Criblage à haut débit d’isolats microbiens ayant un impact sur la santé de Caenorhabditis elegans

Summary

Les microbes intestinaux peuvent avoir un impact positif ou négatif sur la santé de leur hôte via des mécanismes spécifiques ou conservés. Caenorhabditis elegans est une plate-forme pratique pour dépister de tels microbes. Le présent protocole décrit le dépistage à haut débit de 48 isolats bactériens pour déterminer leur impact sur la résistance au stress des nématodes, utilisés comme indicateur de la santé des vers.

Abstract

Avec sa petite taille, sa courte durée de vie et sa génétique facile, Caenorhabditis elegans offre une plate-forme pratique pour étudier l’impact des isolats microbiens sur la physiologie de l’hôte. Il devient également fluorescent en bleu lors de la mort, fournissant un moyen pratique de localiser la mort. Cette propriété a été exploitée pour développer des tests de survie de C. elegans sans marquage à haut débit (LFASS). Celles-ci impliquent un enregistrement de fluorescence en accéléré des populations de vers placées dans des plaques multipuits, à partir desquelles le temps médian de mort de la population peut être déduit. La présente étude adopte l’approche LFASS pour dépister simultanément plusieurs isolats microbiens afin de déterminer les effets sur la sensibilité de C. elegans à la chaleur sévère et aux stress oxydatifs. Un tel pipeline de dépistage microbien, qui peut notamment être utilisé pour présélectionner les probiotiques, en utilisant une résistance sévère au stress comme indicateur de la santé de l’hôte, est rapporté ici. Le protocole décrit comment cultiver à la fois des collections d’isolats de microbiote intestinal de C. elegans et des populations de vers synchrones dans des réseaux multipuits avant de les combiner pour les essais. L’exemple fourni couvre l’analyse de 47 isolats bactériens et d’une souche témoin sur deux souches de vers, dans deux essais de stress en parallèle. Cependant, le pipeline d’approche est facilement évolutif et applicable à l’examen de nombreuses autres modalités. Ainsi, il fournit une configuration polyvalente pour étudier rapidement un paysage multiparamétrique de conditions biologiques et biochimiques qui ont un impact sur la santé de C. elegans.

Introduction

Le corps humain abrite environ 10 à 100 billions de cellules microbiennes vivantes (bactéries, champignons archées), qui se trouvent principalement dans les environnements intestinaux, cutanés et muqueux¹. Dans un état sain, ceux-ci offrent des avantages à leur hôte, y compris la production de vitamines, la maturation du système immunitaire, la stimulation des réponses immunitaires innées et adaptatives aux agents pathogènes, la régulation du métabolisme des graisses, la modulation des réponses au stress, etc., avec un impact sur la croissance et le développement, l’apparition de la maladie et le vieillissement 2,3,4,5 . Le microbiote intestinal évolue également considérablement tout au long de la vie. L’évolution la plus radicale se produit pendant la petite enfance et la petite enfance⁶, mais des changements significatifs se produisent également avec l’âge, notamment une diminution de l’abondance de Bifidobacterium et une augmentation des espèces de Clostridium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae et Enterococcus ⁷. Le mode de vie peut altérer davantage la composition microbienne intestinale conduisant à une dysbiose (perte de bactéries bénéfiques, prolifération de bactéries opportunistes), entraînant diverses pathologies telles que les maladies inflammatoires de l’intestin, le diabète et l’obésité⁵, mais contribuant également aux maladies d’Alzheimer et de Parkinson 8,9,10,11.

Cette prise de conscience a contribué de manière critique à affiner le concept de l’axe intestin-cerveau (ACS), où les interactions entre la physiologie intestinale (y compris maintenant les microbes qu’elle contient) et le système nerveux sont considérées comme le principal régulateur du métabolisme animal et des fonctions physiologiques¹². Cependant, le rôle précis du microbiote dans la signalisation intestin-cerveau et les mécanismes d’action associés sont loin d’être entièrement compris¹³. Le microbiote intestinal étant un déterminant clé du vieillissement en bonne santé, la façon dont les bactéries modulent le processus de vieillissement est devenue un sujet de recherche intense et de controverse 6,14,15.

Avec la démonstration que le ver rond Caenorhabditis elegans héberge un véritable microbiote intestinal dominé - comme chez d’autres espèces - par Bacteroidetes, Firmicutes, et Actinobacteria 16,17,18,19,20, son ascension rapide en tant que plate-forme expérimentale pour étudier les interactions commensales hôte-intestin^21,22,23,24 ,^25,26 a considérablement élargi notre arsenal d’enquête^26,27,28,29. En particulier, les approches expérimentales à haut débit disponibles pour C. elegans pour étudier les interactions gène-alimentation, gène-médicament, gène-pathogène, etc., peuvent être adaptées pour explorer rapidement l’impact des isolats et des cocktails bactériens sur la santé et le vieillissement de C. elegans.

Le présent protocole décrit un pipeline expérimental permettant de dépister immédiatement des réseaux d’isolats ou de mélanges bactériens placés dans des plaques multipuits pour déterminer les effets sur la résistance au stress de C. elegans en tant qu’indicateur de la santé, ce qui peut être utilisé pour identifier les probiotiques. Il explique comment développer de grandes populations de vers et manipuler des réseaux bactériens dans des formats de plaques à 96 et 384 puits avant de traiter les vers pour une analyse automatisée de la résistance au stress à l’aide d’un lecteur de plaque de fluorescence (Figure 1). L’approche est basée sur des tests de survie automatisés sans marquage (LFASS)³⁰ qui exploitent le phénomène de fluorescence de mort³¹, par lequel les vers mourants produisent une explosion de fluorescence bleue qui peut être utilisée pour déterminer le moment de la mort. La fluorescence bleue est émise par les esters glucosyles de l’acide anthranilique stockés dans les granules intestinaux de C. elegans (un type d’organite apparenté au lysosome), qui éclatent lorsqu’une cascade nécrotique est déclenchée dans l’intestin du ver à la mort³¹.

Figure 1 : Flux de travail expérimental pour le criblage à haut débit d’isolats bactériens ayant un impact sur la résistance de C. elegans au stress. (A) Calendrier pour l’entretien et la mise en place des tests vers et bactériens. (B) Installation et manipulation de réseaux de plaques bactériennes à 96 puits. (C) Installation de plaques à vis sans fin à 384 puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Les deux souches de C. elegans utilisées en parallèle pour la présente étude étaient Bristol N2 de type sauvage et HT1890: daf-16 (mgDf50), qui croissent à des taux similaires. Cependant, le protocole peut être reproduit avec n’importe quelle combinaison de deux souches qui ont des taux de croissance similaires. Notez que, lors de l’essai d’autres souches en parallèle (par exemple, les mutants daf-2 de type sauvage et à croissance lente), des taux de croissance différents doivent être pris en compte et, par conséquent, le protocole doit être ajusté. Les échelles de temps et les quantités de vers et de bactéries dans le protocole suivant sont optimisées pour les tests parallèles de 48 isolats bactériens sur deux souches de vers dans deux tests LFASS dans des tétraplicates. Des ajustements seront nécessaires si d’autres conditions doivent être testées en parallèle. Escherichia coli La souche de bactéries OP50 a été obtenue auprès du Caenorhabditis Genetics Center (CGC) de l’Université du Minnesota. Les 48 isolats bactériens ont été obtenus du laboratoire de Schulenburg et conservés sur gélose LB.

1. C. elegans cultivant sur OP50 (jours 1 à 8)

REMARQUE : L’approche actuelle vise à cultiver C. elegans hermaphrodites sur un milieu solide à tous les stades et à éviter les changements alimentaires inutiles (c.-à-d. en utilisant d’autres souches d’E. coli à croissance plus rapide comme NA22 ou des milieux de croissance plus riches comme les plaques d’œufs) pour rester aussi près que possible des conditions de croissance standard^32,33 qui sont encore largement utilisées. La température de croissance du ver (ici fixée à 15 °C) dépend de la ou des souches de C. elegans utilisées et peut nécessiter des ajustements (par exemple, pour éviter ou déclencher l’expression d’un phénotype ou d’un biomarqueur sensible à la température). Pour plus d’informations sur l’élevage des vers, veuillez consulter la référence³³.

1. Préparer huit plaques de NGM de 6 cm de diamètre (10 mL de gélose milieu de croissance des nématodes, NGM, dossier supplémentaire 1)^32,33 par souche de ver et laisser sécher pendant 1 jour à température ambiante.
2. Préparer une culture liquide saturée de bactéries E. coli OP50 en ensemençant un seul clone bactérien à partir d’une plaque de gélose au bouillon de lysogénie fraîchement cultivée (gélose LB, dossier supplémentaire 1) dans 25 mL de milieu OP50 (dossier supplémentaire 1) dans un tube conique de 50 mL. Cultiver la culture pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur vibreur.
3. Inoculer les huit plaques de NGM de 6 cm par souche avec 100 μL de culture liquide saturée d’E. coli OP50 par boîte et conserver les plaques à 20 °C pendant 2 jours avant utilisation.
4. À l’aide d’un scalpel, couper et transférer un morceau de gélose carrée de 0,5 cm avec des vers d’une plaque NGM récemment affamée sur chacune des huit plaques de NGM inoculées de 6 cm et incuber ces plaques à 20 °C pendant 3 jours (ou jusqu’à ce que les vers aient fini la nourriture).
5. Préparer cinq plaques de NGM de 15 cm par souche de vers (30 mL de milieu NGM par plaque) et inoculer avec 3 mL d’OP50. Laisser sécher les assiettes avant d’incuber à 37 °C pendant une nuit. Maintenir les plaques à 20 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées ultérieurement.
6. À l’aide d’une pipette P-1000, ajouter jusqu’à 3 mL de tampon M9 stérile (dossier supplémentaire 1) aux plaques de NGM de 6 cm (étape 1.1.) pour remettre les vers en suspension et recueillir la solution de vers des huit plaques par souche dans un seul tube conique de 15 mL.
   1. Centrifuger à 142 x g pendant 2 min à 4 °C. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette P-5000 ou d’une pompe à eau équipée d’une pipette ou d’un embout Pasteur stérile. Ajouter 10 ml de tampon M9 stérile pour laver la pastille de vers. Répétez 2x.
   2. Retirer le surnageant (autant que possible) et transférer les vers sur une plaque de NGM inoculée OP50 de 15 cm (étape 1.5.) à l’aide d’une pipette. Ajouter 0,5 mL de culture OP50 concentrée.
   3. Pour faire de l’OP50 concentré, inoculer chacune des quatre bouteilles de 1 L de LB avec 2 mL de culture de démarrage OP50 (préparée à l’étape 1.2.) et cultiver dans un incubateur à agitation pendant 6 h à 37 °C et 160 x g. Enduire les bactéries en granulés à 3057 x g et 20 °C pendant 15 min. Jeter le surnageant, remettre en suspension les pastilles bactériennes avec 6 mL de milieu OP50 et recueillir dans un tube conique stérile de 50 mL.
      REMARQUE: Les bactéries peuvent être conservées à 4 ° C jusqu’à 1 semaine.
7. Cultiver chaque souche de vers sur une plaque NGM de 15 cm de diamètre pendant 3-4 jours à 15 °C en réalimentant les vers avec 0,5 mL d’OP50 concentré par jour.
   1. Une fois que les vers ont presque fini la nourriture, recueillir et laver dans un tampon M9 (étape 1.6.1.), transférer chaque culture de souche de vers sur deux plaques NGM de 15 cm (étape 1.5.) et propager les vers à 20 °C jusqu’à ~95% de la population soient des adultes gravides (il faudra environ 24 heures pour le type sauvage Bristol N2).
      NOTE: Les adultes gravides sont caractérisés par la présence d’œufs dans le ver, et la plaque idéale devrait également avoir une abondance d’œufs non éclos pondus sur l’assiette sans trop de larves³³.

2. Maintien des collections d’isolat du microbiote intestinal (Jour 9)

1. Étaler les 48 isolats bactériens sur des plaques individuelles de gélose LB de 6 cm et croiser pendant 48 h à 20 °C.
   REMARQUE: Les bactéries peuvent être cultivées à 25 ° C pendant 24-36 h si nécessaire plus tôt, mais la croissance plus longue de 20 ° C permet de repérer les contaminants potentiels.
2. Synchronisez un grand nombre de C. elegans.
   1. Blanchir les vers adultes gravides en suivant la méthode standard de préparation des œufs³³ et transférer les œufs sur deux plaques NGM de 15 cm non ensemencées pendant 24 h à 15 °C pour permettre à toutes les larves L1 d’éclore et de croître de manière synchrone dans les étapes suivantes.
      ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous manipulez des solutions d’eau de Javel.

3. Culture de grandes cultures de C. elegans (Jour 10)

1. Une fois éclos, recueillir les larves L1 (à partir de l’étape 2.2.1.) dans 3-4 mL de M9 dans un tube conique propre de 15 mL. Pipeter quatre gouttes de 10 μL de solution de vers sur une lame ou une plaque et compter le nombre de vers dans chaque goutte sous un stéréomicroscope à un grossissement de 16x. Déterminer la concentration de vers de la solution en faisant la moyenne du nombre de larves de toutes les gouttes de solution de vers. Multipliez cette valeur par le volume restant et estimez le nombre total de vers pour chaque souche.
   REMARQUE : De 46 000 à 50 000 larves L1 par souche sont nécessaires à ce stade pour remplir ultérieurement une plaque de 384 puits ou deux demi-plaques.
   1. Pour chaque souche, transférer toutes les larves L1 sur deux plaques NGM de 15 cm (23 000-25 000 L1 par plaque) préalablement inoculées avec 3 mL d’OP50 (étape 1.5.) et réensemencées avec 0,5 mL d’OP50 concentré.
2. Incuber à 15 °C, en complétant avec 0,5 mL d’OP50 concentré par jour au besoin jusqu’à ce que les vers atteignent le stade L4.
   NOTE: Le stade L4 est caractérisé par un intestin légèrement plus foncé et une tache blanche en demi-disque ou en forme de croissant où la vulve finira par former^32,33.
3. Préparez des plaques d’agarose NGM à 96 puits en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Préparer huit plaques d’agarose NGM à 96 puits en remplissant chaque puits avec 125 μL de NGM-agarose (quatre plaques par essai).
      REMARQUE: Il est recommandé de plaquer quelques plaques supplémentaires si certaines sont contaminées dans les étapes suivantes. Deux lecteurs de plaques seront nécessaires pour effectuer des essais en parallèle, mais ils peuvent également être exécutés successivement en commençant par le test de contrainte thermique, car il peut être exécuté pendant aussi peu que 6 heures. Pour ces plaques, la gélose de cendres à <4 % est remplacée par de l’agarose (voir le tableau des matériaux), ce qui permet un séchage plus lent et plus uniforme sur les bouchons NGM et réduit l’enfouissement des vers pour une meilleure récupération.
   2. Assurez-vous que les puits sont remplis uniformément et sans bulles. Utilisez un bloc thermique réglé à 70 °C (avec un transfert de chaleur lent à travers le plastique de la plaque multipuits, l’agarose NGM ne peut chauffer que jusqu’à environ 55-60 °C) pour empêcher le mélange de se solidifier pendant le processus. Pour enlever les bulles dans les puits, utilisez une aiguille stérile chauffée à la flamme.
   3. Laisser les plaques à 96 puits reposer à température ambiante dans un environnement stérile avant de les retourner (couvercle vers le bas pour éviter la condensation) et conserver à 4 °C dans une boîte propre jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
4. Le jour 11, vérifiez les vers de l’étape 3.2., en vous assurant qu’aucune contamination n’est apparue et que les vers sont toujours pleins.
5. Le jour 12, vérifiez les vers de l’étape 3.1., en vous assurant qu’aucune contamination n’est apparue et que les vers sont toujours remplis. Vérifiez également le stade de développement des vers.
   REMARQUE: Le sexe/souche et le stade de développement du ver, comme les vers L4 ou L4 + 24 h utilisés, dépendent des traitements auxquels les vers sont soumis. Ici, des hermaphrodites de type sauvage ont été exposés à des isolats bactériens de L4 pendant 36 heures.

4. Préparation des collections d’isolats du microbiote intestinal pour la réalimentation des vers

1. Surveillez la croissance bactérienne sur les plaques de gélose LB à partir de l’étape 2.1. et continuer à incuber à 20 °C.
   NOTE: Bien que ce ne soit pas idéal, dans le cas où certains clones ne se développent pas ou ne révèlent pas de contaminations, les bactéries peuvent être re-striées à partir de stocks propres sur des plaques de 6 cm LB et cultivées à 25-28 ° C pendant 24 heures pour être prêtes pour l’expérience.
2. Définir une disposition de réseau de 96 puits pour la collection bactérienne testée, facilitant l’ensemencement systématique des plaques et l’analyse des données dans les étapes suivantes (tableau supplémentaire 1).
3. Prélever la masse bactérienne de chaque plaque bactérienne de 6 cm (étape 4.1.) et la transférer dans un tube microcentrifuge marqué de 1,5 mL contenant 1 mL de tampon M9. Pour ce faire, utilisez une boucle en plastique stérile à usage unique de 2 mm de diamètre ou une boucle métallique de 5 mm de diamètre. Stériliser la boucle métallique entre les souches bactériennes en la trempant dans de l’éthanol à 100%, en la flambant et en la refroidissant pendant 5 s.
4. Vortex les tubes de microcentrifugation jusqu’à ce que les pastilles bactériennes soient complètement remises en suspension (selon la souche bactérienne, cela peut prendre ~1-10 s).
5. Faire tourner à 9 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante, retirer 700 μL de surnageant et remettre en suspension la pastille bactérienne par vortex.
6. Transférer 200 μL de chaque suspension bactérienne dans un seul puits d’une plaque stérile vide de 96 puits selon la disposition décrite à l’étape 4.2.
7. À partir de cette plaque, inoculer huit plaques d’agarose NGM à 96 puits (préparées à l’étape 3.3.) avec 10 μL de solution bactérienne à l’aide d’une pipette multicanal et incuber avec le couvercle à 25 °C pendant 24 h. Ne pas sceller les plaques pour permettre le séchage des plaques et la croissance aérobie bactérienne et pour éviter l’excès de condensation.
8. Sceller la plaque de suspension à 96 puits préparée à l’étape 4.6. avec un film adhésif propre (voir le tableau des matériaux) et conserver à 15 °C jusqu’à 5 jours. Cela sera utilisé pour la réalimentation des vers au besoin.

5. Configuration du choc thermique et des tests oxydatifs LFASS (jours 13 - 14)

1. En regardant les plaques de l’étape 3.5., évaluez le stade de développement des vers. Une fois que >90 % des vers ont atteint L4³⁴, recueillir les vers dans jusqu’à 10 mL de solution M9 stérile dans des tubes coniques de 15 mL.
2. Laver abondamment les vers (au moins 4x) en tournant vers le bas à 142 x g pendant 2 minutes à 4 °C, en retirant le surnageant et en ajoutant 10 ml de M9 stérile frais entre chaque lavage pour éliminer les bactéries OP50. Remettez en suspension la pastille de ver dans 10 mL de M9.
3. Transférer 50 μL de solution de vis sans fin dans un tube de liaison à faible surface (voir le tableau des matériaux) contenant 950 μL de M9. Après avoir mélangé doucement le contenu du tube pour éviter la sédimentation par les vers, utilisez rapidement une pointe de pipette humide à faible liaison pour transférer 3 à 4 gouttes distinctes de 10 μL sur une lame de verre ou une plaque NGM, et compter le nombre de vers au stéréomicroscope (voir le tableau des matériaux) à un grossissement de 16x. Faites la moyenne des comptes à partir des 3-4 gouttes et déterminez le nombre de vers par microlitre dans la solution de vers (voir étape 3.1.).
4. Ajustez la concentration du ver dans le tube de 10 mL pour atteindre ~120 vers dans 8 μL. Si la solution préparée à l’étape 5.2. n’est pas assez concentré, faites tourner les vers vers vers et retirez M9 en conséquence pour atteindre 120 vers par 8 μL.
5. Transférer 8 μL de solution de vers (~120 vers) dans chacun des puits des huit plaques NGM-agarose à 96 puits de l’étape 4.7., à l’aide d’une pipette multicanal ou d’une pipette répétée. Assurez-vous d’utiliser des conseils de faible rétention pour limiter la perte de vers. Il peut également être nécessaire de couper les extrémités pour permettre aux grands vers adultes de limiter le stress mécanique sur les vers adultes.
   REMARQUE: Le test nécessite un minimum de 30 vers sains vivants pour fonctionner de manière fiable, mais fonctionne mieux avec environ 100 vers par puits.
6. Incuber les plaques d’agarose NGM à 96 puits ensemencées par le ver et la bactérie à 25 °C pendant 36 h.
7. Vérifiez les plaques entre 12 et 24 h, en vous assurant que les vers restent remplis partout. Si une réalimentation est nécessaire, remettre les bactéries en suspension dans la plaque de réseau bactérienne à 96 puits stockée à 15 °C à l’étape 4.8 et ajouter jusqu’à 10 μL de la solution bactérienne correspondante aux plaques d’agarose NGM à 96 puits où les vers risquent de mourir de faim avant la fin de la période d’incubation de 36 heures (les vers affamés produiront des résultats très différents, C’est donc très important).
   REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées le jour 15. Avant de commencer le test, il peut être nécessaire d’optimiser la hauteur de lecture. La lecture optimale sera atteinte à 20-50 μm au-dessus du fond du puits. Cela dépendra du modèle du lecteur de plaques. Certains offrent la possibilité d’un Z-scan, tandis que d’autres permettent une saisie manuelle de la hauteur. Réglez la hauteur optimale au niveau où le signal de fluorescence bleue le plus élevé (365 nm/430 nm) est détecté. Certains lecteurs de plaques peuvent fonctionner à une hauteur fixe optimisée pour les tests cellulaires adhérents et peuvent ne pas être idéaux pour les tests LFASS.
8. Après 36 h, distribuer 30 μL de M9 dans chaque puits de la plaque de 96 puits.
   REMARQUE: Pour les tests de contrainte thermique, le lecteur de plaque doit avoir atteint la température requise pour effectuer le test et peut avoir besoin d’être allumé à l’avance. Le protocole actuel utilise 42 °C pour maximiser la vitesse de destruction, mais l’approche s’applique à d’autres températures supérieures à 30 °C.
9. Transfère les vers (environ 20 μL) dans la plaque de 384 puits selon les dispositions définies, en utilisant des pointes à faible rétention (envisagez de couper l’extrémité des pointes pour permettre aux gros vers de réduire le stress mécanique des vers adultes).
   NOTE: Pour la présente étude, deux réglages différents de lecteur de plaques sont utilisés pour les deux essais décrits ici (contrainte thermique et stress oxydatif), et donc les échantillons destinés à ces deux essais ne doivent pas être plaqués dans la même plaque de 384 puits.
10. Assurez-vous que les lecteurs de plaques sont correctement configurés (tableau 1).
11. Complétez les plaques de 384 puits avec plus de M9, en visant un volume final de 60 μL par puits. Pour l’essai du stress thermique, ajouter 40 μL de M9, et pour le stress oxydatif induit par la t-BHP, ajouter 34 μl de M9 dans 6 μl de t-BHP (voir le tableau des matériaux).
    1. Commencez l’essai dans les 2 minutes suivant l’ajout de t-BHP (idéalement, tous les vers doivent être exposés simultanément à la t-BHP, la résolution du temps d’essai étant de 2 min). Si ce n’est pas possible, utilisez une minuterie pour estimer le temps passé à pipeter la t-BHP avant le début de l’essai afin de permettre un ajustement ultérieur du temps médian de décès.
12. Fermez les plaques avec leur couvercle transparent. Scellez les bords des plaques de 384 puits avec du ruban de masquage (ruban adhésif sur la plaque et le couvercle), en veillant à ce que le ruban ne passe pas sur le couvercle ou sous la plaque. Couper le ruban entre le couvercle et la plaque à intervalles réguliers à l’aide d’un scalpel pour permettre l’échange d’air tout en minimisant l’évaporation pendant l’essai.
13. Insérez la plaque dans le lecteur de plaques (voir le tableau des matériaux) et commencez la course. Viser à exciter à 365 nm et détecter les émissions à 435 nm toutes les 2 minutes pendant 6 à 12 h (tableau 1).
    REMARQUE : En règle générale, 6 h suffisent pour les dosages de stress thermique à 42 °C et 8 h pour les dosages de stress oxydatif à 7 % de la t-BHP.

6. Traitement des données des lecteurs de plaques

1. Enregistrez les données de fluorescence brutes du lecteur de plaques au format .txt, .csv ou .xls /.xlsx séparés par des virgules ou des tabulations, puis convertissez-les au format xls /.xlsx. Selon le format des données, réorganisez-les pour qu’elles correspondent à la mise en page de feuille Excel nécessaire à l’analyse LFASS. Suivez les instructions détaillées fournies dans la référence³⁰.
   REMARQUE: Alors que les données peuvent être analysées manuellement, en normalisant chaque série chronologique et en recherchant le moment où la fluorescence de mort atteint la moitié du maximum, une analyse automatisée peut être effectuée dans Matlab exécutant la routine LFASS³⁰.
2. Téléchargez et installez Matlab (version 2014a ou supérieure) et le progiciel LFASS de https://github.com/ABA80/LFASS. Suivez les instructions et les annotations qui y sont fournies.
   REMARQUE : La figure 1C donne une brève description de l’approche. Matlab est requis pour exécuter la routine LFASS. Alternativement, le code Matlab peut être traduit en Oracle, à l’exception de la fonction d’ajustement, qui est propriétaire. De nouvelles fonctions de lissage et de sigmoïde peuvent être réécrites pour permettre une utilisation dans une plate-forme entièrement open-source.
3. Entre les analyses LFASS, déplacez les données et les résultats vers un nouvel emplacement, car l’analyse LFASS traitera tous les fichiers du dossier de données et remplacera les fichiers du dossier Résultats.

7. Contrôle des données

1. Ouvrez le fichier Excel et étiquetez les lignes en fonction de la position du puits sur la plaque de 384 puits. Le fichier supplémentaire 2 montre un exemple du fichier Excel des données brutes de fluorescence générées pour le test de choc thermique. Utilisez la position du puits sur la plaque de 384 puits pour étiqueter les souches de vers et de bactéries.
2. Avant l’analyse Matlab, inspectez visuellement les données dans Excel, en traçant l’intensité de fluorescence au fil du temps pour un puits représentatif. Selon le lecteur de plaques utilisé, les données peuvent être bruyantes mais doivent afficher un pic clair. En particulier:
   1. Déterminer une valeur de fluorescence en dessous de laquelle un pic ne serait pas significativement différent du bruit (l’établissement d’un tel seuil dans LFASS accélérera l’analyse en excluant les puits vides).
   2. Notez le premier moment où les fluctuations de fluorescence s’atténuent avant de se lever (les animaux peuvent battre vigoureusement jusqu’à 30 minutes, ce qui entraîne des lectures de fluorescence bleue fluctuantes rapidement).
      REMARQUE : Le raccord de crête peut être amélioré en excluant ces premiers points temporels de la fenêtre d’ajustement de la courbe.
   3. Notez les points temporels entre lesquels les valeurs de fluorescence minimale et maximale devraient chuter (examinez plusieurs puits pour identifier ces plages) car ils seront utilisés pour l’ajustement de la courbe.
   4. Vérifiez si les amplitudes des pics de fluorescence varient de manière significative entre les puits, normalisez les données avant une analyse plus approfondie à l’aide de la formule suivante:
      Puits de fluorescence normalisé n (t) = (Puits_de fluorescence_n [t] - puits de fluorescence minimale [Dt]) / (puits de fluorescence maximale [Dt] - puits de fluorescence minimale [Dt])
      où « n » est le numéro de puits actuel, « t » est le point temporel et « Dt » est la série de points de temps pour l’essai.

8. Traitement des données LFASS

NOTA : Des détails sont fournis au https://github.com/ABA80/LFASS et dans les documents supplémentaires de la référence³⁰.

1. Créez deux sous-dossiers dans le dossier LFASS, un pour les données à analyser et un pour les résultats, par exemple, « mes données » et « résultats ».
2. Copiez le fichier de données Excel du test dans le sous-dossier LFASS « mes données » après l’inspection des données.
3. Lancez MATLAB, accédez au dossier LFASS , tapez et exécutez fitfolder dans la fenêtre de commande (Fichier supplémentaire 3). Suivez ensuite les instructions à l’écran.
4. Après avoir tapé « fitfolder », le système demande le nom du dossier dans lequel se trouve le fichier Excel, par exemple, « mes données ». Tapez le nom de votre dossier de données (dans cet exemple, « mes données »).
5. Suivez les instructions à l’écran, en fournissant les différents paramètres demandés.
   1. Entrez « 2 » pour l’intervalle de temps entre les mesures successives dans le protocole actuel (en spécifiant cela, les résultats peuvent être exprimés en minutes au lieu d’unités de point de temps).
      REMARQUE: L’intervalle de temps peut être modifié pour effectuer des mesures de fluorescence plus ou moins fréquemment (pour diminuer ou augmenter la résolution temporelle) et également en fonction des capacités du lecteur de plaques (c’est-à-dire que l’intervalle de temps peut devoir être augmenté pour les lecteurs de plaques qui ne peuvent pas effectuer des mesures assez rapides). Assurez-vous de toujours faire correspondre l’intervalle de temps expérimental avec la routine LFASS.
   2. Attribuez le seuil de tolérance supérieur en tapant « 0,95 » (cela peut être modifié au besoin pour améliorer l’ajustement) et le seuil de tolérance inférieur en tapant « 0,05 » (cela peut être modifié au besoin pour améliorer l’ajustement) pour limiter l’ajustement sigmoïde.
      REMARQUE : Les autres paramètres de temps sont basés sur les notes de l’utilisateur de l’inspection des données (étape 7.2.).
6. Choisissez d’afficher ou non les courbes ajustées et lissées en tapant « y » pour OUI ou « n » pour NON lorsque vous y êtes invité. Pour inspecter visuellement les ajustements convergents, sélectionnez le premier.
   REMARQUE: Ce dernier est utile pour visualiser toutes les données lissées mais n’est généralement pas sélectionné car il génère trop de graphiques pop-up. Ensuite, Matlab exécutera la routine LFASS, ce qui peut prendre 1 à 10 minutes si plusieurs fichiers Excel sont traités en une seule fois. Des fenêtres contextuelles avec des courbes apparaîtront en fonction de la sélection de l’étape 8.6. Le dossier supplémentaire 4A montre un exemple de courbe ajustée.
7. Choisissez de (1) analyser les courbes identifiées comme du bruit ou (2) réajuster les courbes mal ajustées avec une option [y/n]. Tapez y pour approuver et n pour rejeter.
   REMARQUE: Il est recommandé d’approuver le réaménagement, surtout s’il y a beaucoup de courbes mal ajustées ou non ajustées. Cela permettra à l’utilisateur de fournir des paramètres d’ajustement de courbe adaptés pour chaque courbe telle qu’elle apparaît à l’écran et de ne demander que des limites antérieures et ultérieures pour l’ajustement sigmoïde. Il peut être tenté autant de fois que nécessaire.
8. Une fois les données analysées, fermez Matlab et ouvrez le dossier LFASS .
9. Cliquez sur le sous-dossier LFASS Mes résultats, car les fichiers de résultats sont enregistrés automatiquement dans le dossier Résultats en tant que .txt.
   REMARQUE: Matlab génère trois fichiers .txt: « Batch-fitted.txt », « Batch and noise-fitted.txt » et « Refitted.txt ». Les deux premiers sont enregistrés par précaution en cas de panne informatique ou d’erreur de l’utilisateur lors du réaménagement. Le fichier contenant l’analyse complète la plus précise est « Refitted.txt ».
10. Ouvrez le fichier Réajusté.txt avec Microsoft Excel et enregistrez-le en tant que .xls pour un traitement ultérieur. Le fichier supplémentaire 4B montre un exemple d’un tel fichier de résultats.
    REMARQUE : Pour chaque puits (organisé en rangées), trois valeurs sont fournies dans les colonnes qui donnent des estimations du temps médian de mort de la population de vers : « Raw » : indique le temps qui se croise au demi-maximum du pic de données expérimentales; « Batch-fitted »: indique le temps d’intersection au demi-maximum de la courbe ajustée par lot; « Réaménagé »: indique le temps de croisement au demi-maximum de la courbe réaménagée.
11. Enregistrez le fichier au format .xls en tant que copie dans un emplacement sûr. Si vous ne le faites pas, les fichiers risquent d’être écrasés lors de la prochaine exécution de la routine LFASS.
    REMARQUE: Les résultats peuvent ensuite être traités ultérieurement pour une analyse graphique ou statistique.

Representative Results

Les tests LFASS fournissent un criblage robuste, à haut débit et rapide de plusieurs conditions de test à la fois, telles que le criblage de nombreux paramètres génétiques et microbiotiques qui contribuent à la résistance au stress et au vieillissement. Il ne faut que 2 à 3 semaines à l’expérience pour acquérir un vaste ensemble de données de plusieurs conditions de test. Les populations adultes de vers de type sauvage L4 + 36 h ont été exposées à un stress thermique de 42 °C et à un stress oxydatif induit par la t-BHP à 7 % après une culture de 36 h sur 48 isolats microbiens intestinaux pendant 36 h. Le test a été effectué quatre fois, chaque condition étant répétée quatre fois dans chaque essai. Dans toutes les conditions testées, le temps médian de décès variait entre 40 et 130 min pour l’essai de stress thermique et entre 90 et 240 min pour le test de stress oxydatif induit par la t-BHP. Les tests de stress thermique au début de l’âge adulte montrent généralement des résultats plus cohérents et moins de variabilité entre les jours et intra-jours que les tests de stress oxydatif et sont de meilleurs prédicteurs de la longévité ultérieure³⁰. La différence dans le temps médian de mort des vers nourris avec différents régimes microbiens illustre de manière concluante l’impact des commensaux intestinaux sur la résistance au stress de l’hôte. La figure 2 montre les résultats typiques de 16 réplicats biologiques pour les vers sauvages Bristol N2 sur deux isolats de microbiote intestinal d’intérêt et la souche standard E. coli OP50 de laboratoire.

Figure 2 : Résultats représentatifs des essais appariés de résistance à la chaleur et au stress oxydatif de vers cultivés sur deux isolats bactériens et une souche témoin. (A) Essai du stress thermique. Des vers de type sauvage ont été nourris pendant 36 heures avec des isolats bactériens MYb11 (Pseudomonas lurida) ou MYb115 (Pseudomonassp.) ou des bactéries témoins OP50. MYb11 a conduit à un temps médian de décès significativement plus précoce (p < 0,001). (B) Dosage du stress oxydatif. Des vers de type sauvage ont été nourris pendant 36 heures avec des isolats bactériens MYb11 ou MYb115 ou des bactéries témoins OP50. MYb11 a conduit à un temps médian de décès significativement plus précoce (p < 0,05). 120 à 150 vers ont été analysés dans quatre ensembles d’échantillons, et chaque expérience a été réalisée en quadruplicate. Les puits avec des données de mauvaise qualité ou mal ajustées ont entraîné des valeurs manquantes. Les représentations de diagrammes en boîte indiquent les valeurs de puits unique, les valeurs minimales, médianes et maximales. *Indique une signification statistique à p < 0,05 et ***p < 0,001, avec ANOVA unidirectionnelle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Un
Paramètre	Réglage	Commentaire
Température	25 °C
Excitation par fluorescence	365 nm	Bande passante de 10 nm
Émission de fluorescence	430 nm	Bande passante de 20 nm
Nombre de flashs	8 flashs, 1ms de temps de réglage
Gagner	100 à 130	À ajuster en fonction de l’échantillon. Visez une valeur de lecture de 2 à 5 k au début de l’essai
Temps de latence	1 μs
Temps d’intégration	30 μs
Intervalle de temps de lecture	Toutes les 2 minutes	Selon la gravité du stress, la durée et l’intervalle de temps peuvent nécessiter des ajustements (8 h suffisent à 7% t-BHP)
Durée	8-12h
Lire la direction	D’en bas
B
Paramètre	Réglage	Commentaire
Température	42 °C
Excitation par fluorescence	365 nm	Bande passante de 10 nm
Émission de fluorescence	430 nm	Bande passante de 20 nm
Nombre de flashs	8 flashs, 1ms de temps de réglage
Gagner	100 à 130	À ajuster en fonction de l’échantillon. Visez une valeur de lecture de 2 à 5 k au début de l’essai
Temps de latence	1 μs
Temps d’intégration	30 μs
Intervalle de temps de lecture	Toutes les 2 minutes	En fonction de la gravité de la contrainte, la durée et l’intervalle de temps peuvent nécessiter un ajustement (6 h suffisent à 42 °C)
Durée	6-12h
Lire la direction	D’en bas

Tableau 1 : Paramètres des essais d’oxydation et de stress thermique. Exemples de paramètres utilisés pour les tests de stress oxydatif (A) et thermique (B) sur les lecteurs de plaques de fluorescence utilisés dans cette étude.

Fichier supplémentaire 1 : Recettes, médias, tampons et culture. Composition des différents milieux, tampons et cultures utilisés dans la présente étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Données brutes de fluorescence du lecteur de plaques après avoir été exportées et converties au format Excel .xls. (A) Le fichier Excel montre les données brutes de fluorescence pour un test de choc thermique. Les données brutes de fluorescence sont affichées à un intervalle de temps de 2 minutes. (B) La colonne avec la « position du puits » sur la plaque de 384 puits est mise en évidence, ce qui peut être utilisé pour marquer le ver et les souches bactériennes. (C) Le fichier est étiqueté avec des souches de vers et de bactéries. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Analyse LFASS avec Matlab. (A) Après avoir ouvert le dossier LFASS dans Matlab, une fenêtre de commande apparaît. (B) « fitfolder » est tapé dans la fenêtre de commande pour démarrer le programme, et le nom du dossier avec le fichier à analyser est indiqué. (C) Une fois que le programme trouve le fichier Excel de données pour analyse, l’utilisateur doit suivre les instructions à l’écran, en fournissant les différents paramètres demandés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4 : Analyse des données LFASS à l’aide de Matlab. (A) Un exemple de courbe ajustée par analyse Matlab, où la ligne noire indique le point de temps correspondant à la limite de temps antérieure et la ligne bleue la limite de temps ultérieure pour l’ajustement de la courbe. La courbe sigmoïde ajustée est affichée en rouge. (B) Le fichier de résultats généré par Matlab est ouvert en format .xls. Les valeurs sont mises en surbrillance et affichées sous forme de nombre. La deuxième colonne indique l’heure à laquelle la valeur de la courbe de données brutes dépasse pour la première fois 50 % de la valeur maximale. La troisième colonne indique le moment où la valeur de la courbe ajustée est égale à 50 % de la valeur maximale, telle que déterminée lors de l’analyse d’ajustement par lots. La quatrième colonne indique le moment auquel la valeur sur la courbe ajustée est égale à 50 % de la valeur maximale après analyse par lots et réaménagement final si nécessaire. La quatrième colonne devrait donc fournir le résultat le plus fiable. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Exemples de dispositions expérimentales des plaques. (A) Disposition des plaques à 96 puits pour tester 47 isolats bactériens différents du microbiote intestinal du ver sur deux souches de vers distinctes, l’OP50 vivant étant utilisé comme témoin. Quatre copies de cette plaque sont requises pour chaque essai en cours d’exécution. (B) Disposition à 384 puits pour les dosages de chaleur ou de stress oxydatif, correspondant à l’essai précédent sur plaque à 96 puits en (A). Cette configuration permet d’effectuer des tétraplications pour chaque condition, chaque souche de vis sans fin ayant son propre contrôle OP50. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Discussion

C. elegans offre de nombreux avantages pour le criblage rapide de plusieurs paramètres expérimentaux à la fois, en raison de sa petite taille, de sa transparence, de son développement rapide, de sa courte durée de vie, de son faible coût et de sa facilité de manipulation. Son génome, son plan corporel, son système nerveux, son intestin et son microbiome considérablement plus simples, mais suffisamment complexes et similaires à ceux des humains, en font un modèle préclinique puissant, où des informations mécanistes peuvent être obtenues tout en testant l’efficacité ou la toxicité bioactive. Alors que l’intérêt pour le développement d’interventions microbiennes pour les maladies 8,9,34,35 augmente^, tirer parti de tels modèles précliniques pour étudier rapidement les probiotiques est une option attrayante avec le potentiel thérapeutique largement inexploité et presque illimité des microbes ³⁴. Le protocole décrit ici convient à l’étude de l’impact des bactéries environnementales sur la santé de C. elegans, mais peut être facilement adapté à d’autres fins.

Versatilité
Les différents « modules » qui forment ce pipeline peuvent être adaptés pour répondre aux exigences spécifiques de l’expérience ou du laboratoire. Par exemple, les isolats bactériens peuvent être substitués à des mélanges bactériens, des mutants bactériens ou des bactéries productrices d’ARNi, et la configuration peut être utilisée pour dépister les gènes bactériens impliqués dans les interactions hôte-microbe, dépister les gènes hôtes impliqués dans la résistance au stress ou étudier l’impact des microbes individuels dans le cadre de communautés bactériennes définies. Cette méthode décrit le criblage de plusieurs isolats bactériens dans le fond génétique d’un seul ver. Cependant, le test est évolutif et plusieurs génotypes d’hôtes et de bactéries peuvent être étudiés à la fois. Cela peut être combiné avec des traitements médicamenteux différentiels et / ou des régimes alimentaires pour mieux comprendre les interactions gène hôte-microbe gène-alimentation.

Le protocole n’a pas encore été essayé sur d’autres espèces de nématodes, mais il devrait également être directement applicable à C. remanei et C. briggsae, et il peut s’appliquer aux espèces de nématodes parasites au stade L3 qui partagent des caractéristiques de fluorescence morphologiques, de taille et de mort avec C. elegans³⁰. Enfin, d’autres facteurs de stress (juglone, paraquat, arséniate, autres températures) peuvent être utilisés dans le même pipeline pour fournir des informations complémentaires ou de confirmation.

Défis potentiels
L’investissement en temps jusqu’au jour 12 pour cultiver des vers et des bactéries avant les tests est important, mais en raison du débit de l’approche, il est largement compensé par l’étendue des données collectées. Néanmoins, il est essentiel de planifier avec soin de tels tests pour éviter de perdre du temps en répétant les étapes de préparation, car les matériaux sont sous-optimaux au moment où les tests peuvent commencer. Les principaux problèmes initiaux comprennent la contamination des échantillons (vers ou bactéries), les populations de vers mal synchronisées et le manque de matériaux (les populations de vers mangent leur nourriture plus rapidement que prévu et réalimentent ou transfèrent les animaux plus souvent que prévu).

Éviter les contaminations
En raison de l’ampleur et de la durée du protocole, un problème potentiel majeur est la contamination par des champignons et des bactéries, dont l’apparition perturberait certainement les résultats. La configuration idéale est donc un espace de laboratoire dédié climatisé et filtré à l’air sans flux d’air direct au-dessus du banc expérimental, utilisant des consommables stériles. Cependant, observer des procédures de nettoyage régulières (décontaminer les bancs avant et après le travail, nettoyer les boîtes de plaques et utiliser des consommables stériles) et travailler par une flamme dans un espace confiné (éviter les couloirs, les espaces près des portes ouvertes et des fenêtres) sont généralement suffisants pour maintenir un environnement propre. Si de légères contaminations se produisent avant la préparation des œufs à l’étape 2.2.1., la procédure de blanchiment s’en chargera et le protocole pourra progresser comme prévu. Inversement, les contaminations qui affectent la population croissante de vers avant le transfert sur des plaques bactériennes d’essai signifieront la fin de cette tentative, et le protocole devra être redémarré à partir de l’étape 1. Les contaminations ultérieures auront tendance à affecter des souches bactériennes uniques ou des conditions d’essai. Selon leur ampleur, il peut être utile de continuer ou de redémarrer le protocole.

Synchronisation des vers
Comme la résistance aux défis thermiques et oxydatifs change lorsque les vers se développent et se développent, les conditions d’essai qui conduisent à différents stades de développement au moment où les tests LFASS sont effectués ne peuvent pas être facilement comparées. Il est essentiel de produire des populations bien synchronisées pour les tests finaux. Comme les dosages sont effectués sur des vers collectés en vrac aux stades L4 ou L4 + 48 h, en l’absence d’un trieur de vers ou d’une autre procédure de tri pour collecter des vers parfaitement stadidés, les populations de vers doivent être très bien synchronisées à L1. Il convient de veiller à ce que les nouveau-nés soient tenus à l’écart des aliments suffisamment longtemps pour que tous les œufs vivants éclosent avant la croissance de la cohorte d’essai (>15 h à 20 °C et >18 h à 15 °C). Le génotype peut affecter la propagation dans le moment du développement, qui est également affecté par la température. La croissance des populations de vers à 15 °C permet un meilleur contrôle tout en limitant l’impact des mutations sensibles à la température pendant la phase d’expansion de la population de vers (notamment lors du travail avec des mutants de signalisation de l’insuline). La principale raison d’étudier les effets des microbes de L4 ou L4 + 48 h est de contourner l’impact sur le développement d’un régime alimentaire différent et d’étudier l’impact des bactéries intestinales vivantes plutôt que leur impact sur l’alimentation. Les vers cultivés à un stade larvaire précoce sur différents isolats ou mélanges bactériens entraîneront inévitablement des taux de développement inégaux et une perte de synchronie.

Conséquences de la dépendance à la fluorescence bleue
Être capable de localiser la mort dans les tests LFASS sans avoir besoin d’un suivi individuel des vers ou de réactifs supplémentaires tels que Sytox green³⁶, mais exploitant plutôt un signal endogène dans une plage de fluorescence qui est peu susceptible de chevaucher les biomarqueurs traditionnels des vers, est un avantage évident. Cependant, il reste essentiel de s’assurer que la fluorescence de la mort des vers peut être détectée de manière cohérente dans de nombreuses conditions d’essai. Bien que le test ne repose pas sur la quantification de la fluorescence mais sur sa dynamique, une fluorescence suffisante doit encore être émise par les vers pour estimer le temps médian de mort (TOD) avec précision. Comme le test ne permet pas de résoudre la mort d’un seul ver, les sursauts de fluorescence bleue émis par les individus mourants doivent avoir un chevauchement temporel suffisant pour que l’accumulation de fluorescence donne un seul pic de fluorescence de population. Ce n’est qu’alors que la TOD médiane peut être déduite avec précision. Cela signifie que les vers incapables de produire des niveaux suffisants de fluorescence bleue ne peuvent pas être utilisés dans ce protocole, qui inclut notamment certains mutants de la voie de la kynurénine tels que tdo-2 et kynu-1^30,31, ainsi que des animaux affamés. Par conséquent, il est important de s’assurer que les vers sont maintenus dans des conditions remplies tout au long. Cela peut notamment être un problème lors de la réalisation de criblages ARNi pilotés par HT115, car les pelouses HT115 sur milieu NGM complétées par IPTG et antibiotiques ont tendance à être plus minces que les pelouses OP50. La surveillance de l’approvisionnement alimentaire des vers pendant les jours précédant les tests est donc essentielle.

Une autre conséquence de la dynamique de la fluorescence de mort est que plus le test est rapide, meilleure est la sensibilité, car les vers de la même population mourront de manière plus synchrone et produiront un pic de fluorescence de mort de population plus défini. Ainsi, plus le test est long, plus la taille de la population nécessaire pour générer de bons pics de fluorescence de mort est importante. Les mutants à faible métabolisme, tels que eat-2 et daf-2³⁰, donneront également moins de fluorescence et nécessiteront des nombres plus élevés par puits. Alors que 10 à 15 vers de type sauvage par puits sont suffisants pour un test de stress thermique à 42 °C qui les tue tous en 4 heures, près du double de cette quantité est nécessaire pour les vers daf-2 (e1370) dans le même essai, et > 100 vers de type sauvage sont nécessaires pour un test qui tuerait les vers sur une période de 24 heures.

Dans le contexte des isolats bactériens environnementaux, un métabolisme microbien différent peut également avoir un impact différentiel sur la voie de la kynurénine qui produit les composés fluorescents bleus. Par conséquent, certains isolats bactériens conduisent à une fluorescence de mort maximale plus faible, tandis que d’autres conduisent à des pics plus élevés que OP50. En conséquence, il faut viser suffisamment de vers par puits pour faire face à toutes les éventualités.

Enfin, il est essentiel d’optimiser correctement les paramètres de lecture des plaques. Ce protocole couvre le réglage des paramètres d’excitation et d’émission de fluorescence et la profondeur à laquelle les lectures devraient idéalement être effectuées. Avec une gamme éventuellement large de rendements de fluorescence de mort dans plusieurs conditions en un seul essai, il est important de s’assurer que les signaux faibles sont détectés, mais que les détecteurs ne sont jamais saturés. Les instruments équipés de détecteurs dotés de plages dynamiques élevées seront donc plus performants.

Limites de la méthode
La méthode décrite ici est robuste et flexible et peut être facilement adaptée à diverses conditions. Pour plus de commodité, les principales restrictions et limitations sont mentionnées le long du protocole où elles entrent en jeu. En bref, le recours à la fluorescence de la mort comme marqueur endogène de la mort est à la fois une force et une limite de ces tests.

Dans un nombre limité de conditions alimentaires spécifiques (régimes à faible teneur en tryptophane ou famine) et dans des conditions mutantes affectant le métabolisme du tryptophane (c.-à-d. tdo-2, kynu-1, certains allèles daf-2 ), la fluorescence de mort (DF) peut être fortement atténuée, dans la mesure où la fluorescence maximale est difficile à détecter et les estimations TOD sont moins fiables.

Inversement, certains microbes peuvent produire des composés fluorescents bleus dont les spectres d’excitation et d’émission chevauchent les signaux DF (c.-à-d. Enterococcus faecalis). Bien que leur dynamique diffère de celle du DF et puisse souvent être dissociée, elles peuvent confondre l’analyse.

Ensuite, les tests reposent sur le cumul des signaux des vers individuels mourants, mais le DF est éteint avec le temps. Par conséquent, si les vers meurent trop loin les uns des autres, les pics de fluorescence individuels ne produiront pas de pic de population, empêchant la mesure d’un TOD médian de la population. Plus le test tue lentement, plus le nombre de vers requis dans chaque puits³⁰ est élevé. Par conséquent, 10 à 15 vers adultes par puits sont suffisants pour un test de stress thermique à 42 °C qui tue la moitié des vers en 2 heures, mais plus de 70 vers par puits sont nécessaires pour un test bactérien de destruction rapide qui tue la moitié des vers en 12 heures.

Enfin, les utilisateurs doivent avoir accès à un lecteur de plaques pour effectuer de tels tests qui peuvent effectuer des mesures de fluorescence en accéléré aux longueurs d’onde requises. Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission peuvent également varier légèrement d’un système à l’autre et varier d’une espèce de nématode à l’autre, comme mentionné³⁰.

Comparaison et complémentarité avec d’autres dosages de C. elegans
Au cours des 10 à 15 dernières années, de nombreux tests ont été développés pour évaluer la santé de C. elegans dans plusieurs conditions à la fois, en utilisant une diversité de stratégies et offrant différents niveaux de profondeur et d’étendue des données 30,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45^{, 46}. Plusieurs tests puissants ont notamment été développés pour surveiller automatiquement de nombreux vers à la fois sur des supports solides tout au long de leur durée de vie, à l’aide de réseaux de caméras et de scanners dotés d’algorithmes de suivi multi-vers et/ou de réseaux de vers individuels microfabriqués 37,38,39,40,41,43 . Dans le contexte des interactions hôte-microbe, des approches similaires au protocole décrit ci-dessus, mais ne reposant pas sur la DF, ont également permis le criblage de l’ARNi à l’échelle du génome des gènes de C. elegans impliqués dans les infections bactériennes^46,47,48. Cependant, ces tests à haut débit reposent sur la manipulation de vers dans un liquide partout, ce qui n’est pas souhaitable lorsqu’il s’agit de plusieurs types de bactéries à la fois en raison des risques accrus de contamination croisée et parce que la culture liquide affecte les métabolismes de l’hôte et microbien. Par conséquent, dans les tests traditionnels d’infection, de stress, de durée de santé et de longévité, C. elegans est maintenu et vieilli sur des pelouses bactériennes cultivées sur des milieux solides. Comme c’est également le cas dans ce protocole, les résultats des criblages effectués avec ce pipeline peuvent être plus facilement liés et prédire les résultats des expériences de confirmation en aval avec des tests de dépistage.

Les avantages de l’approche LFASS elle-même ont été bien couverts dans la référence³⁰. Comparé à des configurations d’imagerie continue plus élaborées qui pourraient être réutilisées pour des études similaires, LFASS est moins cher (à condition que la TOD médiane soit la seule lecture nécessaire), et sa simplicité signifie qu’il ne nécessite pas beaucoup de compétences techniques ou d’équipement spécialisé. Le LFASS concerne principalement la largeur plutôt que la profondeur. Les données de l’EFTASS ne fournissent pas d’information autre que le moment médian de la mort d’une population de vers et une lecture indirecte d’une sortie de la voie de la kynurénine. Inversement, avec un débit inférieur mais toujours décent, les traits complexes peuvent être mesurés à partir d’autres dosages 37,38,39,40,41,43 sur toute la durée de vie des vers^, ce qui en fait d’excellentes approches en aval pour étudier les résultats d’un criblage LFASS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm diameter plates (Non-vented)	Fisher Scientific	10720052	Venting is not necessary for bacterial cultures
15 cm diameter plates (Vented)	Fisher Scientific	168381
384-well black, transparent flat bottom plates	Corning	3712 or 3762	Not essential to be sterile for fast stress assays
6 cm diameter plates (Vented)	Fisher Scientific	150288	Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia
96-well transparent plates (Biolite)	Thermo	130188
Agar (<4% ash)	Sigma-Aldrich	102218041	Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing
Agarose	Fisher Scientific	BP1356
Avanti Centrifuge J-26 XP	Beckman coulter
Bleach	Honeywell	425044
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5080
Centrifuge 5415 R	Eppendorf
Centrifuge 5810 R	Eppendorf
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
LB agar	Difco	240110
LB broth	Invitrogen	12795084
LoBind tips	VWR	732-1488	Lo-bind reduce worm loss during transfers
LoBind tubes	Eppendorf	22431081
Magnesium sulfate	Fisher Scientific	M/1100/53
Plate reader- infinite M nano+	Tecan		Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used
Plate reader- Spark	Tecan
Potassium phosphate monobasic	Honeywell	P0662
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S/3160/63
Stereomicroscope setup with transillumination base	Leica	MZ6, or M80	Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast
t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide)	Sigma-Aldrich	458139
Transparent adhesive seals Nunc	Fisher Scientific	101706871	It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays.
Tryptophan	Sigma-Aldrich	1278-7099
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422