Summary
התכונות הוויסקואלסטיות של הריר ממלאות תפקיד קריטי בפינוי הריריות. עם זאת, טכניקות ריאולוגיות מסורתיות של ריר דורשות גישות מורכבות וגוזלות זמן. מחקר זה מספק פרוטוקול מפורט לשימוש ברומטר ספסל שיכול לבצע במהירות ובאמינות מדידות ויסקואלסטיות.
Abstract
במחלות ריאה חסימתיות(למשל, אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית, סיסטיק פיברוזיס) ומצבים נשימתיים אחרים (למשל, זיהומים נגיפיים/חיידקיים), תכונות ביופיזיות של ריר משתנות על ידי היפר-סקרציה של תאי גביע, התייבשות דרכי הנשימה, עקה חמצונית ונוכחות של דנ"א חוץ-תאי. מחקרים קודמים הראו כי כיח צמיגות נמצא בקורלציה עם תפקוד ריאתי וכי טיפולים המשפיעים על ריאולוגיה של כיח (למשל, רירית) יכולים להביא ליתרונות קליניים יוצאי דופן. באופן כללי, מדידות ריאולוגיות של נוזלים שאינם ניוטוניים משתמשות בגישות משוכללות שגוזלות זמן רב (למשל, רהומטרים מקבילים/לוחות חרוט ו/או מעקב אחר חלקיקי מיקרובאד) הדורשות אימון נרחב כדי לבצע את הבדיקה ולפרש את הנתונים. מחקר זה בחן את האמינות, יכולת השכפול והרגישות של Rheomuco, מכשיר ספסל ידידותי למשתמש שנועד לבצע מדידות מהירות באמצעות תנודה דינמית עם טאטוא זן גזירה כדי לספק מודולי ויסקואלסטיים ליניאריים (G', G", G*, ו-tan δ) ומאפייני נקודת ג'ל (γc ו-σc) עבור דגימות קליניות תוך 5 דקות. ביצועי המכשיר אומתו באמצעות ריכוזים שונים של סימולנט ריר, 8 תחמוצת פוליאתילן MDa (PEO), ובניגוד למדידות ריאולוגיות מסורתיות בתפזורת. מבודד קליני שנקטף מחולה אינטובאט עם סטטוס אסתמטיקוס (SA) הוערך לאחר מכן במדידות משולשות ומקדם השונות בין המדידות הוא <10%. השימוש ב-Ex vivo בחומר חזק להפחתת ריר, TCEP, על ריר SA הביא לירידה של פי חמישה במודולוס האלסטי ולשינוי לכיוון התנהגות "דמוית נוזל" יותר באופן כללי (למשל, δ שיזוף גבוהים יותר). יחד, תוצאות אלה מראות כי מד הספסל שנבדק יכול לבצע מדדים אמינים של צמיגות ריריות במסגרות קליניות ומחקריות. לסיכום, ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כדי לחקור את ההשפעות של תרופות ריריות (למשל, rhDNase, N-אצטיל ציסטאין) באתר כדי להתאים את הטיפול על בסיס כל מקרה לגופו, או במחקרים פרה-קליניים של תרכובות חדשות.
Introduction
מחלות דרכי הנשימה החוסמות לריריות, כולל אסתמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), סיסטיק פיברוזיס (CF) ומצבים נשימתיים אחרים, כגון דלקת ריאות נגיפית וחיידקית, הן חששות בריאותיים נפוצים ברחבי העולם. בעוד שהפתופיזיולוגיה משתנה מאוד בין כל מצב, מאפיין מפתח משותף הוא פינוי ריריות לא תקין. בריאות, ריר קושר את אפיתל דרכי הנשימה כדי ללכוד חלקיקים בשאיפה ולספק מחסום פיזי נגד פתוגנים. לאחר ההפרשה, ריר דרכי הנשימה, המורכב מכ-97.5% מים, 0.9% מלח, כ-1.1% חלבונים כדוריים וכ-0.5% מוקינים, מועבר בהדרגה לכיוון הגלוטי על ידי הכאה מתואמת של ריסונים 1,2. מוקינים הם גליקופרוטאינים גדולים המקושרים ל-O, המקיימים אינטראקציה באמצעות קשרים לא קוולנטיים וקוולנטיים, כדי לספק את התכונות הוויסקואלסטיות המובהקות של ריר, הנדרשות להובלה יעילה3. שינויים במבנה האולטרה-מבנה של רשת המוצין הנגרמים על ידי שינוי בהעברת יונים, התפתחות מוצין, אינטראקציות אלקטרוסטטיות, קישור צולב או שינויים בהרכב יכולים להשפיע באופן משמעותי על צמיגות הריר ולפגוע בפינויהריריות 4,5. לפיכך, זיהוי שינויים בתכונות הביופיזיות של ריר דרכי הנשימה חיוני להבנת פתוגנזה של מחלות ולבדיקת תרכובות ריריות חדשניות6.
גורמים שונים יכולים להוביל לייצור של ריר חריגה בריאות. ב- COPD, שאיפה כרונית של עשן סיגריות גורמת להיפר-סקרציה של ריר כתוצאה ממטאפלזיה של תאי גביע, כמו גם התייבשות דרכי הנשימה באמצעות ויסות של תעלת מווסת ההולכה של סיסטיק פיברוזיס טרנסממברנה (CFTR), הגורמת להיפר-קונסנטציה של ריר וחסימת דרכי הנשימה הקטנה 7,8. באופן דומה, CF, הפרעה גנטית הקשורה למוטציות בגן CFTR, מאופיינת בייצור של ריר צמיג ודבק שאינו מספיק להובלה 8,9. בקצרה, תפקוד לקוי של CFTR גורם לדלדול נוזלי של פני השטח של דרכי הנשימה, להסתבכות של מוצין פולימרי ולאינטראקציות ביוכימיות מוגברות, הגורמות לדלקת כרונית ולזיהומים חיידקיים. בנוסף, תאים דלקתיים הלכודים בריר סטטי מחריפים עוד יותר את הצמיגות של הריר על ידי הוספת מולקולה גדולה נוספת, DNA, למטריצת הג'ל, ומחמירים את חסימת דרכי הנשימה5. אחת הדוגמאות הטובות ביותר לחשיבותה של ריאולוגיה של ריר על הבריאות הכללית של הריאות מסופקת על ידי הדוגמה של DNFase אנושי רקומביננטי (rhDNase) בטיפול בחולי סיסטיק פיברוזיס. ההשפעות של rhDNase הודגמו לראשונה ex vivo על כיח צפוי, שהראה מעבר מריר צמיג לנוזל זורם תוך דקות10,11. ניסויים קליניים בחולי CF הראו כי הפחתת צמיגות הליחה של דרכי הנשימה באמצעות שאיפת rhDNase הפחיתה את קצב ההחמרות הריאתיות, ושיפרה את תפקוד הריאות ואת רווחתם הכללית שלהמטופלים 12,13,14. כתוצאה מכך, שאיפת rhDNase שמטרתה להקל על הסילוק הפכה לסטנדרט הטיפול בחולי CF במשך יותר משני עשורים. יתרונות קליניים דומים נצפו עם השימוש במי מלח היפרטוניים בשאיפה להידרציה של ריר ב- CF, אשר תאם עם שינויים בתכונות ריאולוגיות והביא להאצת פינוי ריריות ושיפור תפקוד הריאות15,16. לפיכך, פרוטוקול מהיר ואמין למדידת תכונות ויסקואלסטיות של ריר במסגרות קליניות חשוב כדי לייעל את הגישות הטיפוליות.
מד ה- benchtop הנבדק כאן מציע אלטרנטיבה מהירה ונוחה לביצוע מדידות ויסקואלסטיות מקיפות של דגימות ריר / כיח. באמצעות תנודות דינמיות עם תזוזה זוויתית מבוקרת, המכשיר מספק דפורמציה באמצעות זוג לוחות מקבילים מתכווננים (למשל, גיאומטריות גסות או חלקות) למדידת המומנט והתזוזה ברזולוציות של 15 nN. m ו- 150 ננומטר, בהתאמה17. כיול סטנדרטי המוגדר כברירת מחדל בשילוב עם הנחיות משתמש המותאמות למומחי ריאולוגיה שאינם מומחים לריאולוגיה מאפשר מדידות פשוטות ומפחית את הסיכון לשגיאות מפעיל. המכשיר מייצר עקומת טאטוא מתח המעובדת ומנותחת בזמן אמת (תוך כ-5 דקות) ומספקת באופן אוטומטי הן את המאפיינים הוויסקואלסטיים הליניאריים (G', G", G*, ו-tan δ) והן את נקודת הג'ל (γc ו-σ c) (ראו טבלה 1). מודולוס אלסטי או מודולוס אחסון (G') מתאר כיצד דגימה מגיבה ללחץ (כלומר, היכולת לחזור לצורתה המקורית), בעוד שמודולוס הצמיג או האובדן (G") מתאר את האנרגיה המתפזרת לכל מחזור של דפורמציה סינוסואידלית (כלומר, האנרגיה שאבדה עקב חיכוך של מולקולות). המודולוס המורכב או הדינמי (G*) הוא היחס בין מתח למתח, המתאר את כמות הצטברות הכוחות הפנימיים בתגובה לתזוזה גזירה (כלומר, התכונות הוויסקואלסטיות הכוללות). גורם השיכוך (tan δ) הוא היחס בין המודולוס הצמיג למודולוס האלסטי, מה שמצביע על יכולתו של מדגם לפזר אנרגיה (כלומר, δ שיזוף נמוך מצביע על התנהגות אלסטית-דומיננטית/דמוית מוצק, בעוד δ שיזוף גבוה מצביע על התנהגות צמיגת-דומיננטית/נוזלית). עבור מאפייני נקודת הג'ל, זן ההצלבה (γc) הוא המדד של זן הגזירה, המחושב על ידי היחס בין נתיב הסטייה לגובה מרווח הגזירה, שבו הדגימה עוברת מהתנהגות דמוית מוצק להתנהגות דמוית נוזל ומתרחשת, מעצם הגדרתה, בזן התנודה שבו G' = G" או tan δ = 1. מתח תשואת ההצלבה (σc) הוא מדד לכמות הלחץ המופעלת על ידי המכשיר שבו המודולי האלסטי והצמיג חוצה. בספוטה בריאה, האלסטיות שולטת בתגובה המכנית למתח (G' > G"). במחלות ריריות-חסימתיות, גם G' וגם G" עולות כתוצאה משינויים פתולוגיים בליחה 17,18,19. הפשטות התפעולית של המכשיר מאפשרת מדידות באתר ועוקפת את הצורך באחסון/הובלה/משלוח של דגימות למתקן מחוץ לאתר לצורך ניתוח ובכך מונעת את השפעות הזמן וההפשרה ההקפאה על תכונותיהן של דגימות ביולוגיות אלה.
במחקר זה, 8 פתרונות של תחמוצת פוליאתילן MDa (PEO) בריכוזים שונים (1%-3%) שימשו לאימות טווח המדידה של ריאמטר ספסל מסחרי (טבלת חומרים) והעקומה התלויה בריכוז המתקבלת הושוותה ישירות למדידות שנרכשו עם רומטר מסורתי בתפזורת (טבלת חומרים) ). יכולת החזרה של מדידות ריאולוגיות הוערכה לאחר מכן באמצעות ריר שנקטף ברונכוסקופי מחולה אינטובאטוס הסובל מסטטוס אסתמטיקוס (SA), צורה קיצונית של החמרה באסתמה המאופיינת בברונכוספזם, דלקת אאוזינופילית והיפר-פרודוקציה של ריר בתגובה לחומר סביבתי או זיהומי 8,20 . במקרה זה, חולה ה-SA הוחדר בשל כשל נשימתי חמור ונזקק ל-ECMO (חמצון ממברנה חוץ-גופית) בשל חוסר היכולת לתמוך בחולה ביעילות ובבטחה עם הנשמה מכנית בלבד, למרות טיפולי אסתמה סטנדרטיים אגרסיביים. במהלך ברונכוסקופיה שצוינה קלינית לקריסת לובר, נצפו הפרשות עבות, שקופות ועקשניות שחוסמות את הסמפונות הלובריים ושואפות באמצעות שטיפות מלוחות. מיד לאחר האיסוף, עודף מלח הוסר מהשאיפה והתכונות הוויסקואלסטיות של דגימת ה- SA הנותרת נותחו באמצעות התקן ה- benchtop. דגימות נוספות של אליקוטים טופלו בחומר מחזר, טריס (2-קרבוקסילאתיל) פוספין הידרוכלוריד (TCEP), כדי לקבוע אם פרוטוקול זה עשוי לשמש לאפיון יעילות תרכובת טיפולית ex vivo.
התוצאות הראו כי פרוטוקול זה ומכשיר ה- benchtop יכולים לשמש ביעילות במסגרת קלינית. התכונות הריאולוגיות שנקבעו מתוך עקומות תלויות ריכוז PEO (איור 1A) לא היו ניתנות להבחנה בין התקן הספסל הנבדק לבין רומטר לוח מקבילי מסורתי (איור 1B). מדידות משולשות של ריר ה-SA היו ניתנות לחזרה, עם מקדם וריאציה של 10% עבור נקודות הקצה של G*, G' ו-G" ושיקפו את החריגות המשמעותיות בצמיגות הריר שהיו ניכרות קלינית במקרה של מטופל זה (איור 1D). לבסוף, טיפול ב-ex vivo עם TCEP הביא לירידה משמעותית ב-G' וב-G", ולעלייה δ השיזוף, מה שהדגים את ההיענות לטיפול על ידי שינויים ברשת המוצין (איור 2). לסיכום, פרוטוקול זה באמצעות rheometer benchtop מספק גישה פשוטה ויעילה להערכת תכונות ויסקואלסטיות של דגימות ריר המתקבלות מהמרפאה. יכולת זו עשויה לשמש כדי להקל על גישות לרפואה מדויקת לטיפול, שכן קלינאים יכולים לבחון את היעילות של תרופות ריריות מאושרות באתר, מה שיכול לסייע בזיהוי אפשרויות טיפול חלופיות. בנוסף, גישה זו יכולה לשמש בניסויים קליניים כדי לבחון את ההשפעות של תרופות ניסיוניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
במחקר הנוכחי, דגימות נאספו במהלך ברונכוסקופיה שצוינה קלינית לאחר קבלת הסכמה מדעת על פי פרוטוקול שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של UNC.
1. איסוף ואחסון של כיח/ריר
- לאסוף ריר דרכי הנשימה באמצעות איסוף כיח או שאיפה ברונכוסקופיה.
- אספו כיח באמצעות ציפייה ספונטנית או גרמו לכיח ב-3% שאיפת מי מלח היפרטונית. לחלופין, לשאוף ישירות ריר מדרכי הנשימה במהלך הליך ברונכוסקופיה.
- אחסנו כיח/ליחה שנאספו בדרכי הנשימה בכוסות דגימה סטריליות. במקרה של כיח, יש להסיר רוק עודף מהדגימה מיד עם האיסוף.
- הניחו את הדגימות על קרח לצורך הובלה. הגבל את זמן ההובלה לפחות מ-4 שעות.
- נתח את הדגימות בזמן האיסוף או אחסן ב -80 °C עד לעיבוד.
- לפני האחסון, הומוגניזציה של הריר על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים עם פיפטה תזוזה חיובית או פיפטה ישירות לתוך צינורות microcentrifuge.
- Aliquot הדגימות לאחסון בכמויות ≥500 μL כדי להבטיח נפח מספיק לניסויים.
הערה: הקפאה והפשרה עשויות להשפיע על התכונות הוויסקואלסטיות של המדגם. השווה רק דגימות שעברו מחזורי הקפאה/הפשרה דומים.
2. הכנת דוגמאות
- פיפטה טרייה וקפואה ספוטה/ריר ישירות או הומוגנית דגימות באמצעות פיפטה תזוזה חיובית על ידי פיפטה עדינה למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים לפני ההזזה.
הערה: הומוגניזציה חשובה לדגימות המכילות תקעים עבים שיכולים להשפיע על יכולת השכפול. - Aliquot 400-500 μL של הדגימה לתוך צינורות microcentrifuge נפרדים. הכינו כמה שיותר אליקוטים לפי הצורך למדידות חוזרות ו/או לטיפול בריאגנטים פרמקולוגיים (למשל, rhDNase, N-אצטיל ציסטאין). דגירה של האליקוטים לבדיקה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות לפני המדידה.
- לבדיקת סוכנים פרמקולוגיים (אופציונלי), השתמש בריכוזים גבוהים של פתרונות מלאי כדי למנוע דילול דגימה.
- הוסף בין 0.4% ל-10% נפח (כדי למזער את דילול הדגימה) של המגיב הרצוי (למשל, TCEP) ישירות לדגימה. וודאו שאף טיפה של התרכובת לא נשארת בצד הצינור.
- הדגירה של הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי כדי לאפשר תגובה כימית (<1 שעות כדי למנוע את הפירוק הפרוטאוליטי של הריר).
- ערבבו את דגימת הריר והריאגנט על ידי הזזת החלק התחתון של שפופרת המיקרוצנטריפוגה כל 2 דקות כדי לאפשר חדירה הדרגתית של הריאגנט לתוך דגימת הריר מבלי להתפשר על רשת המוצין (למשל, חיקוי מכות סילאריות ופינוי ריריות). כאשר משווים מספר ריאגנטים לתרופות, ודא שזמן הדגירה דומה.
3. אתחול וכיול מכשירים
- הפעל את המכונה (טבלת חומרים) ואתחל את התוכנה.
- בחר מדידה חדשה. הזן את מספר הזיהוי לדוגמה תחת מזהה מדידה ואת שם המפעיל תחת מפעיל כדי להמשיך. הזן מידע נוסף או הערות תחת הערות.
- בחרו סט גיאומטריה (כלומר, לוחות מקבילים מחוספסים או חלקים בקוטר 25 מ"מ) ובדקו היטב לוחות גדולים וקטנים כדי לוודא שהלוחות נקיים ובמצב מושלם).
הערה: לוחות מחוספסים מיועדים לנפחים גדולים (350-500 μL) ולוחות חלקים מיועדים לנפחים קטנים יותר (250-350 μL). שימוש בנפח דגימה נמוך או גבוה יותר מהמומלץ עלול לגרום למדידות לא מדויקות. - הכנס את הצלחת הגדולה בחוזקה על הדוכן התחתון.
- הכניסו את הצלחת הקטנה בעדינות לדוכן העליון ונעלו את הצלחת על ידי סיבוב קל עד לשמיעת "קליק", מה שמעיד על כך שהצלחת מהודקת כראוי. שים לב שהתנודה החופשית של הלוח העליון היא נורמלית.
- המתן עד שהטמפרטורה תגיע לערך היעד של 37 °C (74 °F). לאחר מכן, הפעל כיול אוטומטי כפי שהתבקשה על ידי התוכנה.
הערה: אל תפריעו למשטח המכונה או לספסל במהלך תהליך זה.
4. טעינה לדוגמה
- באמצעות פיפטה תזוזה חיובית, לאט לאט פיפטה בין 250 ל 500 μL של הדגימה על מרכז הלוח התחתון הגדול. לאחר ההפקדה על הצלחת, דגימות צמיגות יאמצו צורת כיפה ואילו דגימות אלסטיות מאוד עשויות לדרוש ניתוק פיזי (השתמש במספריים ניתוח).
הערה: הימנעו מהכנסת בועות אוויר. במידת הצורך, הסר בועות שיוריות על ידי דחיפה עם קצה פיפטה. - הנמיכו את ראש המדידה הנושא את הצלחת הקטנה באמצעות התוכנה והתבוננו בדגימה. אם תועמס כראוי על הלוח התחתון, הדגימה תיצור מגע ותהיה ממורכזת בין שני הלוחות.
- כדי להבטיח שהדגימה תמלא את הפער (כלומר, על-ידי התפשטות לשולי הלוחות), השתמש בפונקציה 'הפחת את הפער' עד שהדגימה כבר לא תהיה בצורת דו-קונקית או תתיישר עם קצה הלוחות. פונקציית הפחתת הפער מורידה את ראש המדידה במרווחים של 0.1 מ"מ ומוגבלת לשבע דרגות.
הערה: עקוב אחר הדגימה בזהירות והתאם את הפער בהדרגה כדי למנוע צפיפות יתר.- אם נותר רווח לאחר שבע דרגות, לחץ על התקנת ביצוע חוזר כדי לחזור למיקום הראשוני ולהתאים את המיקום ו/או עוצמת הקול של הדגימה.
- אם המרווח מצטמצם ביותר (למשל, צורה דו-קווית), הסר את הדגימה העודפת עם מרית על ידי תנועה מעגלית לאורך קצה הלוח העליון. הקפידו לקצץ את הדגימה העודפת בעדינות כדי למנוע לחץ גזירה.
הערה: בסוף שלב זה, יש ליישר את קצה הדגימה עם קצה הלוח העליון כפי שמוצג בהנחיות למשתמש.
- הנמיכו את כיסוי המגן כדי למנוע הקרנה מקרית של נוזלים מזוהמים במהלך תנודה.
5. ליזום מדידה ביופיזית
- כדי להתחיל מדידה, לחץ על התחל ניתוח. מחזור מלא ייקח 4-7 דקות.
- הימנעו מלדבר בקול רם ולגעת במכשיר או בספסל לאורך כל המחזור. סביבה שקטה חשובה במיוחד במשך 2 הדקות הראשונות.
הערה: במהלך המחזור, המכשיר מבצע בדיקת טאטוא מאמץ סטנדרטית, המורכבת משלבים מתנדנדים עוקבים. כל צעד הוא סדרה של 10 תנודות באמפליטודה ותדר קבועים (1 הרץ), שבמהלכן נמדד המומנט המתאים בזמן אמת. אותות המתח והמומנט מאפשרים חישוב של מודולי הקומפלקס (G*), האלסטי (G') והצמיג (G"), כמו גם יחס השיכוך (δ השיזוף) בכל שלב. תנודות בהדרגה להגדיל את המשרעת, אשר מעצים את העיוות המוטל על המדגם.
- הימנעו מלדבר בקול רם ולגעת במכשיר או בספסל לאורך כל המחזור. סביבה שקטה חשובה במיוחד במשך 2 הדקות הראשונות.
6. הסרת דגימה
- לאחר השלמת המחזור, לחץ על הבא כדי להרים את ראש המדידה וליצור את דוח ניתוח המדגם.
הערה: עבור הדו"ח, התוכנה מחשבת את הנתונים המוקלטים ומתארפת באופן אוטומטי שתי עקומות המציגות את האבולוציה של המודולי הצמיג והמודולי האלסטי ביחס לעיוות המופעל על המדגם ומציגה את משטר הוויסקואלסטי הליניארי (כלומר, מישור בעיוות נמוך) אם קיים. אם לא מזוהה משטר ליניארי, הערכים של G', G", G*, ו-tan δ מופקים במתח של 0.05. בנוסף, מתח ההצלבה ומתח התשואה (γc, ו- σc) מחושבים ב- tan δ = 1. הנתונים מסופקים גם בגיליונות אלקטרוניים עבור כל שלב לניתוח נוסף. - לאחר שראש המדידה נסוג במלואו, הרימו את כיסוי המגן, השליכו את הדגימה והסירו בזהירות את הצלחות. נקו וחטאו את הצלחות באמצעות מים חמים וסבון.
הערה: ייבשו את הגיאומטריה שנקבעה ביסודיות לפני השימוש החוזר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מראה את הדיוק ואת יכולת החזרה של מדידות ריאולוגיות באמצעות עקומות תלויות ריכוז של שליטה ויסקואלסטית, כלומר, תמיסת תחמוצת פוליאתילן (PEO) וסטטוס אסתמטיקוס (SA) ריר. מדידות של מאפיינים ויסקואלסטיים של 8 MDa PEO בחמישה ריכוזים שונים (1%, 1.5%, 2%, 2.5% ו-3%) הושוו ישירות בין ריאמטר הספסל המוערך לבין רומטר בתפזורת מסורתי (טבלת חומרים). בניגוד לליחה SA, תמיסות PEO נשלטו על ידי צמיגות (G" > G') בכל טווח הזנים ולא הציגו קרוסאובר, ולכן הציגו התנהגות דמוית מוצק. בנוסף, מדידות משולשות שבוצעו על תמיסת PEO של 1.5% ודגימת ריר SA קלינית אישרו כי מאפיינים ויסקואלסטיים ליניאריים (G*, G', ו-G") היו ניתנים לחזרה רבה (<10% מקדם וריאציה) עבור הערכים שהתקבלו מהדגימה הביולוגית.
התצפית על התמוטטות לובר בחולה SA הציעה כי חיבור ריר עלול לסבך את היכולת לאוורר את הריאות באופן מכני והעלתה את האפשרות שניתן לשקול טיפולים ריריים לא סטנדרטיים. באיור 2, הפרוטוקול המתואר כאן שימש למדידת שינויים בתכונות הוויסקואלסטיות של ריר לאחר טיפול בחומר רירי. בעוד ש-NAC אושר לשימוש עם COPD ו-CF, הוא הוכח כבעל קינטיקה איטית ועוצמה נמוכה כסוכן מחזר21. TCEP הוכח כיעיל ביותר בשינוי התכונות הביופיזיות של ריר22. ההשפעות של TCEP על צמיגות ריר SA נבדקו בסביבה קלינית באמצעות מד הספסל. טיפול בריריות הניב דגימה דמוית נוזל יותר עם ירידה במודולוס המורכב (G*) פי 4.6, מודולוס אלסטי (G') פי 5.1, מודולוס צמיג (G") פי 1.9, זן קרוסאובר (γc) פי 3.3, ומתח תשואת קרוסאובר (σc) פי 5.7, ועלייה ביחס השיכוך (δ השיזוף) פי 2.8.
| אזור | פרמטר | סמל | יחידה | הגדרה | משמעות | ||||
| משטר ויסקואלסטי ליניארי (LVR) | מודולוס מורכב | G* | אבא | התנהגות ויסקואלסטית מייצגת במשטר הליניארי | התנגדות כוללת לדפורמציה של הרשת המולקולרית | ||||
| G* = σ/γ | |||||||||
| מודולוס אלסטי | G' | אבא | גמישות החומר במשטר הליניארי | קשיחות המבנה המולקולרי במנוחה, הקשורה לנוקשות הרשת המולקולרית | |||||
| →0 : רך →∞ : נוקשה |
|||||||||
| מודולוס צמיג | G" | אבא | צמיגות החומר במשטר הליניארי | אובדן אנרגיה בלתי הפיך בזמן שהמבנה נע תחת עומס נמוך מאוד | |||||
| →0 : מוצק טהור →∞ : פיזור |
|||||||||
| גורם שיכוך | δ שזוף | ללא יחידה | גורם דעיכה במשטר הליניארי | גורם פיזור אנרגיה, הקשור למורפולוגיה של הרשת המולקולרית. כל שינוי מצביע על שינוי באופי המולקולרי. | |||||
| tan δ= G''/G' | →0 : מוצק טהור =1: מעבר אדמדם/נוזלי →∞ : נוזל טהור |
||||||||
| ג'ל פוינט | זן קריטי או קרוסאובר | γג | ללא יחידה | מאמץ בעת מעבר מג'ל להתנהגות זרימה | יכולת המתיחה של הג'ל, העיוות הכולל הדרוש כדי להתחיל זרימה או לשבור מוצק | ||||
| →0 : שביר →∞ : גמיש |
|||||||||
| מתח תשואה קריטי או מוצלב | σג | אבא | מתח בעת מעבר להתנהגות זרימה | חוזק הג'ל, כמות הכוח הדרושה כדי להתחיל זרימה או לשבור מוצק | |||||
| →0 : חלש →∞ : חזק |
|||||||||
טבלה 1: מאפייני מודולי ויסקואלסטיים ליניאריים ונקודות ג'ל הנמדדים על ידי מד הספסלים. המכשיר מבצע מדידות מהירות באמצעות תנודה דינמית עם טאטוא זן גזירה כדי לספק תכונות ויסקואלסטיות ליניאריות (G', G", G*, ו-tan δ) מודולי ונקודת ג'ל (γc ו-σc) תוך כ-5 דקות. פרמטרים, סמלים, יחידות ותיאור קצר של המדידות מסופקים.
איור 1: מדידות של התכונות הוויסקואלסטיות של תמיסות PEO וליחה SA. פתרונות של 8 מד"א PEO הוכנו בריכוזים של 1%, 1.5%, 2%, 2.5% ו-3%. ריר SA נקטף במהלך הליך ברונכוסקופיה. לצורך מדידות באמצעות הרומטר של הספסל, נעשה שימוש בלוחות מחוספסים של 25 מ"מ וב-500 μL של הדגימה. עבור המדידות באמצעות rheometer בתפזורת המסורתית, לוחות חלקים מקבילים 20 מ"מ ו 30 μL של פתרונות PEO שימשו. שתי המדידות הופעלו בתדר של 1 הרץ. (A) עקומות שהתקבלו ממחזור יחיד המנתחות 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, ו-3% 8 MDa PEO, והראו את האבולוציה של המודולוס האלסטי (G') בכחול (i) ומודולוס צמיג (G") באדום (ii). (B) עקומות המשווה בין מודולי אלסטי (i) וצמיג (ii) לצורך הגדלת הריכוזים של תמיסות PEO, שנותחו על ידי רהומטרים בנצ'טופ וריאומטרים מסורתיים במתח של 5%. (C) עקומות המציגות את האבולוציה של G' ו-G" של ריר SA, הנמדדות על ידי מד הספסל. חץ מציין זן מוצלב (γc), המציין מעבר מהתנהגות רכה-מוצקה להתנהגות דמוית נוזל. (D) גרפים המציגים שלוש מדידות משוכפלות של (i) G*, (ii) G' ו-(iii) G" ערכים עבור 1.5% PEO (פסים שחורים) וליחה SA (פסים אפורים) במשטר הוויסקואלסטי הליניארי (LVR) או במתח של 5%, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ההשפעות של טיפול ב-TCEP על הצמיגות של ריר SA. ריר SA נותח לפני (לא מטופל או NT) ואחרי טיפול TCEP (TCEP). הטיפול כלל הוספת 2 μL של תמיסת TCEP של 5 mM לתוך 500 μL aliquots (ריכוז TCEP סופי של 20 μM). דגימות שטופלו ב- NT ו- TCEP דוגרו במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וערבבו על ידי הסטת תחתית הצינור כל 2 דקות לפני הניתוח. המדידות בוצעו תחת מתח מתנדנד בתדר של 1 הרץ. (A) עקומות מריר SA שטופלו ב-NT וב-TCEP מראות את האבולוציה של (i) elastic (G') ו-(ii) מודולי צמיג (G"). הקו המקווקו השחור האופקי מציין את משטר הוויסקואלסטי הליניארי (LVR) והקו המקווקו השחור האנכי מציין את ההתייחסות למתח של 5% במקרה שלא ניתן היה לקבוע LVR. (B) השוואה בין מודולוס מורכב (G*), מודולוס אלסטי (G'), מודולוס צמיג (G"), יחס שיכוך (δ שיזוף), זן קרוסאובר (γc) ומתח תשואת קרוסאובר (σc) של ריר מטופל NT ו-TCEP הנגזר מהעקומות המתאימות. בוצע ניתוח סטטיסטי, וערכי p נרכשו באמצעות מבחני t זוגיים. הערכים עבור כל הגרפים מוצגים כ- ±SEM. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התכונות הויסקואלסטיות הייחודיות של ריר חיוניות לשמירה על דרכי הנשימה הבריאות. גורמים פנימיים וחיצוניים יכולים לשנות את התכונות הביופיזיות של ריר דרכי הנשימה, ולגרום לסיבוכים קליניים האופייניים למחלות חסימתיות ריריות. לפיכך, ניתן לשקול מעקב אחר שינויים בצמיגות הריר במהלך הערכות של מצב המחלה וחקר טיפולים המפחיתים את צמיגות הריר. מחקרים אמפיריים משנות ה-80 של המאה ה-20 הדגימו מתאם חזק בין ריאולוגיה של ריר לבין פינוי דרכי הנשימה באמצעות רומטר חרוזים מגנטי23,24. בשנים האחרונות התפתחה הריאולוגיה כדי לנצל מספר טכניקות המנתחות ריר בקני מידה שונים. לדוגמה, מבחנים מיקרו-ריולוגיים משתמשים בגששים מיקרוסקופיים כדי לתאר תכונות ריר מקומיות המבוססות על תנועה של חלקיקים מגנטיים או פלואורסצנטיים בגודל מיקרומטר. עם זאת, מכיוון שטכניקה זו משתמשת בנפחי דגימות קטנים, ייתכן שיהיה קשה להשיג נתונים מייצגים המתארים דגימות הטרוגניות כגון כיח. יתר על כן, מבחני מיקרו-ריאולוגיה דורשים מיקרוסקופים ברזולוציה גבוהה, מיומנויות חישוב משמעותיות וניתוחים גוזלים זמן רב, ולכן אינם מתאימים לשימוש נרחב במעבדה או במרפאה.
בעוד שמיקרו-ריאולוגיה ומקרו-ריאולוגיה אינן ניתנות להשוואה בדרך כלל, מגבלות דומות חלות על התקנים ותיקים, כגון רהומטרים בתפזורת של לוחות קונוסים/מקבילים. מקרוהיאולוגיה מבוצעת באמצעות מכשירים מדויקים המצוידים בקונוסים מסתובבים, לוחות, כוסות ו /או רוטורים במידות שונות כדי למדוד מומנטים קטנים ביותר ותזוזות עד תת-nN. m ו- sub Å טווחים. כדי להגיע לדיוק כה גבוה, רוב הריאומטרים המסחריים דורשים חיבור ישיר עם מערכת אספקת אוויר דחוס וקירור בסביבה נטולת שמן, אבק או רעש ועם טמפרטורת סביבה ולחות מבוקרות כדי למנוע היווצרות חפצים. בנוסף, בעוד שרומטרים מסורתיים בתפזורת יכולים למדוד מגוון רחב של חומרים באמצעות התאמה של משתנים ספציפיים, כיול מכשירים אלה לוקח זמן משמעותי ודורש הכשרה נרחבת.
לעומת זאת, הריאומטר של Rheomuco תוכנן במיוחד כדי למדוד את התכונות הוויסקואלסטיות של ריר וכיח ודורש צעד כיול יחיד כדי לבצע מדידות ויסקואלסטיות ליניאריות ונקודות ג'ל תוך דקות. מכשיר ספסל זה משתמש בפרוטוקול פשוט וסטנדרטי כדי להפיק מדידות ויסקו-אלסטיות מהירות ומדויקות ללא צורך בהכשרה מקיפה בכיול מכשירים או בניתוח/חישוב נתונים ריאולוגיים. המכשיר פועל על ידי מדידת מומנט ותזוזה בעקבות תנודות עם תזוזה זוויתית מבוקרת כדי לייצר עקומת טאטוא מתח ולהקים משטר ויסקואלסטי ליניארי או LVR (אזור של תגובה ויסקואלסטית אחידה למתח, המסומן בקו מקווקו אופקי באיור 2A), לפני שהוא מגיע לנקודה שבה הדגימה מניבה. ברוב המקרים, דגימות כיח נמצאות בתוך ה-LVR בטווח הזן של 1%-10%. כאשר LVR אינו מזוהה, הערך במתח של 5% מוזכר בדרך כלל כדי לדווח על המאפיינים הוויסקואלסטיים של המדגם. היעדר LVR שזוהה אינו פוסל את המדידה, אלא משקף דגימה שתכונותיה נבדלות (פלסטיות יותר) מאלו של רוב הדגימות. הרגישות של מכשיר זה מותאמת לצרכים של נוזלים צמיגים ואלסטיים הקרובים לליחה תוך מתן סובלנות גבוהה לרעש מכני, מה שהופך אותו לאידיאלי לחקר נוזלים ביולוגיים במסגרות קליניות; עם זאת, ייתכן שלא יתאים לחקור חומרים ויסקואלסטיים אחרים עם נמוך במיוחד (למשל, רוק) או גבוה במיוחד (למשל, זפת פחם) אלסטי או מודולי צמיג כתוצאה מפרמטרים מוגבלים של תוכנה וחוסר יכולת לתפעל משתנים כגון צורת צלחת, משטח, מרחק ותדירות סיבוב. המדידות הריאולוגיות התלויות בריכוז ב-PEO 8 MDa (איור 1) אפשרו את הערכת הרגישות (כלומר, הגבול התחתון של הגילוי) של מכשיר זה, שהוא בין 0.3% ל-0.4% מ-8 MDa PEO או <0.05 Pa עבור G*. עם זאת, לא ניתן היה לקבוע גבול עליון בשל הקושי לבודד ריכוזי PEO גבוהים מ-3%. אף על פי כן, המכשיר הצליח לדווח על G' ו-G" עבור 3% 8 MDa PEO, שהוא יותר ויסקואלסטי מדגימות ריר SA (G גדול פי 5 בערך ו-G גדול פי 25 בהשוואה ל-SA), מה שמרמז על טווח דינמי רלוונטי לביו-ספסימנים של ריר. יש לציין כי כדי לקבל מדידות מדויקות במהלך תנודות, נפח מתאים של הדגימה חייב להיות ממוקם במרכז הצלחת ללא נוכחות של בועות. במהלך טעינת הדגימה, נפח לא מספיק, בועות אוויר ו/או מיקום מחוץ למרכז ייצרו מגע לא מספיק עם הלוחות, וכתוצאה מכך ערכים מוקלטים נמוכים יותר. לעומת זאת, הצפת דגימה תיצור לחץ גזירה מוגזם עקב כוחגרר נוסף 25.
מחקר זה מתאר כיצד לעבד, לאחסן ולטפל בדגימות ריר עבות מיד עם האיסוף. אחד האתגרים העיקריים העומדים בפני מחקרים על ריאולוגיה של כיח הוא האופי ההטרוגני של דגימות אלה ופיתוח גישות מדידה סטנדרטיות. כיח הוא חומר צפוי שלעתים קרובות מזוהם ברוק המכיל חיידקים ואנזימי עיכול שיכולים לשנות במהירות את רשת המוצין ולהשפיע על צמיגות הריר. לכן, חשוב להסיר את הרוק מדגימות כיח מיד עם האיסוף ו/או לפני ההומוגניות. מטבע הדברים, ריר הוא דביק וקשה לטיפול, אך השימוש בפיפטות תזוזה חיוביות מקל על הומוגניזציה מבלי להתפשר על רשת המוצין, מאפשר הכנה מדויקת של aliquot, ומפשט את העמסת הדגימות. בהתאם לניסוי, הומוגניזציה של דגימה עשויה שלא להידרש אך יכולה למזער את השונות בין השכפולים. בעוד עיבוד כיח מיד לאחר האיסוף מומלץ, ריר דרכי הנשימה שומר על תכונות ביופיזיות ייחודיות לאחר הקפאה והפשרה. עם זאת, הקפאה והפשרה יכולות להשפיע על הריאולוגיה הכוללת של דגימה. לכן, יש להשוות רק דגימות שעברו מחזורי הקפאה/הפשרה דומים זו לזו. כאשר בודקים את ההשפעות של חומרים ריריים, הומוגניזציה ראשונית של דגימה חשובה כדי לייעל את הדיפוזיה המורכבת. אספקת תרופות לריאות באמצעות שאיפה מגבילה את הנפחים הניגשים למטרה (כלומר, תקע ריר), אך ההכאה המתמדת של הריסונים בשילוב עם הובלת ריריות יוצרת ערבוב מסוים של התרופה והמטרה. כדי לדמות טיפול in vivo, כמויות קטנות של סוכן פרמקולוגי ניתן ליישם ישירות על דגימות בהדרגה מעורבב על ידי תסיסה קבועה לאורך זמן הדגירה. עם זאת, ניתן לחקור שיטות טיפול אחרות (למשל, ערפול תרופות על הדגימה בצלחת פטרי). תסיסה עדינה במהלך הדגירה תבטיח חדירה מתקדמת של תרופות מבלי להתפשר על רשת המוצין עקב הפרעה מכנית (למשל, מערבולת או סוניקציה). נכון לעכשיו, TCEP אינו משמש במסגרות קליניות, אך ריאגנטים ריריים אחרים, כגון NAC, rhDNase, P-2119, ARINA-1 ו- PAAG נחקרים עבור מגוון רחב של מצבים חסימת רירית 21,26,27,28. לצורך אימות קונספט, הוכח כי ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות שינויים משמעותיים בליחה אסתמטית בתגובה לטיפול ב- TCEP. ריר דמוי נוזל יותר הופק על ידי טיפול בחומר מחזר, הניכר מסמני נקודת הוויסקואלסטיים והג'ליניאריים הנמוכים יותר, מה שמרמז על שיפור ביכולת הסילוק. למרות ש-rhDNase הפיק יתרונות קליניים עצומים ב-CF, הוא אינו משמש בדרך כלל למחלות אחרות של חסימת ריריות, ככל הנראה בשל ריכוזי דנ"א חוץ-תאיים נמוכים יותר באופן כרוני. עם זאת, במהלך זיהום נגיפי וחיידקי חריף, תגובה דלקתית חזקה יכולה לגרום באופן זמני לריכוז דנ"א חוץ-תאי גבוה ולהפחית את מרווח דרכי הנשימה. לפיכך, בדיקות ex vivo מהירות של יעילות rhDNase על בסיס כל מקרה לגופו יכולות לספק הדרכה לטיפול בדלקת ריאות הנגרמת על ידי נגיפים וחיידקים. זה יכול להיות בעל ערך רב במיוחד על רקע מגיפת COVID-19, הנגרמת על ידי הנגיף הנשימתי, SARS-CoV-2.
לסיכום, המכשיר המתואר מספק מדדים ריולוגיים אפשריים, מהירים ומדויקים. מאפיינים אלה מספקים את הפוטנציאל לחקור ולנטר את מצב מחלות דרכי הנשימה, כמו גם לבדוק את ההשפעות של תרכובות ריריות חדשות. המהירות והפשטות של המדידות מאפשרות לבצע בדיקות מבלי לגרום לסיבוכים הקשורים להקפאה ו/או להשפעות זמניות של אחסון או הובלה ממושכים תוך הפיכת בדיקות אלה לאפשריות במגוון רחב של מסגרות. בסופו של דבר, ניתן לבחון גישה זו לצורך בחירת טיפולים מותאמים אישית מתוך פאנל של אפשרויות, המאפשרות התאמה בזמן אמת של הטיפול בחולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא
Acknowledgments
מאמר זה נתמך על ידי מענקים מ-Vertex Pharmaceuticals (פרס Ehre RIA) וממחקר EHRE20XX0 הנתמך על ידי CFF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary Pistons Tips | Gilson | CP1000 | |
| Discovery Hybrid Rheometer-3 | TA Instruments | DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests. |
|
| Graphing Software | GraphPad Prism | GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis | |
| Microcentrifuge Tube | Costar | 3621 | |
| Peltier plate | TA Instruments | Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE |
|
| Polyethylene oxide | Sigma | 372838 | 8 MDa polymer used as mucus simulant |
| Positive Displacement Pipette | Gilson | M1000 | Pipette used for handling viscous solutions |
| Rheomuco | Rheonova | Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests. | |
| Rough Lower Geometries | Rheonova | D-1811-007 | 25mm Diameter |
| Rough Upper Geometries | Rheonova | U-1811-007 | 25mm Diameter |
| Smooth Upper Parallel Plate | TA Instruments | 20mm Diameter | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Sigma | 646547-10X1ML | TCEP: Potent reducing agent. |
References
- Button, B., et al. A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia. Science. 337 (6097), 937-941 (2012).
- Boucher, R. C. Muco-obstructive lung diseases. New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).
- Rose, M. C., Voynow, J. A. Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease. Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).
- Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 136-145 (2014).
- Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. Mucus, mucins, and cystic fibrosis. Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).
- Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus. Physiological Reviews. , (2022).
- Lin, V. Y., et al. Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance. European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).
- Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).
- Tomaiuolo, G., et al. A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties. PloS One. 9 (1), 82297 (2014).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).
- Zahm, J. M., et al. Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus. The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).
- Fuchs, H. J., et al. Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group. The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).
- Hubbard, R. C., et al. A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis. The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).
- Shak, S. Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis. Chest. 107, 2 Suppl 65-70 (1995).
- Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function. Chest. 154 (2), 370-377 (2018).
- Donaldson, S. H., et al. Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).
- Patarin, J., et al. Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).
- Markovetz, M. R., et al. Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).
- Ramsey, K. A., et al. Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).
- Dunican, E. M., et al. Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).
- Ehre, C., et al. An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).
- Morrison, C. B., et al. Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration. The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).
- Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease. European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).
- Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport. Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).
- Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry. Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).
- Hancock, L. A., et al. Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice. Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).
- Adewale, A. T., et al. Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).
- Fernandez-Petty, C. M., et al. A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus. JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).
