪上用于氧化（A）和热（B）应激测定的设置示例。
补充文件1：培养基、缓冲液和培养配方。 本研究中使用的不同培养基、缓冲液和培养物的组成。 请点击此处下载此文件。
补充文件2：从酶标仪导出并转换为excel.xls格式后的原始荧光数据。 （A） excel文件显示了热休克测定的原始荧光数据。原始荧光数据以2分钟时间间隔显示。（B）突出显示384孔板上带有“孔位置”的列，可用于标记蠕虫和细菌菌株。（C）该文件标有蠕虫和细菌菌株。 请点击此处下载此文件。
补充文件3：使用Matlab进行LFASS分析。 （A） 在 Matlab 中打开 LFASS 文件夹后，会弹出一个命令窗口。（B） 在命令窗口中键入“fitfolder”以启动程序，并指示包含要分析的文件的文件夹名称。（C）一旦程序找到用于分析的数据excel文件，用户必须按照屏幕上的说明进行操作，提供所需的各种参数。 请点击此处下载此文件。
补充文件4：使用Matlab分析LFASS数据。 （A） 通过 Matlab 分析拟合的曲线示例，其中黑线表示对应于较早时间边界的时间点，蓝线表示曲线拟合的较晚时间边界。拟合的 S 形曲线以红色显示。（B） Matlab 生成的结果文件以.xls格式打开。这些值以数字格式突出显示和显示。第二列提供原始数据曲线上的值首次超过最大值的 50% 的时间。第三列提供拟合曲线值等于最大值 50% 的时间，该时间在批量拟合分析期间确定。第四列提供了在批量分析和必要时进行最终重新拟合后，拟合曲线上的值等于最大值的 50% 的时间。因此，第四列应提供最可靠的结果。 请点击此处下载此文件。
补充表1：实验板布局示例。（A）96孔板布局，用于在两种不同的蠕虫菌株上测试47种不同的蠕虫肠道微生物群细菌分离株，活OP50用作对照。每次检测都需要该板的四个副本。（B）用于热或氧化应激测定的384孔布局，对应于（A）中先前的96孔板测定。此设置允许对每种条件执行四重奏，每个蠕虫菌株都有自己的 OP50 控制。 请按此下载此表格。
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Discussion
秀丽隐杆线虫由于其体积小、透明、显影速度快、寿命短、价格低廉且易于处理，在一次快速筛选多个实验参数方面具有许多优点。它的基因组、身体计划、神经系统、肠道和微生物组相当简单，但又复杂且与人类足够相似，使其成为一个强大的临床前模型，在测试生物活性功效或毒性时可以获得机制洞察力。随着人们对开发针对疾病8，9，34，35的微生物干预措施的兴趣日益浓厚，利用这种临床前模型快速研究益生菌是一个有吸引力的选择，微生物34在很大程度上尚未开发且近乎无限的治疗潜力。这里描述的方案适用于研究环境细菌对秀丽隐杆线虫健康的影响，但可以很容易地用于其他目的。
多面性
形成该管道的不同“模块”可以进行调整，以满足实验或实验室的特定要求。例如，细菌分离株可以替代细菌混合物、细菌突变体或产生RNAi的细菌，并且该装置可用于筛选参与宿主 - 微生物相互作用的细菌基因，筛选参与抗应激的宿主基因，或研究单个微生物作为定义细菌群落的一部分的影响。该方法描述了在单个蠕虫的遗传背景中筛选几种细菌分离株。然而，该测定是可扩展的，并且可以一次研究多种宿主和细菌基因型。这可以进一步与鉴别药物治疗和/或饮食方案相结合，以深入了解宿主基因 - 微生物基因 - 饮食相互作用。
该方案尚未在其他线虫物种上尝试，但它也应该直接适用于C. remanei和C. briggsae，并且可能适用于与秀丽隐杆线虫30共享形态，大小和死亡荧光特征的L3期寄生线虫物种。最后，其他应激源（胡桃酮、百草枯、砷酸盐、其他温度）可以在同一管道中使用，以提供补充或确认性信息。
潜在挑战
在测定之前，直到第12天培养蠕虫和细菌的时间投入是巨大的，但由于该方法的通量，它远远超过了收集数据的广度。然而，在规划此类检测时要小心，以避免通过重复制备步骤来浪费时间，因为在检测开始时材料是次优的。主要的早期问题包括样品污染（蠕虫或细菌），蠕虫种群同步不良以及材料耗尽（蠕虫种群比预期更快地吃掉食物，并且比计划更频繁地重新喂养或转移动物）。
避免污染
由于协议的规模和持续时间，一个主要的潜在问题是真菌和细菌的污染，它们的发生肯定会混淆结果。因此，理想的设置是使用无菌耗材在实验台上方没有直接气流的空调和空气过滤专用实验室空间。然而，遵守定期清洁程序（在工作前后对长凳进行净化、清洁板箱和使用无菌耗材）并在密闭空间（避开走廊、靠近敞开的门和窗户的空间）中用火焰工作通常足以保持清洁的环境。如果在步骤2.2.1.准备鸡蛋之前发生轻度污染，漂白程序将处理它们，并且方案可以按计划进行。相反，在转移到测试细菌平板之前影响不断增长的蠕虫种群的污染将意味着该尝试的结束，并且需要从步骤1重新启动协议。后期的污染往往会影响单个细菌菌株或测试条件。根据它们的程度，可能值得继续或重新启动协议。
蠕虫同步
由于蠕虫发育和生长时对热和氧化挑战的抵抗力发生变化，因此无法轻松比较在进行LFASS测定时导致不同发育阶段的测试条件。对于终点测定，必须产生同步良好的群体。由于测定是在L4或L4 + 48小时阶段批量收集的蠕虫上进行的，在没有蠕虫分选机或其他分选程序来收集完美分期的蠕虫的情况下，蠕虫种群必须在L1处非常同步。应确保在培养测试队列之前，将幼雏远离食物足够长的时间，以便所有活蛋孵化（20°C下>15小时，15°C下>18小时）。基因型可能会影响发育时间的传播，这也受温度的影响。在15°C下生长的蠕虫种群可以更好地控制这一点，同时限制蠕虫种群扩张阶段温度敏感突变的影响（特别是在使用胰岛素信号突变体时）。研究L4或L4 + 48小时微生物影响的主要原因是绕过不同饮食的发育影响，研究活肠道细菌的影响，而不是它们对饮食的影响。在不同细菌分离株或混合物上生长的早期幼虫阶段的蠕虫将不可避免地导致发育速度不均衡和失去同步性。
依赖蓝色荧光的后果
能够在LFASS测定中精确定位死亡，而无需单个蠕虫跟踪或额外的试剂，如Sytox green36，而是利用荧光范围内的内源性信号，不太可能与传统蠕虫生物标志物重叠，这是一个明显的好处。然而，确保在许多测试条件下能够一致地检测到蠕虫死亡荧光仍然至关重要。虽然该测定不依赖于荧光定量，而是依赖于其动力学，但蠕虫仍然需要发出足够的荧光来准确估计中位死亡时间（TOD）。由于该测定不允许解决单个蠕虫死亡，因此垂死个体发出的蓝色荧光爆发需要有足够的时间重叠以进行荧光积累，以产生单个群体荧光峰。只有这样，才能准确推断出中位数的TOD。这意味着无法产生足够水平的蓝色荧光的蠕虫不能用于该协议，其中特别包括犬尿氨酸途径的一些突变体，例如tdo-2和kynu-130，31，以及饥饿的动物。因此，重要的是要确保蠕虫始终保持饱满状态。在进行HT115驱动的RNAi筛选时，这可能是一个明显的问题，因为补充了IPTG和抗生素的NGM培养基上的HT115草坪往往比OP50草坪更薄。因此，在检测前几天监测蠕虫食物供应至关重要。
死亡荧光动力学的另一个结果是测定越快，灵敏度越高，因为来自同一种群的蠕虫将更同步地死亡并产生更明确的种群死亡荧光峰。因此，测定时间越长，产生良好的死亡荧光峰所需的群体大小就越大。新陈代谢低的突变体，如eat-2和daf-230，也会发出较少的荧光，并且每孔需要更高的数量。虽然每孔 10-15 个野生型蠕虫足以进行 42 °C 热应力测定，在 4 小时内杀死所有蠕虫，但在同一测定中，daf-2（e1370） 蠕虫需要几乎两倍的量，并且>100 个野生型蠕虫需要在 24 小时内杀死蠕虫。
在环境细菌分离株的背景下，不同的微生物代谢也可以不同地影响产生蓝色荧光化合物的犬尿氨酸途径。因此，一些细菌分离株导致较低的峰值死亡荧光，而另一些细菌分离株导致比OP50更高的峰。因此，人们需要瞄准每口井足够的蠕虫来适应所有可能发生的情况。
最后，正确优化板读数参数至关重要。该协议涵盖了荧光激发和发射参数的设置以及理想情况下应执行读数的深度。由于在一次测定中，在多种条件下的死亡荧光产量可能范围很广，因此确保检测到微弱信号但检测器永远不会饱和非常重要。因此，具有高动态范围的探测器的仪器将表现更好。
方法的局限性
这里描述的方法稳健而灵活，可以很容易地适应各种条件。为方便起见，在协议中提到了关键限制和限制。简而言之，依赖死亡荧光作为死亡的内源性标志物既是这些测定的优势，也是这些测定的局限性。
在有限数量的特定饮食条件（低色氨酸饮食或饥饿）和影响色氨酸代谢的突变条件下（即 tdo-2，kynu-1，一些 daf-2 等位基因），死亡荧光（DF）可能会强烈衰减，以至于难以检测到峰值荧光并且TOD估计不太可靠。
相反，一些微生物可能会产生蓝色荧光化合物，其激发和发射光谱与DF信号重叠（即 粪肠球菌）。虽然它们的动力学与DF不同，并且通常可以解耦，但它们可能会混淆分析。
接下来，测定依赖于来自垂死的单个蠕虫的信号的累积，但DF随着时间的推移而淬灭。因此，如果蠕虫死亡间隔太远，单个荧光峰将无法产生群体峰值，从而阻止测量群体中位数TOD。测定杀伤越慢，每孔所需的蠕虫数就越高30.因此，每孔10-15条成虫足以进行42°C热应激测定，在2小时内杀死一半的蠕虫，但对于在12小时内杀死一半蠕虫的细菌快速杀灭测定，每孔需要超过70个蠕虫。
最后，用户需要使用酶标仪来执行可以在所需波长下进行延时荧光测量的测定。激发和发射波长也可能在系统之间略有不同，并且在线虫种类之间也有所不同，如前所述30。
与其他秀丽隐杆线虫测定的比较和互补性
在过去的 10-15 年中，已经开发了许多检测方法来同时评估秀丽隐杆线虫在多种条件下的健康状况，采用多种策略并提供不同级别的数据深度和广度 30，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46.已经开发出几种强大的检测方法，使用具有多蠕虫跟踪算法和/或微加工单个蠕虫阵列的相机阵列和扫描仪，在其整个生命周期内同时自动监测固体培养基上的许多蠕虫37，38，39，40，41，43.在宿主-微生物相互作用的背景下，与上述协议类似的方法但不依赖于DF也使参与细菌感染的秀丽隐杆线虫基因的全基因组RNAi筛选成为可能46，47，48。然而，这些高通量测定依赖于在整个过程中处理液体中的蠕虫，这在一次处理多种细菌类型时是不可取的，因为交叉污染的风险增加，并且液体培养会影响宿主和微生物代谢。因此，在传统的感染、压力、健康寿命和寿命测定中，秀丽隐杆线虫在固体培养基上生长的细菌草坪上保持和老化。与此协议中的情况一样，使用此管道执行的屏幕结果可以更容易地与屏幕命中率的下游验证性实验相关并预测其结果。
LFASS方法本身的优点在参考文献30中得到了很好的介绍。与可以重新用于类似研究的更复杂的连续成像设置相比，LFASS更便宜（前提是中位数TOD是唯一需要的读数），其简单性意味着它不需要太多的技术能力或专业设备。LFASS主要是关于广度而不是深度。LFASS数据除了蠕虫种群的中位死亡时间和犬尿氨酸途径输出的间接读数外，不提供其他信息。相反，由于通量较低但仍然不错，可以在蠕虫的整个生命周期内从其他测定37，38，39，40，41，43中测量复杂的性状，使其成为研究LFASS筛选命中物的优秀下游方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢CGC明尼苏达州（美国麦迪逊，NIH - P40 OD010440）提供蠕虫菌株，并感谢OP50和Hinrich Schulenburg（CAU，德国基尔）提供此处描述的所有环境微生物分离株。这项工作由UKRI-BBSRC向AB提供的赠款（BB / S017127 / 1）资助。JM由兰开斯特大学FHM博士奖学金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm diameter plates (Non-vented) | Fisher Scientific | 10720052 | Venting is not necessary for bacterial cultures |
| 15 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 168381 | |
| 384-well black, transparent flat bottom plates | Corning | 3712 or 3762 | Not essential to be sterile for fast stress assays |
| 6 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 150288 | Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia |
| 96-well transparent plates (Biolite) | Thermo | 130188 | |
| Agar (<4% ash) | Sigma-Aldrich | 102218041 | Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
| Avanti Centrifuge J-26 XP | Beckman coulter | ||
| Bleach | Honeywell | 425044 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| LB agar | Difco | 240110 | |
| LB broth | Invitrogen | 12795084 | |
| LoBind tips | VWR | 732-1488 | Lo-bind reduce worm loss during transfers |
| LoBind tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M/1100/53 | |
| Plate reader- infinite M nano+ | Tecan | Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used | |
| Plate reader- Spark | Tecan | ||
| Potassium phosphate monobasic | Honeywell | P0662 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S/3160/63 | |
| Stereomicroscope setup with transillumination base | Leica | MZ6, or M80 | Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast |
| t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide) | Sigma-Aldrich | 458139 | |
| Transparent adhesive seals Nunc | Fisher Scientific | 101706871 | It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays. |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | 1278-7099 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422 |
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