Screening med høj kapacitet af mikrobielle isolater med indvirkning på Caenorhabditis elegans sundhed

Summary

Tarmmikrober kan positivt eller negativt påvirke deres værts sundhed via specifikke eller konserverede mekanismer. Caenorhabditis elegans er en bekvem platform til at screene for sådanne mikrober. Den nuværende protokol beskriver screening med høj kapacitet af 48 bakterieisolater for indvirkning på nematodestressresistens, der anvendes som en proxy for ormsundhed.

Abstract

Med sin lille størrelse, korte levetid og lette genetik tilbyder Caenorhabditis elegans en bekvem platform til at studere virkningen af mikrobielle isolater på værtsfysiologi. Det fluorescerer også i blåt, når det dør, hvilket giver et bekvemt middel til at lokalisere døden. Denne egenskab er blevet udnyttet til at udvikle high-throughput label-fri C. elegans overlevelse assays (LFASS). Disse involverer time-lapse fluorescensregistrering af ormepopulationer sat i multiwell-plader, hvorfra populationens mediantid for død kan udledes. Denne undersøgelse anvender LFASS-tilgangen til at screene flere mikrobielle isolater på én gang for virkningerne på C. elegans modtagelighed for svær varme og oxidative belastninger. En sådan mikrobiel screeningspipeline, som især kan bruges til at præscreene probiotika, ved hjælp af alvorlig stressresistens som en proxy for værtssundhed, rapporteres her. Protokollen beskriver, hvordan man dyrker både C. elegans tarmmikrobiota-isolatsamlinger og synkrone ormpopulationer i multiwell-arrays, før de kombineres til assays. Eksemplet dækker test af 47 bakterieisolater og en kontrolstamme på to ormestammer i to stressassays parallelt. Tilgangspipelinen er imidlertid let skalerbar og anvendelig til screening af mange andre modaliteter. Det giver således en alsidig opsætning til hurtigt at undersøge et multiparametrisk landskab af biologiske og biokemiske forhold, der påvirker C. elegans sundhed.

Introduction

Den menneskelige krop har anslået 10-100 billioner levende mikrobielle celler (bakterier, arkæa svampe), som primært findes i tarm-, hud- og slimhindemiljøerne¹. I en sund tilstand giver disse fordele for deres vært, herunder vitaminproduktion, modning af immunsystemet, stimulering af medfødte og adaptive immunresponser på patogener, regulering af fedtstofskifte, modulering af stressresponser og mere med indvirkning på vækst og udvikling, sygdomsdebut og aldring 2,3,4,5 . Tarmens mikrobiota udvikler sig også betydeligt gennem hele livet. Den mest drastiske udvikling forekommer i barndommen og den tidlige barndom⁶, men betydelige ændringer forekommer også med alderen, herunder et fald i overflod af Bifidobacterium og en stigning i Clostridium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae og Enterococcus arter⁷. Livsstil kan yderligere ændre tarmens mikrobielle sammensætning, hvilket fører til dysbiose (tab af gavnlige bakterier, overvækst af opportunistiske bakterier), hvilket resulterer i forskellige patologier såsom inflammatorisk tarmsygdom, diabetes og fedme⁵, men også bidrager til Alzheimers og Parkinsons sygdomme 8,9,10,11.

Denne erkendelse har kritisk bidraget til at forfine begrebet tarm-hjerneakse (GBA), hvor interaktioner mellem tarmfysiologi (nu inklusive mikroberne i den) og nervesystemet betragtes som den vigtigste regulator for dyremetabolisme og fysiologiske funktioner¹². Imidlertid er mikrobiotaens præcise rolle i tarm-hjerne-signalering og de tilhørende virkningsmekanismer langt fra fuldt ud forstået¹³. Da tarmmikrobiota er en vigtig determinant for sund aldring, er hvordan bakterier modulerer aldringsprocessen blevet genstand for intens forskning og kontrovers 6,14,15.

Med demonstrationen af, at rundorm Caenorhabditis elegans er vært for en bonafide tarmmikrobiota domineret - som i andre arter - af Bacteroidetes, Firmicutes og Actinobacteria 16,17,18,19,20, dens hurtige stigning som en eksperimentel platform til at studere vært-tarm kommensale interaktioner 21,22,23,24 ^,25,26 har udvidet vores efterforskningsarsenal betydeligt^26,27,28,29. Især kan eksperimentelle tilgange med høj kapacitet, der er tilgængelige for C. elegans til at studere gen-diæt, gen-lægemiddel, genpatogen osv. interaktioner, tilpasses til hurtigt at undersøge, hvordan bakterieisolater og cocktails påvirker C. elegans sundhed og aldring.

Den nuværende protokol beskriver en eksperimentel pipeline til straks at screene arrays af bakterielle isolater eller blandinger sat i multiwell plader for virkninger på C. elegans stressresistens som en proxy for sundhed, som kan bruges til at identificere probiotika. Den beskriver, hvordan man dyrker store ormepopulationer og håndterer bakterielle arrays i 96- og 384-brønds pladeformater, før orme behandles til automatiseret stressresistensanalyse ved hjælp af en fluorescenspladelæser (figur 1). Tilgangen er baseret på etiketfri automatiserede overlevelsesanalyser (LFASS)³⁰ , der udnytter fænomenet dødsfluorescens³¹, hvorved døende orme producerer et udbrud af blå fluorescens, der kan bruges til at lokalisere dødstidspunktet. Blå fluorescens udsendes af glucosylestere af anthranilsyre opbevaret i C. elegans tarmgranulat (en type lysosomrelateret organel), som brister, når en nekrotisk kaskade udløses i ormens tarm ved død³¹.

Figur 1: Eksperimentel arbejdsgang for high-throughput screening af bakterieisolater med indvirkning på C. elegans modstandsdygtighed over for stress . (A) Tidslinje for orm og bakteriel vedligeholdelse og assay opsætning. (B) 96-brønds bakteriel pladearray opsætning og håndtering. (C) opsætning af 384-brønds ormplade. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

De to C. elegans-stammer , der blev anvendt parallelt til denne undersøgelse, var Bristol N2 vildtype og HT1890: daf-16 (mgDf50), som vokser med lignende hastigheder. Protokollen kan dog replikeres med en hvilken som helst kombination af to stammer, der har lignende vækstrater. Bemærk, at når man tester andre stammer parallelt (for eksempel vildtype og langsomt voksende daf-2-mutanter ), skal forskellige vækstrater overvejes, og protokollen skal derfor justeres. Tidsskalaerne og mængderne af orme og bakterier i den følgende protokol er optimeret til parallel test af 48 bakterieisolater på to ormestammer i to LFASS-assays i tetraplicater. Der er behov for justeringer, hvis flere forhold skal testes parallelt. Escherichia coli OP50 bakteriestamme blev opnået fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC), University of Minnesota. De 48 bakterieisolater blev hentet fra Schulenburg-laboratoriet og vedligeholdt på LB-agar.

1. C. elegans dyrkning på OP50 (dag 1 - 8)

BEMÆRK: Den nuværende tilgang sigter mod at dyrke C. elegans hermafroditter på et fast medium på alle stadier og undgår unødvendige kostændringer (dvs. ved hjælp af alternative hurtigere voksende E. coli-stammer såsom NA22 eller rigere vækstmedier såsom ægplader) for at forblive så tæt som muligt på standardvækstbetingelserne^32,33, der stadig er meget udbredt. Ormens væksttemperatur (her fastsat til 15 °C) afhænger af den eller de anvendte C. elegans-stammer og kan være nødvendigt at justere (f.eks. for at undgå eller udløse ekspression af en temperaturfølsom fænotype eller biomarkør). For oplysninger om ormeopdræt, se henvisning³³.

1. Forbered otte NGM-plader med en diameter på 6 cm (10 ml nematodevækstmedieagar, NGM, supplerende fil 1)^32,33 pr. ormstamme, og lad dem tørre i 1 dag ved stuetemperatur.
2. Forbered en mættet flydende kultur af E. coli OP50 bakterier ved at så en enkelt bakterieklon fra en friskvokset Lysogeny Broth agar (LB agar, Supplementary File 1) plade i 25 ml OP50 medium (supplerende fil 1) i et 50 ml konisk rør. Dyrk kulturen natten over ved 37 °C i en shaker-inkubator.
3. De otte 6 cm NGM-plader pr. stamme podes med 100 μL mættet flydende kultur af E. coli OP50 pr. plade, og pladerne opbevares ved 20 °C i 2 dage før brug.
4. Brug en skalpel til at skære og overføre en firkantet agarklump på 0,5 cm med orme fra en nyligt udsultet NGM-plade på hver af de otte podede 6 cm NGM-plader og inkubere disse plader ved 20 ° C i 3 dage (eller indtil ormene er færdige med maden).
5. Forbered fem 15 cm NGM-plader pr. ormstamme (30 ml NGM-medium pr. plade) og pod med 3 ml OP50. Pladerne tørres, inden de inkuberes ved 37 °C natten over. Pladerne opbevares ved 20 °C, indtil de anvendes i senere trin.
6. Ved hjælp af en P-1000 pipette tilsættes op til 3 ml steril M9-buffer (supplerende fil 1) til 6 cm NGM-pladerne (trin 1.1.) for at resuspendere ormene og opsamle ormeopløsningen fra alle otte plader pr. stamme i et enkelt konisk rør på 15 ml.
   1. Centrifuge ved 142 x g i 2 minutter ved 4 °C. Fjern forsigtigt supernatanten ved hjælp af en P-5000 pipette eller en vandpumpe udstyret med en steril Pasteur-pipette eller spids. Tilsæt 10 ml steril M9-buffer for at vaske ormpillen. Gentag 2x.
   2. Fjern supernatanten (så meget som muligt) og overfør ormene til en 15 cm OP50 podet NGM-plade (trin 1.5.) ved hjælp af en pipette. Tilsæt 0,5 ml koncentreret OP50-kultur.
   3. For at fremstille koncentreret OP50 podes hver af fire 1 L flasker LB med 2 ml OP50 startkultur (tilberedt i trin 1.2.) og vokser i en rystende inkubator i 6 timer ved 37 ° C og 160 x g. Pellet bakterierne ved 3057 x g og 20 °C i 15 min. Kassér supernatanten, suspender bakteriepillerne med 6 ml OP50-medium, og opsaml i et sterilt 50 ml konisk rør.
      BEMÆRK: Bakterier kan opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.
7. Hver ormstamme vokser på en NGM-plade med en diameter på 15 cm i 3-4 dage ved 15 °C ved at fodre ormene igen med 0,5 ml koncentreret OP50 dagligt.
   1. Når ormene næsten er færdige med maden, opsamles og vaskes i M9-buffer (trin 1.6.1.), overføres hver ormestammekultur til to 15 cm NGM-plader (trin 1.5.) og formerer orme ved 20 ° C, indtil ~ 95% af befolkningen er gravide voksne (det tager ca. 24 timer for vildtype Bristol N2).
      BEMÆRK: Gravide voksne er kendetegnet ved tilstedeværelsen af æg i ormen, og den ideelle plade skal også have en overflod af uafsluttede æg lagt på pladen uden for mange larver³³.

2. Vedligeholdelse af tarmmikrobiotaisolatsamlinger (dag 9)

1. Stribe de 48 bakterieisolater på individuelle 6 cm LB agarplader og voks i 48 timer ved 20 °C.
   BEMÆRK: Bakterier kan dyrkes ved 25 ° C i 24-36 timer, hvis det er nødvendigt tidligere, men den længere 20 ° C vækst giver mulighed for at spotte potentielle forurenende stoffer.
2. Synkroniser et stort antal C. elegans.
   1. Blæd voksne orme ved at følge standardægforberedelsesmetoden³³ og overfør æggene på to useedede 15 cm NGM-plader i 24 timer ved 15 °C for at give alle L1-larverne mulighed for at klække og vokse synkront i de efterfølgende trin.
      FORSIGTIG: Vær forsigtig, når du håndterer blegemiddelopløsninger.

3. Dyrkning af store C. elegans-kulturer (dag 10)

1. Når L1-larverne er klækket, samles L1-larverne (fra trin 2.2.1.) i 3-4 ml M9 i et rent konisk 15 ml rør. Pipetter fire 10 μL dråber ormeopløsning på et dias eller en plade, og tæl antallet af orme i hver dråbe under et stereomikroskop ved 16x forstørrelse. Bestem ormkoncentrationen af opløsningen ved at gennemsnit antallet af larver fra alle dråber ormopløsning. Multiplicer denne værdi med det volumen, der er tilbage, og anslå det samlede antal orme for hver stamme.
   BEMÆRK: 46.000-50.000 L1 larver pr. stamme kræves på dette stadium for senere at fylde en 384-brøndplade eller to halvplader.
   1. For hver stamme overføres alle L1-larverne til to 15 cm NGM-plader (23.000-25.000 L1 pr. plade), der tidligere er podet med 3 ml OP50 (trin 1.5.) og gensået med 0,5 ml koncentreret OP50.
2. Inkuberes ved 15 °C og fyldes op med 0,5 ml koncentreret OP50 dagligt efter behov, indtil ormene når L4-trinnet.
   BEMÆRK: L4-trinnet er kendetegnet ved en lidt mørkere tarm og en halvskive- eller halvmåneformet hvid plet, hvor vulva til sidst vil danne^32,33.
3. Forbered 96-brønd NGM-agarose plader ved at følge nedenstående trin.
   1. Der fremstilles otte NGM-agaroseplader med 96 brønde ved at fylde hver brønd med 125 μL NGM-agarose (fire plader pr. analyse).
      BEMÆRK: Det anbefales at plade nogle ekstra plader, hvis nogle bliver forurenet i de efterfølgende trin. To pladelæsere vil være forpligtet til at køre assays parallelt, men de kan også køres successivt startende med varmespændingsanalysen, da den kan køres i så lidt som 6 timer. For disse plader erstattes <4% askeagar med agarose (se Materialetabel), hvilket muliggør langsommere og mere jævn tørring på tværs af NGM-stikkene og reducerer ormegravning for bedre genopretning.
   2. Sørg for, at brøndene er fyldt jævnt og boblefrit. Brug en varmeblok, der er indstillet til 70 °C (med langsom varmeoverførsel gennem multiwellpladens plast kan NGM-agarosen kun opvarme op til ca. 55-60 °C) for at forhindre blandingen i at størkne under processen. For at fjerne bobler i brønde skal du bruge en steril flammeopvarmet nål.
   3. Lad pladerne med 96 brønde indstilles ved stuetemperatur i et sterilt miljø, før de vendes om (låget er nedad for at forhindre kondens), og opbevares ved 4 °C i en ren kasse, indtil det er nødvendigt.
4. På dag 11 skal du kontrollere ormene fra trin 3.2., og sørg for, at der ikke er opstået forureninger, og ormene stadig er fyldte.
5. På dag 12 skal du kontrollere ormene fra trin 3.1. og sikre, at der ikke er opstået forureninger, og ormene stadig er fyldte. Kontroller også ormenes udviklingsstadium.
   BEMÆRK: Ormens køn/stamme og udviklingstrin, såsom L4 eller L4 + 24 timers orm, er afhængige af de behandlinger, ormene udsættes for. Her blev vildtype hermafroditter udsat for bakterieisolater fra L4 i 36 timer.

4. Forberedelse af tarmmikrobiotaisolatsamlinger til genfodring af orme

1. Overvåg bakterievækst på LB-agarpladerne fra trin 2.1. og fortsætte med at inkubere ved 20 °C.
   BEMÆRK: Selvom det ikke er ideelt, hvis nogle kloner ikke vokser eller afslører forureninger, kan bakterier stribes fra rene lagre på 6 cm LB-plader og dyrkes ved 25-28 ° C i 24 timer for at være klar til eksperimentet.
2. Definer et 96-brønds array-layout for den bakteriesamling, der testes, hvilket letter systematisk pladesåning og dataanalyse i de efterfølgende trin (supplerende tabel 1).
3. Opsamling af bakteriemassen fra hver 6 cm bakterieplade (trin 4.1.), og overfør den til et mærket 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml M9-buffer. Udfør dette ved hjælp af enten en steril plastsløjfe med en diameter på 2 mm til 2 mm eller en metalsløjfe med en diameter på 5 mm. Steriliser metalsløjfen mellem bakteriestammer ved at dyppe i 100% ethanol, flamme og køle ned i 5 s.
4. Hvirvel mikrocentrifugerørene, indtil bakteriepellets er fuldt resuspensuspenderet (afhængigt af bakteriestammen kan dette tage ~ 1-10 s).
5. Drej ned ved 9.300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, fjern 700 μL supernatant, og suspender bakteriepelleten ved hvirvelstrøm.
6. 200 μL af hver bakteriel suspension overføres til en enkelt brønd i en tom steril 96-brøndplade i henhold til layoutet i trin 4.2.
7. Fra denne plade podes otte NGM-agaroseplader med 96 brønde (fremstillet i trin 3.3.) med 10 μL bakterieopløsning ved hjælp af en flerkanalspipette og inkuberes med låget på ved 25 °C i 24 timer. Forsegl ikke pladerne for at muliggøre pladetørring og bakteriel aerob vækst og for at undgå overskydende kondens.
8. Forsegl 96-brønds ophængspladen, der er fremstillet i trin 4.6. med ren klæbende tætningsfilm (se Materialetabel), og opbevares ved 15 °C i op til 5 dage. Dette vil blive brugt til orm genfodring efter behov.

5. Opsætning af LFASS-varmechok og oxidativt assay (dag 13 - 14)

1. Ser man på pladerne fra trin 3.5., skal du vurdere ormenes udviklingsstadium. Når >90% af ormene har nået L4³⁴, samles ormene i op til 10 ml steril M9-opløsning i 15 ml koniske rør.
2. Vask ormene grundigt (mindst 4x) ved at spinde ned ved 142 x g i 2 minutter ved 4 °C, fjerne supernatanten og tilføje 10 ml frisk steril M9 mellem hver vask for at slippe af med OP50-bakterier. Resuspender ormpelleten i 10 ml M9.
3. Der overføres 50 μL ormeopløsning til et lavt overfladebindingsrør (se Materialetabel) indeholdende 950 μL M9. Efter forsigtig blanding af rørindholdet for at undgå ormsedimentering skal du hurtigt bruge en befugtet lavbundet pipettespids til at overføre 3-4 separate 10 μL dråber til et glasglas eller en NGM-plade og tælle ormnumre under et stereomikroskop (se Materialetabel) ved 16x forstørrelse. Gennemsnit tællingerne fra de 3-4 dråber og bestem antallet af orme pr. mikroliter i ormopløsningen (se trin 3.1.).
4. Juster ormkoncentrationen i 10 ml røret for at nå ~ 120 orme i 8 μL. Hvis opløsningen fremstillet i trin 5.2. ikke er koncentreret nok, drej ormene ned og fjern M9 i overensstemmelse hermed for at nå 120 orme pr. 8 μL.
5. Der overføres 8 μL ormeopløsning (~120 orme) til hver af brøndene i de otte NGM-agaroseplader med 96 brønde fra trin 4.7 ved hjælp af en flerkanalspipet eller en gentagelsespipet. Sørg for at bruge tip til lav tilbageholdelse for at begrænse ormtab. Det kan også være nødvendigt at skære spidsenderne for at give mulighed for store voksne orme for at begrænse mekanisk belastning på voksne orme.
   BEMÆRK: Analysen kræver mindst 30 levende sunde orme for at fungere pålideligt, men fungerer bedst med ca. 100 orme pr. Brønd.
6. Ormen og bakteriefrøede NGM-agaroseplader med 96 brønde inkuberes ved 25 °C i 36 timer.
7. Kontroller pladerne mellem 12-24 timer, og sørg for, at ormene forbliver fyldte hele vejen igennem. Hvis genfodring er påkrævet, suspenderes bakterierne inden for den 96-brønds bakterielle arrayplade, der er opbevaret ved 15 °C i trin 4.8., og der tilsættes op til 10 μL af den tilsvarende bakterieopløsning til NGM-agarosepladerne med 96 brønde, hvor orme risikerer at sulte inden udgangen af inkubationsperioden på 36 timer (udsultede orme vil give meget forskellige resultater, så dette er meget vigtigt).
   BEMÆRK: Følgende trin skal udføres på dag 15. Før analysen påbegyndes, kan det være nødvendigt at optimere læsehøjden. Den optimale aflæsning opnås 20-50 μm over bunden af brønden. Dette afhænger af modellen af pladelæseren. Nogle giver mulighed for en Z-scanning, mens andre tillader manuel højdeindgang. Indstil den optimale højde på det niveau, hvor det højeste blå fluorescenssignal (365 nm/430 nm) detekteres. Nogle pladelæsere fungerer muligvis i en fast højde, der er optimeret til klæbende celleassays og er muligvis ikke ideelle til LFASS-assays.
8. Efter 36 timer dispenseres 30 μL M9 i hver brønd på 96-brøndspladen.
   BEMÆRK: For termiske spændingsanalyser skal pladelæseren have nået den krævede temperatur for at udføre analysen og skal muligvis tændes på forhånd. Den nuværende protokol bruger 42 °C til at maksimere aflivningshastigheden, men fremgangsmåden gælder for andre temperaturer over 30 °C.
9. Overfør orme (ca. 20 μL) til 384-brøndpladen i henhold til sætlayouter ved hjælp af spidser med lav tilbageholdelse (overvej at afskære enden af spidserne for at give store orme mulighed for at reducere mekanisk belastning for voksne orme).
   BEMÆRK: Til denne undersøgelse anvendes to forskellige pladelæserindstillinger til de to analyser, der er beskrevet her (termisk stress og oxidativ stress), og derfor må prøver beregnet til disse to assays ikke belægges i den samme 384-brøndplade.
10. Sørg for, at pladelæserne er indstillet korrekt (tabel 1).
11. Fyld pladerne med 384 brønde op med mere M9, der sigter mod et slutvolumen på 60 μL pr. brønd. Til termisk spændingsassay tilsættes 40 μL M9, og for t-BHP-induceret oxidativ stress tilsættes 34 μl M9 i 6 μl t-BHP (se Materialetabel).
    1. Start analysen inden for 2 minutter efter tilføjelse af t-BHP (ideelt set skal alle orme udsættes for t-BHP samtidigt, idet analysetidsopløsningen er 2 min). Hvis det ikke er muligt, skal du bruge en timer til at estimere den tid, der bruges på at pipettere t-BHP før starten af analysen for at muliggøre senere justering af mediantidspunktet for døden.
12. Luk pladerne med deres gennemsigtige låg. Forsegl kanterne på 384-brøndspladerne med maskeringstape (tape over pladen og låget), og sørg for, at båndet ikke går over låget eller under pladen. Skær båndet mellem låg og plade med mellemrum ved hjælp af en skalpel for at tillade luftudveksling, samtidig med at fordampningen minimeres under analysen.
13. Indsæt pladen i pladelæseren (se Materialetabel), og start kørslen. Målet er at begejstre ved 365 nm og detektere emission ved 435 nm hvert 2. minut i 6-12 timer (tabel 1).
    BEMÆRK: Typisk er 6 timer nok til 42 ° C varmespændingsassays og 8 timer til 7% t-BHP oxidative stressassays.

6. Håndtering af pladelæserdata

1. Gem de rå fluorescensdata fra pladelæseren som komma- eller tabulatorseparerede .txt-, .csv- eller .xls /.xlsx-formater, og konverter derefter til xls /.xlsx-format. Afhængigt af dataformatet skal du omorganisere dem, så de svarer til det excel-arklayout, der er nødvendigt for LFASS-analyse. Følg de detaljerede instruktioner i reference³⁰.
   BEMÆRK: Mens data kan analyseres manuelt, normalisere hver tidsserie og lede efter det tidspunkt, hvor dødsfluorescens når det halve maksimum, kan automatiseret analyse udføres i Matlab, der kører LFASS-rutinen³⁰.
2. Download og installer Matlab (version 2014a eller nyere) og LFASS-softwarepakken fra https://github.com/ABA80/LFASS. Følg retningslinjerne og kommentarerne i den.
   BEMÆRK: Figur 1C giver en kort beskrivelse af fremgangsmåden. Matlab er forpligtet til at køre LFASS-rutinen. Alternativt kan Matlab-koden oversættes til Oracle, bortset fra tilpasningsfunktionen, som er proprietær. Nye udjævnings- og sigmoidfunktioner kan omskrives for at muliggøre brug i en fuldt open source-platform.
3. Mellem LFASS-analyser skal du flytte data og resultater til en ny placering, da LFASS-analysen behandler alle filer i datamappen og overskriver filer i mappen Resultater.

7. Inspektion af data

1. Åbn excel-filen, og mærk rækkerne i henhold til brøndpositionen på 384-brøndpladen. Supplerende fil 2 viser et eksempel på excel-filen af de rå fluorescensdata, der genereres til varmechokanalysen. Brug brøndpositionen på 384-brøndpladen til at mærke ormen og bakteriestammerne.
2. Forud for Matlab-analyse skal du visuelt inspicere dataene i excel og plotte fluorescensintensitet over tid for en repræsentativ brønd. Afhængigt af den anvendte pladelæser kan data være støjende, men bør vise en klar top. Navnlig gælder følgende:
   1. Bestem en fluorescensværdi, under hvilken en top ikke ville være signifikant forskellig fra støj (indstilling af en sådan tærskel i LFASS vil fremskynde analysen ved at udelukke tomme brønde).
   2. Bemærk det tidligste tidspunkt, hvor fluorescensudsving dæmpes før stigning (dyr kan slå kraftigt i op til 30 minutter, hvilket fører til hurtige svingende blå fluorescensaflæsninger).
      BEMÆRK: Toptilpasningen kan forbedres ved at udelukke disse tidlige tidspunkter fra kurvetilpasningsvinduet.
   3. Bemærk de tidspunkter, mellem hvilke minimale og maksimale fluorescensværdier forventes at falde (se på flere brønde for at identificere disse intervaller), da de vil blive brugt til kurvetilpasning.
   4. Kontroller, om amplituderne af fluorescenstoppene varierer betydeligt mellem brøndene, normaliser dataene inden yderligere analyse ved hjælp af følgende formel:
      Normaliseret fluorescensbrønd n (t) = (Fluorescensbrønd_n [t] - minimum fluorescensbrønd [Dt]) / (maksimal fluorescensbrønd [Dt] - minimum fluorescensbrønd [Dt])
      hvor "n" er det aktuelle brøndtal, "t" er tidspunktet, og "Dt" er rækken af tidspunkter for analysen.

8. LFASS databehandling

BEMÆRK: Nærmere oplysninger findes på https://github.com/ABA80/LFASS og i det supplerende materiale i reference³⁰.

1. Opret to undermapper i LFASS-mappen, en til de data, der skal analyseres, og en til resultater, for eksempel "mine data" og "resultater".
2. Kopier analysen excel-datafilen til LFASS-undermappen "mine data" efter datainspektion.
3. Start MATLAB, naviger til LFASS-mappen , skriv og kør fitfolder i kommandovinduet (Supplerende fil 3). Følg derefter instruktionerne på skærmen.
4. Efter at have skrevet "fitfolder" beder systemet om navnet på den mappe, hvor Excel-filen er placeret, for eksempel 'mine data'. Indtast navnet på din datamappe (i dette eksempel "mine data").
5. Følg instruktionerne på skærmen med angivelse af de forskellige parametre, der anmodes om.
   1. Indtast "2" for tidsintervallet mellem successive målinger i den aktuelle protokol (hvis du angiver dette, kan resultaterne udtrykkes i minutter i stedet for timepointenheder).
      BEMÆRK: Tidsintervallet kan ændres til at udføre fluorescensmålinger mere eller mindre hyppigt (for at reducere eller øge tidsopløsningen) og også afhængigt af pladelæserens egenskaber (dvs. tidsintervallet skal muligvis øges for pladelæsere, der ikke kan udføre hurtige nok målinger). Sørg for altid at matche det eksperimentelle tidsinterval med LFASS-rutinen.
   2. Tildel den øvre tolerancetærskel ved at skrive "0,95" (dette kan ændres efter behov for at forbedre pasformen) og den nedre tolerancetærskel ved at skrive "0,05" (dette kan ændres efter behov for at forbedre pasformen) for at begrænse sigmoid-pasformen.
      BEMÆRK: Andre tidsparametre er baseret på brugernoter fra datainspektionen (trin 7.2.).
6. Vælg, om der skal vises eller ikke monterede og udglattede kurver ved at skrive "y" for JA eller "n" for NEJ, når du bliver bedt om det. For visuelt at inspicere de konvergerende pasformer skal du vælge førstnævnte.
   BEMÆRK: Sidstnævnte er nyttigt til at visualisere alle udjævnede data, men vælges normalt ikke, fordi det genererer for mange pop op-grafer. Herefter udfører Matlab LFASS-rutinen, som kan tage 1-10 minutter, hvis flere Excel-filer behandles på én gang. Pop-up-vinduer med kurver vises i henhold til valget i trin 8.6. Supplerende fil 4A viser et eksempel på en monteret kurve.
7. Vælg, om du vil (1) analysere kurver identificeret som støj eller (2) ombygge dårligt monterede kurver med en [y/n] mulighed. Skriv y for at godkende og n for at afvise.
   BEMÆRK: Det anbefales at godkende ombygning, især hvis der er mange dårligt monterede eller umonterede kurver. Dette giver brugeren mulighed for at levere skræddersyede kurvetilpasningsparametre for hver kurve, når de vises på skærmen, og kun bede om tidligere og senere grænser for sigmoid-tilpasningen. Det kan forsøges så mange gange som nødvendigt.
8. Når dataene er analyseret, skal du lukke Matlab og åbne LFASS-mappen .
9. Klik på LFASS-undermappen Mine resultater, da resultatfilerne gemmes automatisk i mappen Resultater som .txt.
   BEMÆRK: Matlab genererer tre .txt-filer: "Batch-fitted.txt", "Batch and noise-fitted.txt" og "Refitted.txt". De to førstnævnte gemmes som en forholdsregel i tilfælde af et computernedbrud eller brugerfejl under ombygningen. Filen, der indeholder den mest nøjagtige komplette analyse, er "Refitted.txt".
10. Åbn filen Refitted.txt med Microsoft Excel, og gem som .xls til videre behandling. Supplerende fil 4B viser et eksempel på en sådan resultatfil.
    BEMÆRK: For hver brønd (organiseret i rækker) er der angivet tre værdier i kolonnerne, der giver estimater af mediantiden for ormpopulationens død: "Rå": rapporterer tiden, der skærer ved halvmaksimum af den eksperimentelle datatop; "Batchmonteret": angiver, hvor længe skæringstiden er halvt så stor som den batchmonterede kurve "Ombygget": rapporterer tiden til at krydse ved halvmaksimum af den ombyggede kurve.
11. Gem filen i .xls format som en kopi på et sikkert sted. Hvis du ikke gør dette, risikerer du, at filerne overskrives under den næste kørsel af LFASS-rutinen.
    BEMÆRK: Resultaterne kan derefter behandles yderligere til graftegning eller statistisk analyse.

Representative Results

LFASS-assays giver robust, høj gennemstrømning og hurtig screening af flere testbetingelser på én gang, såsom screening af adskillige genetiske og mikrobiotaparametre, der bidrager til stressresistens og aldring. Det tager kun 2-3 uger for eksperimentet at erhverve et omfattende datasæt med flere testbetingelser. L4 + 36 h voksne vildtype ormpopulationer blev udsat for 42 ° C termisk stress og 7% t-BHP-induceret oxidativ stress efter en 36 timers kultur på 48 tarmmikrobielle isolater i 36 timer. Analysen blev udført fire gange, hvor hver tilstand replikeres fire gange i hvert assay. På tværs af alle de testede betingelser varierede mediantiden for døden mellem 40-130 minutter for det termiske stressassay og mellem 90-240 minutter for det t-BHP-inducerede oxidative stressassay. Termiske stressassays i tidlig voksenalder viser normalt mere konsistente resultater og mindre variation mellem dage og intradag end oxidative stressassays og er bedre forudsigere for efterfølgende levetid³⁰. Forskellen i mediantiden for død af orme fodret med forskellige mikrobielle diæter eksemplificerer endegyldigt, hvordan tarmkommenaler påvirker værtsstressresistens. Figur 2 viser typiske resultater fra 16 biologiske replikater for Bristol N2 vildtypeorme på to tarmmikrobiotaisolater af interesse og standardlaboratoriestammen E. coli OP50.

Figur 2: Repræsentative resultater fra parrede varme/oxidative stressresistensassays fra orme dyrket på to bakterieisolater og en kontrolstamme . (A) Analyse af varmestress. Vildtypeorme blev fodret i 36 timer på enten MYb11 (Pseudomonas lurida) eller MYb115 (Pseudomonassp.) bakterieisolater eller OP50-kontrolbakterier. MYb11 førte til en signifikant tidligere mediantid for død (p < 0,001). (B) Oxidativ stressanalyse. Vildtype orme blev fodret i 36 timer på enten MYb11 eller MYb115 bakterieisolater eller OP50 kontrolbakterier. MYb11 førte til en signifikant tidligere mediantid for død (p < 0,05). 120-150 orme blev analyseret i fire sæt prøver, og hvert eksperiment blev udført i quadruplicate. Brønde med dårlig kvalitet / dårligt tilpassede data førte til manglende værdier. Boksplotrepræsentationer angiver enkeltbrøndværdier, minimum-, median- og maksimumværdier. *Angiver statistisk signifikans ved p < 0,05 og ***p < 0,001 med envejs ANOVA. Klik her for at se en større version af denne figur.

En
Parameter	Indstilling	Kommentar
Temperatur	25 °C
Fluorescens excitation	365 Nm	10 nm båndbredde
Fluorescensemission	430 nm	20 nm båndbredde
Antal blink	8 blink, 1 ms afregningstid
Vinde	100 til 130	Justeres afhængigt af prøven. Sigt efter 2-5 k læseværdi ved starten af analysen
Forsinkelsestid	1 μs
Integrationstid	30 μs
Læs tidsinterval	Hvert 2. minut	Afhængigt af stressens sværhedsgrad kan varighed og tidsinterval muligvis justeres (8 timer er nok ved 7% t-BHP)
Varighed	8-12 timer
Læs vejledning	Nedefra
B
Parameter	Indstilling	Kommentar
Temperatur	42 °C
Fluorescens excitation	365 Nm	10 nm båndbredde
Fluorescensemission	430 nm	20 nm båndbredde
Antal blink	8 blink, 1 ms afregningstid
Vinde	100 til 130	Justeres afhængigt af prøven. Sigt efter 2-5 k læseværdi ved starten af analysen
Forsinkelsestid	1 μs
Integrationstid	30 μs
Læs tidsinterval	Hvert 2. minut	Afhængigt af stressens sværhedsgrad kan det være nødvendigt at justere varigheden og tidsintervallet (6 timer er nok ved 42 °C)
Varighed	6-12 timer
Læs vejledning	Nedefra

Tabel 1: Indstillinger for oxidativ og varmestressanalyse. Eksempler på indstillinger, der anvendes til oxidative (A) og varme (B) stressassays på fluorescenspladelæserne, der anvendes i denne undersøgelse.

Supplerende fil 1: Medie-, buffer- og kulturopskrifter. Sammensætning af forskellige medier, buffere og kulturer, der anvendes i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Rå fluorescensdata fra pladelæseren efter eksport og konvertering til excel .xls format. (A) Excel-filen viser de rå fluorescensdata for et varmechokassay. Rå fluorescensdata vises med 2 minutters tidsinterval. (B) Kolonnen med "brøndposition" på 384-brøndspladen er fremhævet, som kan bruges til at mærke ormen og bakteriestammerne. (C) Filen er mærket med orm og bakteriestammer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: LFASS-analyse ved hjælp af Matlab. (A) Efter åbning af LFASS-mappen i Matlab vises et kommandovindue. (B) "fitfolder" skrives i kommandovinduet for at starte programmet, og mappens navn med den fil, der skal analyseres, er angivet. (C) Når programmet finder data excel-filen til analyse, skal brugeren følge instruktionerne på skærmen med angivelse af de forskellige parametre, der anmodes om. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: Analyserede LFASS-data ved hjælp af Matlab. (A) Et eksempel på en kurve monteret gennem Matlab-analyse, hvor den sorte linje angiver det tidspunkt, der svarer til den tidligere tidsgrænse, og den blå linje den senere tidsgrænse for kurvetilpasningen. Den monterede sigmoidkurve vises med rødt. (B) Resultatfilen genereret af Matlab åbnes i .xls format. Værdierne fremhæves og vises i talformat. Den anden kolonne angiver det tidspunkt, hvor værdien på rådatakurven først overstiger 50 % af maksimumværdien. Den tredje kolonne angiver det tidspunkt, hvor den tilpassede kurves værdi er lig med 50 % af den maksimale værdi, som bestemt under batchtilpasningsanalysen. Fjerde kolonne angiver det tidspunkt, hvor værdien på den monterede kurve er lig med 50% af maksimumsværdien efter batchanalyse og om nødvendigt endelig ombygning. Den fjerde kolonne skal således give det mest pålidelige resultat. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 1: Eksempel på eksperimentelle pladelayouter. (A) 96-brønds pladelayout til test af 47 forskellige ormetarmmikrobiotabakterieisolater på to separate ormestammer, hvor levende OP50 anvendes som kontrol. Fire kopier af denne plade er påkrævet for hvert assay, der køres. (B) 384-brøndslayout for varme- eller oxidative spændingsassays, svarende til det tidligere 96-brønds pladeassay i (A). Denne opsætning gør det muligt at udføre tetraplikater for hver tilstand, hvor hver ormstamme har sin egen OP50-kontrol. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

C. elegans tilbyder mange fordele ved hurtig screening af flere eksperimentelle parametre på én gang på grund af dens lille størrelse, gennemsigtighed, hurtige udvikling, korte levetid, billighed og lette håndtering. Dens betydeligt enklere genom, kropsplan, nervesystem, tarm og mikrobiom, men alligevel kompleks og ligner mennesker, gør det til en kraftfuld præklinisk model, hvor mekanistisk indsigt kan opnås, mens man tester for bioaktiv effekt eller toksicitet. Da interessen vokser for at udvikle mikrobielle interventioner for sygdomme 8,9,34,35^, er udnyttelse af sådanne prækliniske modeller til hurtigt at undersøge probiotika en attraktiv mulighed med det stort set uudnyttede og næsten ubegrænsede terapeutiske potentiale hos mikrober ³⁴. Den her beskrevne protokol er velegnet til at undersøge miljøbakteriers indvirkning på C. elegans sundhed, men kan let tilpasses til andre formål.

Alsidighed
De forskellige "moduler", der danner denne pipeline, kan tilpasses til at matche eksperiment- eller laboratoriespecifikke krav. For eksempel kan bakterieisolater erstattes af bakterielle blandinger, bakterielle mutanter eller RNAi-producerende bakterier, og opsætningen kan bruges til at screene for bakterielle gener involveret i værtsmikrobeinteraktioner, screene for værtsgener involveret i stressresistens eller studere virkningen af individuelle mikrober som en del af definerede bakteriesamfund. Denne metode beskriver screening af flere bakterieisolater i en enkelt orms genetiske baggrund. Analysen er imidlertid skalerbar, og flere værts- og bakterielle genotyper kan studeres på én gang. Dette kan yderligere kombineres med differentierede lægemiddelbehandlinger og / eller diætregimer for at få indsigt i værtsgen-mikrobe-gen-diætinteraktioner.

Protokollen er endnu ikke forsøgt på andre nematodearter, men den bør også være direkte anvendelig for C. remanei og C. briggsae, og den kan gælde for L3-trins parasitære nematodearter, der deler morfologiske, størrelses- og dødsfluorescensfunktioner med C. elegans³⁰. Endelig kan andre stressfaktorer (juglone, paraquat, arsenat, andre temperaturer) anvendes inden for samme rørledning til at give supplerende eller bekræftende information.

Potentielle udfordringer
Tidsinvesteringen op til dag 12 for at dyrke orme og bakterier før analyserne er betydelig, men på grund af tilgangens gennemstrømning opvejes den langt af bredden af de indsamlede data. Ikke desto mindre er omhu ved planlægning af sådanne analyser afgørende for at undgå at spilde tid ved at gentage forberedelsestrinnene, fordi materialer ikke er optimale, når analyserne kan starte. De vigtigste tidlige problemer omfatter prøveforurening (orme eller bakterier), dårligt synkroniserede ormepopulationer og løber tør for materialer (ormpopulationer spiser gennem deres mad hurtigere end forventet og fodrer eller overfører dyr oftere end planlagt).

Undgå forureninger
På grund af protokollens omfang og varighed er et stort potentielt problem forurening med svampe og bakterier, hvis forekomst helt sikkert ville forvirre resultaterne. Den ideelle opsætning er således et klimatiseret og luftfiltreret dedikeret laboratorierum uden direkte luftstrøm over den eksperimentelle bænk ved hjælp af sterile forbrugsstoffer. Overholdelse af regelmæssige rengøringsprocedurer (dekontaminering af bænke før og efter arbejde, rengøring af pladekasser og brug af sterile forbrugsstoffer) og arbejde med en flamme i et indesluttet rum (undgå gange, rum nær åbne døre og vinduer) er dog normalt tilstrækkelige til at opretholde et rent miljø. Hvis der opstår milde kontamineringer inden ægforberedelse i trin 2.2.1., vil blegningsproceduren tage sig af dem, og protokollen kan skride frem som planlagt. Omvendt vil forureninger, der påvirker den voksende ormepopulation inden overførsel til testbakterieplader, betyde afslutningen på dette forsøg, og protokollen skal genstartes fra trin 1. Senere forureninger vil have tendens til at påvirke enkelte bakteriestammer eller testbetingelser. Afhængigt af deres omfang kan det være værd at fortsætte eller genstarte protokollen.

Synkronisering af orm
Da resistens over for termiske og oxidative udfordringer ændres, når orme udvikler sig og vokser, kan testbetingelser, der fører til forskellige udviklingsstadier, når LFASS-assays udføres, ikke let sammenlignes. Det er vigtigt at give velsynkroniserede populationer til slutpunktsassays. Da assays udføres på orme indsamlet i bulk ved L4- eller L4 + 48 h-trin, skal ormpopulationerne synkroniseres meget godt ved L1, hvis der ikke er en ormsorterings- eller anden sorteringsprocedure til indsamling af perfekt iscenesatte orme. Det bør sikres, at unger holdes væk fra føde længe nok til, at alle levende æg kan klækkes, inden testkohorten vokser (>15 timer ved 20 °C og >18 timer ved 15 °C). Genotype kan påvirke spredningen i udviklingstiden, som også påvirkes af temperaturen. Voksende ormepopulationer ved 15 °C giver bedre kontrol over dette, samtidig med at virkningen af temperaturfølsomme mutationer begrænses i ormpopulationsudvidelsesfasen (især når man arbejder med insulinsignaleringsmutanter). Hovedårsagen til at studere virkningerne af mikrober fra L4 eller L4 + 48 h er at omgå den udviklingsmæssige virkning af en anden diæt og studere virkningen af levende tarmbakterier snarere end deres indvirkning på kosten. Orme dyrket i et tidligere larvestadium på forskellige bakterieisolater eller blandinger vil uundgåeligt føre til ujævne udviklingshastigheder og tab af synkronitet.

Konsekvenser af at stole på blå fluorescens
At være i stand til at lokalisere død i LFASS-assays uden behov for individuel ormsporing eller yderligere reagenser som Sytox green³⁶, men i stedet udnytte et endogent signal i et fluorescensområde, der sandsynligvis ikke overlapper traditionelle ormbiomarkører, er en klar fordel. Det er dog fortsat afgørende at sikre, at ormdødsfluorescens kan påvises konsekvent på tværs af mange testbetingelser. Mens analysen ikke er afhængig af fluorescenskvantificering, men på dens dynamik, skal ormene stadig udsende tilstrækkelig fluorescens for at estimere mediantiden for død (TOD) nøjagtigt. Da analysen ikke tillader opløsning af enkelt ormdød, skal de blå fluorescensudbrud, der udsendes af døende individer, have tilstrækkelig tidsmæssig overlapning til fluorescensakkumulering for at give en enkelt populations fluorescenstop. Først da kan median TOD udledes nøjagtigt. Dette betyder, at orme, der ikke er i stand til at producere tilstrækkelige niveauer af blå fluorescens, ikke kan anvendes i denne protokol, som især omfatter nogle mutanter af kynureninvejen, såsom tdo-2 og kynu-1^30,31, samt udsultede dyr. Derfor er det vigtigt at sikre, at orme holdes under fulde forhold hele vejen igennem. Dette kan især være et problem, når du udfører HT115-drevne RNAi-skærme, da HT115-græsplæner på NGM-medium suppleret med IPTG, og antibiotika har tendens til at være tyndere end OP50-græsplæner. Overvågning af ormfødevareforsyningen i de dage, der fører til analyserne, er derfor kritisk.

En anden konsekvens af dynamikken i dødsfluorescens er, at jo hurtigere analysen er, desto bedre er følsomheden, da orme fra samme population vil dø mere synkront og producere en mere defineret populationsdødsfluorescenstop. Jo længere analysen er, desto større er befolkningsstørrelsen, der er nødvendig for at generere gode dødsfluorescenstoppe. Mutanter med lavt stofskifte, såsom eat-2 og daf-2³⁰, vil også give mindre fluorescens og kræve højere tal pr. Brønd. Mens 10-15 vildtypeorme pr. brønd er tilstrækkelige til et 42 ° C termisk stressassay, der dræber dem alle inden for 4 timer, kræves næsten det dobbelte af denne mængde for daf-2 (e1370) orme i samme assay, og >100 vildtypeorme kræves til et assay, der ville dræbe orme over en 24-timers periode.

I forbindelse med miljømæssige bakterieisolater kan forskellig mikrobiel metabolisme også differentieret påvirke kynureninvejen, der producerer de blå fluorescerende forbindelser. Derfor fører nogle bakterieisolater til lavere topdødsfluorescens, mens andre fører til højere toppe end OP50. Som et resultat skal man sigte efter nok orme pr. Brønd til at imødekomme alle eventualiteter.

Endelig er det vigtigt at optimere pladeaflæsningsparametrene korrekt. Denne protokol dækker indstillingen af fluorescens excitation og emissionsparametre og den dybde, hvor aflæsninger ideelt set skal udføres. Med en muligvis bred vifte af dødsfluorescensudbytter på tværs af flere forhold i et enkelt assay er det vigtigt at sikre, at svage signaler detekteres, men at detektorer aldrig mættes. Instrumenter med detektorer, der kan prale af høje dynamiske områder, vil således fungere bedre.

Begrænsninger af metoden
Metoden, der er beskrevet her, er robust og fleksibel og kan let tilpasses forskellige forhold. For nemheds skyld nævnes vigtige begrænsninger og begrænsninger langs protokollen, hvor de kommer i spil. Kort fortalt er afhængigheden af dødsfluorescens som en endogen markør for døden både en styrke og en begrænsning af disse assays.

Under et begrænset antal specifikke kostforhold (lav tryptophan diæter eller sult) og under mutante forhold, der påvirker tryptophanmetabolismen (dvs. tdo-2, kynu-1, nogle daf-2 alleler), kan dødsfluorescensen (DF) være stærkt svækket, i det omfang den maksimale fluorescens er vanskelig at opdage, og TOD-estimater er mindre pålidelige.

Omvendt kan nogle mikrober producere blå fluorescerende forbindelser, hvis excitations- og emissionsspektre overlapper DF-signaler (dvs. Enterococcus faecalis). Mens deres dynamik adskiller sig fra DF og ofte kan afkobles, kan de forvirre analysen.

Dernæst er analyserne afhængige af kumulering af signaler fra døende individuelle orme, men DF slukkes over tid. Derfor, hvis orme dør for langt fra hinanden, vil individuelle fluorescenstoppe ikke producere en populationstop, hvilket forhindrer måling af en populationsmedian TOD. Jo langsommere analysen dræber, jo højere er ormtallet krævet i hver brønd³⁰. Derfor er 10-15 voksne orme pr. brønd tilstrækkelige til et 42 ° C varmestressassay, der dræber halvdelen af ormene inden for 2 timer, men over 70 orme pr. Brønd er nødvendige for et bakterielt hurtigt dræbende assay, der dræber halvdelen af ormene på 12 timer.

Endelig har brugerne brug for adgang til en pladelæser for at udføre sådanne assays, der kan udføre time-lapse fluorescensmålinger ved de krævede bølgelængder. Excitations- og emissionsbølgelængder kan også variere lidt mellem systemer og variere mellem nematodearter, som nævnt³⁰.

Sammenligning og komplementaritet med andre C. elegans-assays
I løbet af de sidste 10-15 år er mange assays blevet udviklet til at vurdere C. elegans sundhed under flere forhold på én gang, anvende en mangfoldighed af strategier og tilbyde forskellige niveauer af datadybde og bredde 30,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45^{, 46}. Flere kraftfulde assays er især blevet udviklet til automatisk at overvåge mange orme på én gang på faste medier i hele deres levetid ved hjælp af kameraarrays og scannere med multi-ormsporingsalgoritmer og / eller mikrofabrikerede individuelle ormarrays 37,38,39,40,41,43 . I forbindelse med værtsmikrobeinteraktioner har lignende tilgange til protokollen beskrevet ovenfor, men ikke afhængig af DF, også muliggjort genom-dækkende RNAi-screening af C. elegans-gener involveret i bakterielle infektioner^46,47,48. Imidlertid er disse assays med høj kapacitet afhængige af håndtering af orme i væske hele vejen igennem, hvilket ikke er ønskeligt, når man beskæftiger sig med flere bakterietyper på én gang på grund af de øgede risici for krydskontaminering, og fordi flydende kultur påvirker værts- og mikrobielle metabolisme. Derfor opretholdes og ældes C. elegans i traditionelle infektions-, stress-, sundheds- og levetidsanalyser på bakterielle græsplæner dyrket på faste medier. Som det også er tilfældet i denne protokol, kan resultater fra skærme udført med denne pipeline lettere relateres til og forudsige resultatet af nedstrøms bekræftende eksperimenter med skærmhits.

Fordelene ved selve LFASS-metoden er blevet godt dækket i reference³⁰. Sammenlignet med mere detaljerede kontinuerlige billeddannelsesopsætninger, der kan genbruges til lignende undersøgelser, er LFASS billigere (forudsat at median TOD er den eneste nødvendige udlæsning), og dens enkelhed betyder, at den ikke kræver meget teknisk evne eller specialudstyr. LFASS handler hovedsageligt om bredde over dybde. LFASS-data giver ikke andre oplysninger end mediantiden for en ormpopulations død og en indirekte aflæsning af en kynureninvejsoutput. Omvendt, med lavere, men stadig anstændig gennemstrømning, kan komplekse træk måles fra andre assays 37,38,39,40,41,43 over hele ormenes levetid^, hvilket gør dem til fremragende nedstrøms tilgange til at studere hits fra en LFASS-skærm.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm diameter plates (Non-vented)	Fisher Scientific	10720052	Venting is not necessary for bacterial cultures
15 cm diameter plates (Vented)	Fisher Scientific	168381
384-well black, transparent flat bottom plates	Corning	3712 or 3762	Not essential to be sterile for fast stress assays
6 cm diameter plates (Vented)	Fisher Scientific	150288	Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia
96-well transparent plates (Biolite)	Thermo	130188
Agar (<4% ash)	Sigma-Aldrich	102218041	Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing
Agarose	Fisher Scientific	BP1356
Avanti Centrifuge J-26 XP	Beckman coulter
Bleach	Honeywell	425044
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5080
Centrifuge 5415 R	Eppendorf
Centrifuge 5810 R	Eppendorf
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
LB agar	Difco	240110
LB broth	Invitrogen	12795084
LoBind tips	VWR	732-1488	Lo-bind reduce worm loss during transfers
LoBind tubes	Eppendorf	22431081
Magnesium sulfate	Fisher Scientific	M/1100/53
Plate reader- infinite M nano+	Tecan		Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used
Plate reader- Spark	Tecan
Potassium phosphate monobasic	Honeywell	P0662
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S/3160/63
Stereomicroscope setup with transillumination base	Leica	MZ6, or M80	Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide)	Sigma-Aldrich	458139
Transparent adhesive seals Nunc	Fisher Scientific	101706871	It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays.
Tryptophan	Sigma-Aldrich	1278-7099
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422