Summary
Целью этого протокола является предоставление подробных рекомендаций по надлежащей подготовке образцов для анализа липидов и метаболитов в небольших тканях, таких как мозг дрозофилы , с использованием масс-спектрометрии с помощью матрицы лазерной десорбции / ионизации (MALDI).
Abstract
Липидное профилирование, или липидомика, является хорошо зарекомендовавшим себя методом, используемым для изучения всего содержания липидов в клетке или ткани. Информация, полученная от липидомики, ценна при изучении путей, участвующих в развитии, болезни и клеточном метаболизме. Многие инструменты и приборы помогли проектам липидомики, в первую очередь различные комбинации методов масс-спектрометрии и жидкостной хроматографии. Матричная лазерная десорбция / ионизация масс-спектрометрии (MALDI MSI) недавно стала мощным методом визуализации, который дополняет традиционные подходы. Этот новый метод предоставляет уникальную информацию о пространственном распределении липидов в тканевых компартментах, которое ранее было недостижимо без использования чрезмерных модификаций. Выборочная подготовка подхода MALDI MSI имеет решающее значение и, следовательно, находится в центре внимания настоящего документа. В этой статье представлен быстрый липидный анализ большого количества мозгов дрозофилы , встроенных в соединение оптимальной температуры резания (OCT), чтобы обеспечить подробный протокол подготовки мелких тканей к анализу липидов или метаболитному и мелкомолекулярному анализу с помощью MALDI MSI.
Introduction
Липиды участвуют в широком спектре биологических процессов и могут быть широко классифицированы на пять категорий на основе их структурного разнообразия: жирные кислоты, триацилглицерины (TAGs), фосфолипиды, липиды стеринов и сфинголипиды1. Фундаментальные функции липидов заключаются в обеспечении источников энергии для биологических процессов (т.е. TAGs) и образовании клеточных мембран (т.е. фосфолипидов и холестерина). Тем не менее, дополнительные роли липидов были отмечены в развитии и заболеваниях и были широко изучены в биомедицинской области. Например, отчеты показали, что жирные кислоты разной длины могут играть уникальную терапевтическую роль. Короткие цепи жирных кислот могут быть вовлечены в защитные механизмы против аутоиммунных заболеваний, цепи жирных кислот средней длины производят метаболиты, которые могут смягчать судороги, а длинные цепи жирных кислот генерируют метаболиты, которые могут быть использованы для лечения метаболических нарушений2. В нервной системе было показано, что холестерин и фосфолипиды, полученные из глии, жизненно важны для синаптогенеза 3,4. Другие типы липидов показали многообещающие результаты в медицинских применениях, включая сфинголипиды, используемые в системах доставки лекарств, и сахаролипиды, используемые для поддержки иммунной системы 5,6. Многочисленные роли и потенциальные терапевтические применения липидов в биомедицинской области сделали липидомику — изучение путей и взаимодействий клеточных липидов — критической и все более важной областью.
Липидомика использует аналитическую химию для изучения липидома в больших масштабах. Основные экспериментальные методы, используемые в липидомике, основаны на масс-спектрометрии (МС) в сочетании с различными методами хроматографии и ионной подвижности 7,8. Использование РС в этой области выгодно из-за его высокой специфичности и чувствительности, скорости приобретения и уникальных возможностей для (1) обнаружения липидов и липидных метаболитов, встречающихся даже на низких и переходных уровнях, (2) обнаружения сотен различных липидных соединений в одном эксперименте, (3) выявления ранее неизвестных липидов и (4) различения липидных изомеров. Среди разработок в области РС, включая десорбционную электрораспылительную ионизацию (DESI), MALDI и масс-спектрометрию вторичных ионов (SIMS), MALDI MSI стала мощным методом визуализации, который дополняет традиционные подходы на основе MS, предоставляя уникальную информацию о пространственном распределении липидов в тканевых компартментах 9,10.
Типичный рабочий процесс липидомики состоит из пробоподготовки, сбора данных с использованием технологии масс-спектрометрии и анализа данных11. Изучение липидов и метаболитов в образцах привело к появлению методик по пониманию физиологических и патологических состояний обменных процессов в организмах. Хотя понимание биологических взаимодействий важно, чувствительность липидов и метаболитов затрудняет их изображение и идентификацию без красителей или других модификаций. Изменения в уровнях или распределении метаболитов могут привести к фенотипическим изменениям. Одним из инструментов, используемых для метаболомического профилирования, является MALDI MSI, метод визуализации in situ без меток, способный обнаруживать сотни молекул одновременно. Визуализация MALDI позволяет визуализировать метаболиты и липиды в образцах, сохраняя при этом их целостность и пространственное распределение. Предыдущая технология профилирования липидов включала использование радиоактивных химических веществ для индивидуального картирования липидов, в то время как визуализация MALDI отказывается от этого и позволяет одновременно обнаруживать ряд липидов.
Липидный обмен и гомеостаз играют важную роль в физиологии клеток, таких как поддержание и развитие нервной системы. Одним из существенных аспектов липидного обмена нервной системы является перемещение липидов между нейронами и глиальными клетками, которое опосредовано молекулярными липопротеинами-носителями, включая липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины высокой плотности (ЛПВП)12. Липопротеины содержат аполипопротеины (Апо), такие как ApoB и ApoD, которые функционируют как структурные блоки липидного груза и как лиганды для липопротеиновых рецепторов. Перекрестные помехи липидов нейрон-глия включают в себя несколько игроков, таких как ApoD, ApoE и ApoJ, полученные из глии, и их нейронные рецепторы ЛПНП (LDLRs)13,14. У дрозофилы аполипофорин, член семейства ApoB, является основным носителем липидов гемолимфы15. Аполипофорин имеет два тесно связанных липофориновых рецептора (LpR), LpR1 и LpR2, которые являются гомологами LDLR15,16 млекопитающих. В предыдущих исследованиях было обнаружено, что астроцитарно-секретируемый липокалин Glial Lazarillo (GLaz), гомолог дрозофилы человеческого ApoD, и его нейрональный рецептор LpR1 совместно опосредуют липидный шаттлинг нейрон-глия, тем самым регулируя морфогенез дендрита17. Поэтому было высказано предположение, что потеря LpR1 вызовет снижение общего содержания липидов в мозге дрозофилы. MALDI MSI будет подходящим инструментом для профилирования липидного содержимого в небольших тканях мозга дрозофилы LpR1−/−, как показано в этом исследовании.
Несмотря на растущую популярность MALDI MSI, высокая стоимость и экспериментальная сложность прибора часто препятствуют его внедрению в отдельных лабораториях. Таким образом, большинство исследований MALDI MSI проводятся с использованием общих основных средств. Как и в случае с другими применениями MALDI MSI, тщательный процесс подготовки образцов для липидомики имеет решающее значение для достижения надежных результатов. Однако, поскольку подготовка образцовых слайдов обычно выполняется в отдельных исследовательских лабораториях, существует вероятность вариаций в приобретении MALDI MSI. Чтобы бороться с этим, эта статья направлена на предоставление подробного протокола для пробоподготовки небольших биологических образцов до измерения MALDI MSI с использованием анализа липидов большой группы взрослых мозгов дрозофилы в режиме положительных ионов в качестве примера11,17. Однако некоторые классы фосфолипидов и большинство мелких метаболитов благоприятно обнаруживаются с помощью визуализации MALDI в режиме отрицательных ионов, который был описан ранее11. Таким образом, с помощью этих двух примеров исследований мы надеемся предоставить подробные протоколы пробоподготовки различных комбинаций: отдельно стоящая большая ткань против встроенной мелкой ткани, оттаивание по сравнению с установкой с теплым скольжением и режим положительных ионов против режима отрицательных ионов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Встраивание головки мухи
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура занимает ~45-60 мин.
- Подготовьте оптимальную стадию температурного компаунда резки (OCT compound) с плоской поверхностью.
- Добавьте OCT в пластиковый криомольд (15 мм x 15 мм x 5 мм) на половину глубины криомольда и избегайте образования пузырьков. Оставьте плесень на ровной поверхности на несколько минут, а затем переложите ее на сухой лед.
- Держите криомольд плоским на сухом льду и позвольте ОКТ сформировать плоскую и ровную поверхность. Подождите, пока OCT полностью затвердеет в пресс-форме. Немедленно используйте замороженные стадии OCT или храните их при температуре −80 °C.
- Обезболивайте взрослых мух с помощью CO2 (т.е. подушечки CO2 ).
- Приготовьте чашку Петри, содержащую кусочек лабораторной салфетки. Используйте воду для увлажнения части салфетки, чтобы уменьшить статическое электричество. Держите салфетку наполовину влажной и наполовину сухой.
- При рассечении прицела 1 используйте щипцы, чтобы разрезать голову мухи. Каждый раз соберите по 4-5 головок и положите их на сухую область лабораторной салфетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор из 4-5 голов занимает ~ 2 минуты.
- Перенесите стадию OCT из сухого льда в область рассечения.
- Возьмите стадию OCT от сухого льда до микроскопа 2, немедленно перенесите головки на стадию OCT и быстро расположите их, что занимает ~ 30 с, чтобы избежать таяния OCT. Оставьте ~ 1 мм пустого пространства вокруг каждого мозга мухи, чтобы обеспечить адекватную поддержку от OCT и 4-5 мм пустого пространства от края блока, чтобы обеспечить достаточное пространство для обработки секции. Если хоботок слишком длинный, удалите кончик; если он не слишком длинный, сохраните его в целости и сохранности. Поместите стадию OCT обратно на сухой лед и дайте ей оставаться включенной в течение ~ 3 минут, чтобы убедиться, что стадия OCT остается замороженной и твердой.
- Когда стадия OCT вернется на сухой лед и будет ждать затвердевания, соберите еще один раунд головок. Повторите шаги 1.2 и 1.3, чтобы перенести дополнительные образцы в оставшееся пространство на сцене.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого генотипа обычно готовят восемь головок, а четыре генотипа используются на одном этапе ОКТ в этой лаборатории. - Используйте два микроскопа для рассечения, бок о бок, чтобы избежать изменения фокуса и увеличения времени, затрачиваемого на перенос и расположение головок на стадии OCT, а также снизить риск плавления стадии OCT.
- После того, как все головки мух выровнены, дайте стадии OCT посидеть на сухом льду еще 5-10 минут.
- Уберите стадию OCT подальше от сухого льда, положите ее на ровную поверхность (скамейку), а затем, быстро, добавьте большое количество соединения OCT, чтобы покрыть все образцы и заполнить весь криомольд, что занимает ~ 3 с.
- Немедленно перенесите криомольд обратно на сухой лед и заморозьте весь блок OCT, содержащий внедренные ткани. Оставьте стадию OCT на сухом льду еще 5-10 минут. Пометьте образцы на полях криомольда.
- Храните замороженные образцы при температуре −80 °C до готовности к разделению.
2. Криосечение ткани
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с горками из оксида индия-олова (ITO) всегда надевайте перчатки, чтобы избежать загрязнения тканей. Также рекомендуется носить маску, чтобы избежать дыхания непосредственно на горке.
- Подтвердите сторону с покрытием ITO, проверив проводимость слайдов ITO с помощью вольтметра, настроенного на сопротивление. Отметьте сторону с измерением сопротивления как сторону, к которой нужно прилипнуть к ткани. Нанесите метку и всегда устанавливайте лабораторную салфетку на нижнюю часть слайда, чтобы избежать загрязнения слайда.
- Дайте тканям уравновеситься в криостатной камере в течение 30-45 мин.
- Чтобы избежать плавления OCT, поместите все необходимые инструменты, такие как щипцы и кисть художника с тонким наконечником, в криостатную камеру заранее, чтобы предварительно охладить их.
- Очистите криостат, желательно с 70% этанолом. Протрите рулонную пластину и ступень и удалите использованные лезвия. Используйте дополнительные чистые салфетки, чтобы убедиться, что этанол испарился и что все поверхности высохли до начала секционирования.
- Отрегулируйте температуру криостатной камеры и головки образца в соответствии с типом ткани (например, −14 °C для печени, −20 °C для мышц и −25 °C для кожи10; −18 °C для голов мух в этом протоколе).
- Установите ткань на держатель образца с помощью OCT. Будьте осторожны, чтобы использовать достаточное количество OCT, чтобы покрыть основание блока OCT и установить блок как можно более плоским.
- Поместите чистое лезвие в сцену и зафиксируйте его. Расположите головку образца по направлению к ступени по мере необходимости для достижения желаемого угла резания.
- Поместите блок образца в ориентацию, где все генотипы/группы обработки расположены вертикально к лезвию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает последовательную плоскость резки и позволяет избежать перекрестного загрязнения из разных групп. При разрезании другого блока ткани переключитесь на новое лезвие между образцами, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
- Поместите блок образца в ориентацию, где все генотипы/группы обработки расположены вертикально к лезвию.
- Начинайте резку толстыми срезами (50-100 мкм) до тех пор, пока не будет найдена интересующая область (например, желаемая область мозга).
- Постоянно смахивайте лишние части предварительно охлажденной кистью художника, чтобы сохранить сцену в чистоте.
- Измените толщину секций на 10-12 мкм, как только будет достигнута нужная область.
- Отрегулируйте температуру камеры немного по мере необходимости. Например, установите более высокую температуру, если секция имеет тенденцию к отслаиванию или легко развалу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемая температура для блоков OCT составляет −18 °C.
- Отрегулируйте температуру камеры немного по мере необходимости. Например, установите более высокую температуру, если секция имеет тенденцию к отслаиванию или легко развалу.
- Тщательно соберите нужный раздел и приклейте его к слайду ITO. Выполните эту операцию в криостатной камере.
- Возьмите слайд ITO комнатной температуры и расположите его над секцией, осторожно и быстро подойдите к секции, чтобы секция прилипла к слайду, не оставляя следов на стадии криостата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Oct будет плавиться и цепляться за слайд.
- Возьмите слайд ITO комнатной температуры и расположите его над секцией, осторожно и быстро подойдите к секции, чтобы секция прилипла к слайду, не оставляя следов на стадии криостата.
- Поместите слайд в сторону в стойку или лабораторную салфетку вне криостата между коллекциями нескольких секций.
- Если требуется сравнение между различными образцами одной и той же когорты, поместите разделы из нескольких образцов на один слайд для одновременного анализа и минимальных вариаций. При необходимости раздельно два слайда, так как держатель мишени MALDI может вместить две горки за один прогон.
- Транспортируйте слайды в вакуумной коробке в осушитель с осушителем в качестве нижнего слоя. Высушите горки под вакуумом в течение 30-60 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, если лаборатория не оборудована вакуумным осушителем, слайды следует держать при температуре −20°C на протяжении всего процесса до хранения при температуре −80°C в течение 24 ч или транспортировки на сухом льду во избежание порчи липидов или метаболитов. - Переходим к матричному осаждению. Используйте 2,5-дигидроксибензойную кислоту (DHB) в метаноле/воде (70/30, v/v) в качестве матрицы.
- Если слайды не запускаются немедленно, либо храните слайды при температуре −80 ° C (до 1 месяца для секций мозга мухи и 6 месяцев для секций мозга грызунов), либо немедленно отправляйте образец в основные объекты MALDI с достаточным количеством сухого льда. Для оптимального хранения и транспортировки поместите слайды в транспортер для слайдов и надежно закройте отверстие восковой пленкой. Запечатайте пакетом-молнией, поместите его в другой пакет-молнию, содержащий влагопоглотители, и пометьте снаружи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к предыдущей работе для последующих этапов сканирования слайдов, матричного осаждения и процедур визуализации MALDI11. - Выполнить матричное осаждение с помощью автоматического матричного опрыскивателя HTX M5 и раствора DHB 40 мг/мл в метаноле/воде (70/30, v/v). Распыляйте матрицу с заданным расходом 0,12 мл/мин и температурой сопла 85 °C в течение 10 проходов. Используйте давление газа N2 10 фунтов на квадратный дюйм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если давление газа N2 в опрыскивателе опущено ниже 5 фунтов на квадратный дюйм, предохранительный механизм в опрыскивателе немедленно отключит нагреватель, чтобы избежать повреждения опрыскивателя со скоростью распыления 1 300 мм / мин, расстоянием между гусеницами 2 мм, скоростью потока 3 л / мин и высотой сопла 40 мм. - Используйте прибор MALDI time of flight (TOF) MS (см. Таблицу материалов) в режиме положительных ионов для получения массового спектра в пределах диапазонов масс от м/з 50 до 1000.
- Чтобы откалибровать прибор, нанесите 0,5 мкл эмульсии красного фосфора в ацетонитриле на слайды ITO и используйте его спектры для калибровки прибора в диапазоне масс 50-1000 м/з путем применения квадратичной калибровочной кривой2.
- Установите диаметры лазерных пятен на Средний, так как это модулированный профиль луча для ширины растра 40 мкм, и соберите данные изображения, суммируя 500 снимков с частотой повторения лазера 1000 Гц на позицию массива.
- Используйте программное обеспечение (см. Таблицу материалов) для записи и обработки спектральных данных. Выполните анализ данных визуализации с использованием нормализации среднеквадратического значения (RMS) для генерации ионных изображений при ширине бункера ±0,10 Да. Выровняйте спектры как OCT, так и мозговой ткани из одного и того же эксперимента с использованием программного обеспечения для оценки перекрывающихся пиков и интерференции подавления ионов OCT (дополнительный рисунок S1). После эксперимента обработайте слайды MALDI, содержащие образцы тканей, окрашиванием гематоксилином и эозином (H&E), как описано ранее11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Было высказано предположение, что потеря нейронального рецептора LpR1 астроцитарно-секретируемого липокалина Glial Lazarillo (GLaz), гомолога дрозофилы человеческого ApoD, способна вызвать снижение общего содержания липидов в мозге дрозофилы . Чтобы проверить это, MALDI MSI был использован для профилирования липидов в мозге LpR1−/− мутантов и дрозофилов дикого типа, что подробно описано ниже.
Эксперимент проводился в соответствии с рабочим процессом, показанным на рисунке 1. Мозги взрослых мух были собраны, как описано выше. Они были встроены в OCT, а сухой лед использовался для замораживания блока OCT. Тканевый блок OCT был криосекционирован при толщине 12 мкм и при −18 °C как для головки образца, так и для камеры. Слайды ITO с установленными на них криосекциями высушивали в вакууме в течение 30 мин при комнатной температуре. Далее матричное осаждение проводили с помощью автоматического матричного опрыскивателя HTX M5 и раствора DHB 40 мг/мл в метаноле/воде (70/30, v/v).
Прибор MALDI time of flight (TOF) MS Autoflex в режиме положительных ионов приобрел массовый спектр в пределах диапазонов масс от 50 до 1000 м/з. Спектр как OCT, так и мозговой ткани из одного и того же эксперимента был выровнен в SCiLS для оценки перекрывающихся пиков и интерференции подавления ионов OCT (дополнительный рисунок S1).
Результаты на рисунке 2 показывают выходные изображения из программного обеспечения для анализа данных MALDI MSI выбранных спектров m/z, где выбранные значения показали значительную разницу в распределении липидов между нокаутом LpR1 и дрозофилой дикого типа. Сканирование выявило общее снижение содержания липидов в мутанте LpR1−/−. Каждый спектр анализировали вручную, а идентификация анализируемого вещества достигалась путем перекрестных ссылок на базы данных METLIN и ранее опубликованные исследования 3,4. Триацилглицерин (TAG) и фосфатидилглицерин (PG) были высоко экспрессированы в контрольном мозге по сравнению с мутантом LpR1−/− (показывая до 10-кратного изменения TAG). Кроме того, диглицерин (DAG), фосфатидилхолин (PC) и фосфатидил-этаноламин (PE) также были минимально экспрессированы в мутантном генотипе LpR1−/−.
Рисунок 1: Рабочий процесс масс-спектрометрической визуализации MALDI-TOF. (А) Мозг дрозофилы выровнен в ОКТ, помещенный поверх сухого льда. (Б-Д) Тканевый блок криосекционируется на участки толщиной 12 мкм при −15 °C. Секция сплющивается с помощью предварительно охлажденной щетки и расплавляется на покрытой ITO стороне стеклянной горки, выдерживаемой при комнатной температуре. (E) Слайд маркируется фидуциальными маркерами, покрывается матрицей и помещается в инструмент MALDI. (F) MalDI-изображение мозга дрозофилы получено с разрешением 40 мкм с использованием DHB в качестве матрицы. Области глаз (красный, m/z 370.2), головной ткани (зеленый, m/z 184.1) и мозга (синий, m/z 788.6) показаны на наложенном многоканальном изображении. (G) Окрашивание H&E выполняется на том же участке ткани после MALDI MSI. (H) Рабочий процесс подготовки, хранения и транспортировки проб. Шкала стержней = 500 мкм (F,G). Сокращения: MALDI-TOF = матричная лазерная десорбция/время полета ионизации; OCT = оптимальная температура резания соединения; ITO = оксид индия-олова; DHB = 2,5,-дигидроксибензойная кислота; H&E = гематоксилин и эозин; MSI = масс-спектрометрическая визуализация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения из анализа MALDI MS, показывающие общее снижение содержания липидов в мутантном мозге LpR1−/− . Показаны репрезентативные H&E-окрашенные участки мозга взрослой мухи (слева). Липидные виды, их соответствующие значения m/z и масштабы тепловой карты указаны так, как указано. В нижней части средняя складка сокращения мутанта LpR1−/− по сравнению с контрольной группой по меньшей мере четырех биологических реплик показана в виде чисел рядом со стрелками. Шкала = 1 мм. Эта цифра была изменена по сравнению с Yin et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Масс-спектры ткани мозга ОКТ и дрозофилы . Криосекции блока OCT мозга Drosophila из рисунка 1 были равномерно покрыты матрицей DHB до визуализации MALDI. Масс-спектр выбранной пустой области ОКТ и области мозговой ткани как у контрольных, так и у мутантных мух был показан в диапазоне m/z 1-1000 и m/z 520-900 (обогащенных липидами) соответственно. Интерференция OCT связана как с явлениями подавления ионов, так и с проблемами перекрывающегося сигнала. Сокращения: OCT = оптимальная температура резания компаунда; DHB = 2,5-дигидроксибензойная кислота; MALDI = матричная лазерная десорбция/ионизация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как было продемонстрировано в исследовании вариаций липидного состава в мозге дрозофилы мутантного и дикого типа, MALDI MSI может быть ценным методом визуализации без меток для анализа in situ молекулярных моделей распределения в органах мелких насекомых. Действительно, поскольку липиды распределены как в ткани мозга, так и в жировых телах голов дрозофилы, традиционные подходы к липидомике, основанные на жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (LC-MS), могут обнаруживать только комбинированные сигналы из обеих областей при использовании экстракции всей головки. В целом, дифференциальный анализ липидомики субрегионов в органах такого маленького насекомого, как дрозофила, является очень трудоемкой и сложной задачей для LC-MS подходов18. Это потребует рассечения этих регионов, что создает большие проблемы. Напротив, MALDI MSI обеспечивает адекватное разрешение для различения различных анатомических структур, даже в небольшом мозге дрозофилы. Преимущество минимального количества потребности в тканях по сравнению с обычным LC-MS также может быть применено к драгоценным образцам, таким как клиническая биопсия. Кроме того, образцы слайдов, подготовленные для MALDI MSI, можно было бы также изучить с помощью дополнительных методов, таких как TOF-SIMS и иммуногистохимия, что позволило бы интегрировать данные, полученные на основе междисциплинарных подходов19,20.
Одним из наиболее важных шагов в MALDI MSI является подготовка образца – часть эксперимента, которая объясняет большинство различий в результатах исследований метаболомики, проведенных в разных лабораториях21. Основная цель здесь состоит в том, чтобы обеспечить всеобъемлющий, но практичный протокол подготовки образцов для анализа липидов и метаболитов MALDI MSI в организмах размером с насекомые-дрозофилы в надежде помочь исследователям в реализации MALDI MSI в их исследованиях от базовой биологии до трансляционной науки.
В дополнение к мерам предосторожности для минимизации изменений в молекулярных профилях (как изобилии, так и пространственном распределении), как обсуждалось ранее11, при работе с небольшими тканями необходимо адаптировать несколько других методов. Во-первых, время между сбором биологической ткани и замораживанием в ОКТ должно быть сведено к минимуму, чтобы уменьшить вероятность посмертной ишемии21. Во-вторых, следует убедиться, что перед помещением ткани в блок подготовлена плоская стадия ОКТ, что имеет решающее значение для наличия участков из сопоставимых плоскостей через разные ткани во время сечения. В-третьих, вырезание мелкомасштабной биологической ткани или драгоценных образцов требует адекватной практики перед экспериментом. В то время как OCT помогает в разрезании четных участков, могут возникнуть осложнения с точки зрения скручивания или шелушения тканей. Для борьбы с керлингом следует дать секции отдохнуть на сцене в течение нескольких секунд, прежде чем снимать рулонную пластину. С двумя щетками одна из них может быть использована для удержания верхней части секции неподвижно, в то время как другая может быть использована для развертывания секции. Следует соблюдать осторожность, чтобы свести к минимуму контакт с тканью, в первую очередь работая с краями секций блока. В-четвертых, хотя метод оттепели может быть использован для меньшего количества мозгов мух (<10 мозгов), было бы невозможно перенести секцию, содержащую большое количество мозгов мух (>30 мозгов), на холодный слайд ITO без потери значительного количества мозгов, которые легко выпадут из секции блока после поднятия. Поэтому для быстрого анализа большого количества мозгов мух нужно использовать термоскользящее крепление. Примечательно, что разница температур между секцией OCT и слайдом приведет к тому, что секция будет цепляться и очень быстро прилипать к слайду. Следовательно, не следует прижимать теплый слайд к секции и криостатной ступени; вместо этого необходимо осторожно и быстро подойти к секциям, чтобы секция могла прикрепляться к слайду ITO, не касаясь стадии криостата. Мы не наблюдали каких-либо заметных следов участков, оставленных на стадии криостата, по сравнению с методом оттаивания-монтажа. В-пятых, равномерное и точное осаждение матрицы MALDI имеет решающее значение для получения достоверной и точной пространственной информации во время сбора. Рекомендуется использовать пустой слайд для проверки матричного осаждения на предмет надлежащего охвата, прежде чем переходить к слайду, содержащему образец.
Ожидается, что с ростом популярности и прогрессом MALDI MSI достигнет более широкой базы пользователей и станет стандартным инструментом для измерения молекулярной массы аналитов, таких как аминокислоты, метаболиты, липиды, пептиды и белки, а также другие небольшие молекулы, непосредственно извлеченные из биологических тканей10. Однако у него есть свои ограничения и проблемы. При подготовке хрупких и мелкомасштабных образцов для MALDI MSI для секционирования необходимы встраивающие агенты, такие как OCT. Однако ОКТ содержит комбинацию полимеров (поли(виниловый спирт), полиэтиленглицерин и бензалкония хлорид), которая создает полимерный фоновый сигнал, который может мешать сигналу анализируемого вещества22. Сообщалось, что альтернативные встраиваемые соединения, такие как желатин и карбоксиметилцеллюлоза (CMC), демонстрируют меньшие эффекты подавления ионов. Желатин показывает менее интенсивные сигналы, которые более рассеяны в диапазоне малой массы 100-600 м/з 20,23,24. CMC также использовался в MALDI MSI дрозофилы для визуализации метаболитов, таких как ГАМК, хотя он требует погружения головок в 70% этанол перед внедрением для оптимальной адгезии25.
Несмотря на тенденцию OCT к подавлению сигнала, этот протокол продолжает свое использование из-за превосходной способности OCT обеспечивать надежное секционирование большого количества образцов при сохранении морфологии мозга. Исследователи обнаружили, что, хотя желатин и CMC хорошо срезаются при высокой толщине, такой как 20 мкм, только OCT способен производить последовательные 12 мкм срезов надежно26. CMC и желатину не хватает структурной целостности и плотного удержания ткани, которую обеспечивает OCT, что устанавливает предел количества мелких тканей, таких как мозг мухи, которые должны быть размещены в одном блоке26. Сообщалось, что сигналы MS от встроенных в OCT секций мухи сопоставимы с сигналами, встроенными в желатин и CMC26. Наши неопубликованные данные также показали, что теплые, встроенные в OCT участки мозга мухи генерируют надежные липидные сигналы, сопоставимые с тканью, встроенной в оттаивающий желатин. В целом, из-за превосходной способности OCT сохранять целостность морфологии тканей и обеспечивать точное секционирование образцов по сравнению с другими встраивающими соединениями, его использование с образцами высокой хрупкости, такими как массивы мозга дрозофилы , остается вариантом. В этом сценарии следует проводить только относительную количественную оценку сравнения образцов из одного и того же эксперимента, но не абсолютную количественную оценку. Что касается нашего исследования модели дрозофилы в анализе липидов, был сделан вывод, что преимущества ОКТ перевешивают его ограничения. Кроме того, необходимо провести пробные эксперименты, чтобы проверить, будут ли сигналы MS целевых аналитов маскироваться сигналами OCT.
Кроме того, необходимо адаптировать несколько методов, чтобы свести к минимуму эффекты подавления ионов. Во-первых, следует обрабатывать образцы разных групп одновременно, чтобы обеспечить одинаковую степень подавления ионов, если таковая имеется. Во-вторых, при выборе области, представляющей интерес для сканирования MALDI, следует избегать области OCT и очерчивать только область ткани. Наконец, следует выбрать область пустого центра развертывания Office для сканирования в качестве отрицательного элемента управления, чтобы исключить сигналы из центра развертывания Office во время анализа данных.
Область липидомики возникла в начале 2000-х годов и быстро продвинулась в последние годы, во многом благодаря разработкам в области масс-спектрометрии, включая MALDI MSI27. Эти передовые методы помогли продвинуть область к биологическим и биомедицинским приложениям. Например, липидомика может быть использована в неврологических исследованиях, поскольку изменения в уровнях и составе липидов мозга могут быть использованы в качестве биомаркеров заболевания. Кроме того, липидомика привела к идентификации новых сигнальных молекул, разработке тестов эффективности лекарств, открытию механизмов, лежащих в основе патофизиологических условий, и более28. Несмотря на замечательные достижения, достигнутые этой областью за последние несколько лет, все еще есть области, требующие роста. Например, способность липида быть точно количественно оцененным с использованием современных технологий остается предметом обсуждения29. Кроме того, полное картирование клеточного липидома имеет большой прогресс. Ожидается, что в этих областях, в том числе в этой области, в ближайшие годы будет наблюдаться значительный рост.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy и Mayan Hein поддерживаются Летней исследовательской программой CUNY (CSURP) Фонда Слоуна. Цзюнь Инь поддерживается программой внутренних исследований Проекта Национальных институтов здравоохранения No 1ZIANS003137. Поддержку этому проекту оказала премия PSC-CUNY Е Хе и Рината Абзалимова, совместно финансируемая Конгрессом профессиональных сотрудников и Городским университетом Нью-Йорка.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
- Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C.
- Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
- Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
- Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
- Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
- Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
- Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
- Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
- Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
- Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
- Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
- Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
- Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
- Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
- Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
- Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
- Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
- Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
- Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
- Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
- Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
- Han, X.
- Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).
