Summary
Bu protokolün amacı, matris yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometrisi görüntülemesini kullanarak Drosophila beyni gibi küçük dokularda lipit ve metabolit analizi için uygun numune hazırlama konusunda ayrıntılı rehberlik sağlamaktır.
Abstract
Lipid profillemesi veya lipidomik, bir hücrenin veya dokunun tüm lipit içeriğini incelemek için kullanılan köklü bir tekniktir. Lipidomiklerden elde edilen bilgiler, gelişim, hastalık ve hücresel metabolizmada yer alan yolakların incelenmesinde değerlidir. Birçok alet ve enstrümantasyon, lipidomik projelere, özellikle de kütle spektrometresi ve sıvı kromatografisi tekniklerinin çeşitli kombinasyonlarına yardımcı olmuştur. Matriks yardımlı lazer desorpsiyon/iyonizasyon kütle spektrometrisi görüntüleme (MALDI MSI) son zamanlarda geleneksel yaklaşımları tamamlayan güçlü bir görüntüleme tekniği olarak ortaya çıkmıştır. Bu yeni teknik, lipitlerin doku bölmeleri içindeki uzamsal dağılımı hakkında benzersiz bilgiler sağlar, bu da daha önce aşırı modifikasyonlar kullanılmadan elde edilemezdi. MALDI MSI yaklaşımının örnek hazırlanması kritiktir ve bu nedenle bu makalenin odak noktasıdır. Bu yazıda, MALDI MSI aracılığıyla lipid analizi veya metabolit ve küçük molekül analizi için küçük dokuların hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sağlamak üzere optimal kesme sıcaklığı bileşiğine (OCT) gömülü çok sayıda Drosophila beyninin hızlı bir lipit analizi sunulmaktadır.
Introduction
Lipitler çok çeşitli biyolojik süreçlerde yer alır ve yapısal çeşitliliklerine göre beş kategoriye ayrılabilir: yağ asitleri, triasilgliseroller (TAG'ler), fosfolipitler, sterol lipitler ve sfengolipidler1. Lipitlerin temel işlevleri, biyolojik süreçler (yani TAG'ler) için enerji kaynakları sağlamak ve hücresel membranlar (yani fosfolipitler ve kolesterol) oluşturmaktır. Bununla birlikte, lipitlerin ek rolleri gelişim ve hastalıklarda kaydedilmiştir ve biyomedikal alanda kapsamlı bir şekilde çalışılmıştır. Örneğin, raporlar farklı uzunluklardaki yağ asitlerinin benzersiz terapötik rollere sahip olabileceğini göstermiştir. Kısa yağ asidi zincirleri otoimmün hastalıklara karşı savunma mekanizmalarında rol oynayabilir, orta uzunluktaki yağ asidi zincirleri nöbetleri hafifletebilecek metabolitler üretir ve uzun yağ asidi zincirleri metabolik bozuklukların tedavisinde kullanılabilecek metabolitler üretir2. Sinir sisteminde, glia kaynaklı kolesterol ve fosfolipitlerin sinaptogenez için hayati önem taşıdığı gösterilmiştir 3,4. İlaç dağıtım sistemlerinde kullanılan sfengolipidler ve bağışıklık sistemini desteklemek için kullanılan sakarolipidler de dahil olmak üzere diğer lipit türleri tıbbi uygulamalarda umut vaat etmiştir 5,6. Biyomedikal alanda lipitlerin sayısız rolü ve potansiyel terapötik uygulamaları, lipidomikleri - hücresel lipitlerin yollarının ve etkileşimlerinin incelenmesi - kritik ve giderek daha önemli bir alan haline getirmiştir.
Lipidomics, lipidomu büyük ölçekte incelemek için analitik kimyadan yararlanır. Lipidomikte kullanılan başlıca deneysel yöntemler, çeşitli kromatografi ve iyon hareketlilik teknikleri ile birlikte kütle spektrometrisine (MS) dayanmaktadır 7,8. MS'in bölgede kullanımı, yüksek özgüllüğü ve duyarlılığı, edinme hızı ve (1) düşük ve geçici seviyelerde bile meydana gelen lipitleri ve lipit metabolitlerini tespit etme, (2) tek bir deneyde yüzlerce farklı lipit bileşiğini tespit etme, (3) daha önce bilinmeyen lipitleri tanımlama ve (4) lipit izomerleri arasında ayrım yapma konusundaki benzersiz yetenekleri nedeniyle avantajlıdır. Desorpsiyon elektrosprey iyonizasyonu (DESI), MALDI ve sekonder iyon kütle spektrometresi (SIMS) DAHIL OLMAK ÜZERE MS'DEKI GELIŞMELER ARASıNDA MALDI MSI, lipitlerin doku bölmeleri içindeki uzamsal dağılımı hakkında benzersiz bilgiler sağlayarak geleneksel MS tabanlı yaklaşımları tamamlayan güçlü bir görüntüleme tekniği olarak ortaya çıkmıştır 9,10.
Lipidomiklerin tipik iş akışı, numune hazırlama, kütle spektrometresi teknolojisi kullanılarak veri toplama ve veri analizinden oluşur11. Örneklerde lipitlerin ve metabolitlerin incelenmesi, organizmalardaki metabolik süreçlerin fizyolojik ve patolojik koşullarını anlamak için tekniklerin ortaya çıkmasına neden olmuştur. Biyolojik etkileşimleri anlamak önemli olsa da, lipitlerin ve metabolitlerin duyarlılığı, boyalar veya başka modifikasyonlar olmadan görüntülenmesini ve tanımlanmasını zorlaştırır. Metabolit düzeylerindeki veya dağılımındaki değişiklikler fenotipik değişikliklere yol açabilir. Metabolomik profilleme için kullanılan araçlardan biri, yüzlerce molekülü aynı anda tespit edebilen etiketsiz, yerinde bir görüntüleme tekniği olan MALDI MSI'dır . MALDI görüntüleme, örneklerdeki metabolitlerin ve lipitlerin görselleştirilmesine izin verirken, bütünlüklerini ve uzamsal dağılımlarını korur. Lipid profillemesi için önceki teknoloji, lipitleri ayrı ayrı haritalamak için radyoaktif kimyasalların kullanılmasını içerirken, MALDI görüntüleme bundan vazgeçer ve aynı anda bir dizi lipitin tespit edilmesine izin verir.
Lipid metabolizması ve homeostaz, sinir sisteminin korunması ve geliştirilmesi gibi hücre fizyolojisinde önemli işlevler oynar. Sinir sistemi lipid metabolizmasının önemli bir yönü, nöronlar ve glial hücreler arasındaki lipit titremesidir; bu, çok düşük yoğunluklu lipoprotein (VLDL), düşük yoğunluklu lipoproteinler (LDL) ve yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) dahil olmak üzere moleküler taşıyıcı lipoproteinler tarafından aracılık edilir12. Lipoproteinler, lipid kargosunun yapısal blokları ve lipoprotein reseptörleri için ligandlar olarak işlev gören ApoB ve ApoD gibi apolipoproteinler (Apo) içerir. Lipitlerin nöron-glia çaprazlaması, glia kaynaklı ApoD, ApoE ve ApoJ gibi çoklu oyuncuları ve bunların nöronal LDL reseptörlerini (LDLR'ler) içerir13,14. Drosophila'da, ApoB ailesinin bir üyesi olan apolipoforin, majör bir hemolenf lipid taşıyıcısıdır15. Apolipoforin, memeli LDLR 15,16'nın homologları olan iki yakından ilişkili lipoforin reseptörüne (LpR), LpR1 ve LpR2'ye sahiptir. Önceki çalışmalarda, insan ApoD'sinin bir Drosophila homologu olan astrosit salgılanan lipokalin Glial Lazarillo (GLaz) ve nöronal reseptörü LpR1'in, nöron-glia lipit sürünmesine işbirliği içinde aracılık ettiği ve böylece dendrit morfogenezi17'yi düzenlediği keşfedildi. Bu nedenle, LpR1 kaybının Drosophila beynindeki genel lipit içeriğinde bir azalmaya neden olacağı tahmin edilmektedir. MALDI MSI, bu çalışmada gösterildiği gibi, LpR1-/-mutant ve vahşi tip Drosophila beyinlerinin küçük dokularındaki lipit içeriğinin profilini çıkarmak için uygun bir araç olacaktır.
MALDI MSI'ın artan popülaritesine rağmen, cihazın yüksek maliyeti ve deneysel karmaşıklığı genellikle bireysel laboratuvarlarda uygulanmasını engellemektedir. Bu nedenle, çoğu MALDI MSI çalışması paylaşılan çekirdek tesisler kullanılarak yürütülmektedir. MALDI MSI'ın diğer uygulamalarında olduğu gibi, lipidomikler için dikkatli bir numune hazırlama süreci, güvenilir sonuçlar elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, numune slayt hazırlama tipik olarak bireysel araştırma laboratuvarlarında gerçekleştirildiğinden, MALDI MSI ediniminde farklılık olasılığı vardır. Bununla mücadele etmek için, bu makale, örnek olarak pozitif iyon modunda büyük bir yetişkin Drosophila beyni grubunun lipit analizini kullanarak MALDI MSI ölçümünden önce küçük biyolojik örneklerin numune hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sağlamayı amaçlamaktadır11,17. Bununla birlikte, bazı fosfolipid sınıfları ve küçük metabolitlerin çoğunluğu, daha önce11 olarak tanımlanan negatif iyon modunda MALDI görüntüleme ile olumlu bir şekilde tespit edilir. Bu nedenle, bu iki örnek çalışma ile, çeşitli kombinasyonların ayrıntılı numune hazırlama protokollerini sağlamayı umuyoruz: gömülü küçük dokuya karşı serbest duran büyük doku, çözülme montajına karşı sıcak slayt montajı ve negatif iyon moduna karşı pozitif iyon modu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sinek kafası gömme
NOT: Tüm prosedür ~ 45-60 dakika sürer.
- Düz bir yüzeye sahip optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT bileşiği) aşamasını hazırlayın.
- OCT'yi plastik bir kriyomoldun içine (15 mm x 15 mm x 5 mm) kriyomoldun derinliğinin yarısına kadar ekleyin ve kabarcık oluşumunu önleyin. Kalıbı birkaç dakika düz bir yüzeyde bırakın ve ardından kuru buz üzerine aktarın.
- Cryomold'u kuru buz üzerinde düz tutun ve OCT'nin düz ve eşit bir yüzey oluşturmasına izin verin. OCT kalıpta tamamen katılaşana kadar bekleyin. Dondurulmuş OCT aşamalarını hemen kullanın veya -80 ° C'de saklayın.
- CO 2 (yani, bir CO2 pedi) kullanarak yetişkin sinekleri anestezi altına alın.
- Bir parça laboratuvar mendili içeren bir Petri kabı hazırlayın. Statik elektriği azaltmak için mendilin bir kısmını nemlendirmek için su kullanın. Mendili yarı ıslak ve yarı kuru tutun.
- Diseksiyon kapsamı 1 altında, sinek kafasını kesmek için forseps kullanın. Her seferinde 4-5 kafa toplayın ve bunları laboratuvar mendilinin kuru alanına koyun.
NOT: 4-5 kafanın toplanması ~ 2 dakika sürer.
- OCT aşamasını kuru buzdan diseksiyon kapsamına aktarın.
- OCT aşamasını kuru buzdan mikroskop 2'ye alın, kafaları hemen OCT aşamasına aktarın ve OCT erimesini önlemek için ~ 30 s alan hızlı bir şekilde düzenleyin. OCT'den yeterli desteği sağlamak için her sinek beyninin etrafında ~ 1 mm boş alan ve bölümü işlemek için yeterli alan sağlamak için bloğun kenarından 4-5 mm boş alan bırakın. Hortum çok uzunsa, ucu çıkarın; çok uzun değilse, bozulmadan saklayın. OCT aşamasını tekrar kuru buzun üzerine koyun ve OCT aşamasının donmuş ve katı kaldığından emin olmak için ~ 3 dakika boyunca açık kalmasına izin verin.
- OCT aşaması kuru buza geri döndüğünde ve katılaşmayı beklediğinde, başka bir kafa turu toplayın. Ek örnekleri sahne alanında kalan alana aktarmak için 1.2 ve 1.3 numaralı adımları yineleyin.
NOT: Bu laboratuvarda genellikle her genotip için sekiz kafa hazırlanır ve bir OCT aşamasında dört genotip kullanılır. - Odağın değişmesini önlemek ve OCT aşamasında kafaların aktarılması ve düzenlenmesi için geçen süreyi artırmak ve OCT aşamasının erime riskini azaltmak için yan yana iki diseksiyon mikroskobu kullanın.
- Tüm sinek kafaları hizalandıktan sonra, OCT aşamasının kuru buz üzerinde 5-10 dakika daha oturmasına izin verin.
- OCT aşamasını kuru buzdan uzaklaştırın, düz bir yüzeye (tezgah) koyun ve ardından hızlı bir şekilde, tüm numuneleri kaplamak ve ~ 3 s alan tüm kriyomoldu doldurmak için büyük miktarda OCT bileşiği ekleyin.
- Cryomold'u derhal kuru buza geri aktarın ve gömülü dokuları içeren tüm OCT bloğunu dondurun. OCT aşamasının kuru buz üzerinde 5-10 dakika daha oturmasına izin verin. Numuneleri kriyomoldun kenar boşluğunda etiketleyin.
- Dondurulmuş numuneleri kesitlemeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
2. Dokunun kriyoseksiyonu
NOT: İndiyum kalay oksit (ITO) kızaklarını tutarken, doku kontaminasyonunu önlemek için her zaman eldiven giyin. Doğrudan slaytın üzerine nefes almaktan kaçınmak için maske takmanız da önerilir.
- Direnç ayarlı bir voltmetre kullanarak ITO kızaklarının iletkenliğini test ederek İTO kaplı tarafı onaylayın. Tarafı, dokunun yapışacağı taraf olarak bir direnç ölçümü ile işaretleyin. Slaydın kirlenmesini önlemek için her zaman slaydın altına bir laboratuvar mendili koyun.
- Dokuların kriyostat odasında 30-45 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.
- OCT'nin erimesini önlemek için, forseps ve ince uçlu bir sanatçı fırçası gibi gerekli tüm aletleri, önceden soğutmak için kriyostat odasına önceden yerleştirin.
- Kriyostatı, tercihen% 70 etanol ile temizleyin. Rulo plakasını ve sahneyi silin ve kullanılmış bıçakları çıkarın. Etanolün buharlaştığından ve bölümleme başlamadan önce tüm yüzeylerin kuru olduğundan emin olmak için ek temiz mendiller kullanın.
- Kriyostat odasının ve numune başının sıcaklığını dokunun tipine göre ayarlayın (örneğin; karaciğer için -14 ° C, kas için -20 ° C ve cilt10 için -25 ° C; Bu protokolde sinek kafaları için -18 ° C).
- OCT bloğunun tabanını örtmek için yeterli OCT kullanmaya dikkat edin ve bloğu mümkün olduğunca düz bir şekilde monte edin.
- Sahneye temiz bir bıçak yerleştirin ve kilitleyin. İstenilen kesme açısını elde etmek için numunenin kafasını gerektiği gibi sahneye doğru konumlandırın.
- Numune bloğunu, tüm genotiplerin/tedavi gruplarının bıçağa dikey olarak yerleştirildiği bir yöne yerleştirin.
NOT: Bu, tutarlı bir kesme düzlemi sağlar ve farklı gruplardan çapraz kontaminasyonu önler. Farklı bir doku bloğunu kesiyorsanız, çapraz kontaminasyonu önlemek için numuneler arasında yeni bir bıçağa geçin.
- Numune bloğunu, tüm genotiplerin/tedavi gruplarının bıçağa dikey olarak yerleştirildiği bir yöne yerleştirin.
- İlgilenilen bölge (örneğin, beynin istenen bölgesi) bulunana kadar kalın kesitlerde (50-100 μm) kesmeye başlayın.
- Sahneyi temiz tutmak için önceden soğutulmuş bir sanatçı fırçasıyla ekstra parçaları sürekli fırçalayın.
- İstenilen bölgeye ulaşıldığında kesitlerin kalınlığını 10-12 μm'ye değiştirin.
- Oda sıcaklığını gerektiği gibi hafifçe ayarlayın. Örneğin, bölüm pul pul dökülme veya kolayca parçalanma eğilimindeyse daha yüksek bir sıcaklık ayarlayın.
NOT: OCT blokları için önerilen sıcaklık -18 °C'dir.
- Oda sıcaklığını gerektiği gibi hafifçe ayarlayın. Örneğin, bölüm pul pul dökülme veya kolayca parçalanma eğilimindeyse daha yüksek bir sıcaklık ayarlayın.
- İstediğiniz bölümü dikkatlice toplayın ve ITO slaytına yapıştırın. Bu işlemi kriyostat odasında gerçekleştirin.
- Oda sıcaklığında bir ITO slaytı alın ve bölümün üzerine yerleştirin, bölümün kriyostat aşamasında iz bırakmadan slayda yapışması için bölüme nazikçe ve hızlı bir şekilde yaklaşın.
NOT: OCT eriyecek ve kızağa yapışacaktır.
- Oda sıcaklığında bir ITO slaytı alın ve bölümün üzerine yerleştirin, bölümün kriyostat aşamasında iz bırakmadan slayda yapışması için bölüme nazikçe ve hızlı bir şekilde yaklaşın.
- Slaytı bir kenara koyun veya kriyostatın dışındaki laboratuvar mendillerini birden fazla bölümün koleksiyonları arasına yerleştirin.
- Aynı kohortun farklı örnekleri arasında karşılaştırma yapmak istenirse, eşzamanlı analiz ve minimum varyasyon için birden fazla numuneden bölümleri tek bir slayta yerleştirin. Gerekirse, MALDI hedef tutucu tek bir çalıştırmada iki slaytı barındırabileceğinden, iki slayta ayırın.
- Slaytları bir vakum kutusunda, alt katman olarak kurutucu olan bir kurutucuya taşıyın. Slaytları vakum altında 30-60 dakika kurutun.
NOT: Alternatif olarak, laboratuvarda vakumlu bir kurutucu yoksa, lipitlerin veya metabolitlerin bozulmasını önlemek için slaytlar proses boyunca -20 ° C'de 24 saat içinde -80 ° C'de depolanana veya kuru buz üzerinde gönderilene kadar tutulmalıdır. - Matris biriktirmeye devam edin. Matris olarak metanol / suda (70/30, v / v) 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) kullanın.
- Slaytlar hemen çalıştırılmazsa, slaytları -80 ° C'de saklayın (sinek beyni bölümleri için 1 aya kadar ve kemirgen beyin bölümleri için 6 aya kadar) veya numuneyi derhal yeterli kuru buzla MALDI çekirdek tesislerine gönderin. Optimum depolama ve nakliye için, slaytları bir slayt taşıyıcıya yerleştirin ve açıklığı balmumu filmi ile güvenli bir şekilde kapatın. Fermuarlı bir torba ile kapatın, kurutucu içeren başka bir fermuarlı torbaya yerleştirin ve dışını etiketleyin.
NOT: Slayt tarama, matris biriktirme ve MALDI görüntüleme prosedürleri11'in aşağıdaki adımları için önceki çalışmalara bakın. - Otomatik HTX M5 matris püskürtücüyü ve metanol/suda (70/30, v/v) 40 mg/mL DHB çözeltisini kullanarak matris biriktirme işlemini gerçekleştirin. Matrisi 0,12 mL/dak özelleştirilmiş akış hızında ve 10 geçiş için 85 °C nozul sıcaklığında püskürtün. 10 psi'lik bir N2 gaz basıncı kullanın.
NOT: Püskürtücüdeki N2 gaz basıncı 5 psi'nin altına düşürülürse, püskürtücüdeki bir güvenlik mekanizması, 1.300 mm / dak püskürtme hızı, 2 mm iz aralığı, 3 L / dak akış hızı ve 40 mm nozul yüksekliği ile püskürtücüye zarar gelmesini önlemek için ısıtıcıyı bir kerede kapatır. - M / z 50-1.000 kütle aralığında bir kütle spektrumu elde etmek için pozitif iyon modunda bir MALDI uçuş zamanı (TOF) MS cihazı kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Cihazı kalibre etmek için, asetonitrildeki 0,5 μL kırmızı fosfor emülsiyonunu ITO slaytları üzerinde tespit edin ve ikinci dereceden bir kalibrasyon eğrisi2 uygulayarak cihazı 50-1.000 m / z kütle aralığında kalibre etmek için spektrumlarını kullanın.
- 40 μm raster genişliği için modüle edilmiş ışın profili olduğu için lazer nokta çaplarını Orta olarak ayarlayın ve dizi konumu başına 1.000 Hz lazer tekrarlama hızında 500 atış toplayarak görüntüleme verilerini toplayın.
- Spektral verileri kaydetmek ve işlemek için yazılım kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın). ±0.10 Da'lık bir kutu genişliğinde iyon görüntüleri oluşturmak için kök ortalama kare (RMS) normalizasyonunu kullanarak görüntüleme veri analizi gerçekleştirin. örtüşen zirveleri ve OCT'nin iyon bastırma girişimini değerlendirmek için yazılımı kullanarak aynı deneyden hem OCT hem de beyin dokusunun spektrumlarını hizalayın (Ek Şekil S1). Deneyden sonra, doku örneklerini içeren MALDI slaytlarını, daha önce tarif edildiği gibi hematoksilin ve eozin (H & E) boyama ile işleyin11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İnsan ApoD'sinin bir Drosophila homologu olan astrosit salgılanan lipokalin Glial Lazarillo'nun (GLaz) nöronal reseptörü LpR1'in kaybı, Drosophila beynindeki genel lipit içeriğinde bir azalmaya neden olabileceği varsayılmıştır. Bunu test etmek için, MALDI MSI, aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan LpR1 - / - mutant ve vahşi tip Drosophila beyinlerindeki lipitlerin profilini çıkarmak için kullanıldı.
Deney, Şekil 1'de gösterilen iş akışına göre gerçekleştirilmiştir. Yetişkin sinek beyinleri yukarıda tarif edildiği gibi toplandı. OCT'ye gömüldüler ve OCT bloğunu dondurmak için kuru buz kullanıldı. OCT doku bloğu 12 μm kalınlığında ve hem numune başı hem de oda için -18 °C'de kriyoseksiyona tabi tutuldu. Üzerlerine kriyoseksiyon monte edilmiş ITO kızakları, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca vakumda kurutuldu. Daha sonra, matris biriktirme işlemi otomatik HTX M5 matris püskürtücü ve metanol / suda 40 mg / mL'lik bir DHB çözeltisi (70/30, v / v) kullanılarak gerçekleştirildi.
Pozitif iyon modunda MALDI uçuş süresi (TOF) MS Autoflex cihazı, 50-1.000 m / z kütle aralığında bir kütle spektrumu elde etti. Aynı deneyden hem OCT hem de beyin dokusunun spektrumu, üst üste binen pikleri ve OCT'nin iyon bastırma girişimini değerlendirmek için SCiLS'de hizalandı (Ek Şekil S1).
Şekil 2'deki sonuçlar, seçilen değerlerin LpR1 nakavtı ile vahşi tip Drosophila arasındaki lipit dağılımında anlamlı bir fark gösterdiği seçilmiş m / z spektrumlarının MALDI MSI veri analiz yazılımından elde edilen çıktı görüntülerini göstermektedir. Taramalar, LpR1 - / - mutantındaki lipit içeriğinde genel bir azalma olduğunu ortaya koydu. Her spektrum manuel olarak analiz edildi ve METLIN veritabanlarına çapraz referanslama yapılarak analit tanımlaması sağlandı ve daha önce yayınlanmış çalışmalar 3,4. Triasilgliserol (TAG) ve fosfatidilgliserol (PG), LpR1-/-mutantına kıyasla kontrol beyinlerinde yüksek oranda eksprese edilmiştir (TAG'de 10 kata kadar bir değişiklik göstermektedir). Ek olarak, digliserol (DAG), fosfatidilkolin (PC) ve fosfatidil-etanolamin (PE) de LpR1 − / - mutant genotipinde minimal olarak eksprese edildi.
Şekil 1: MALDI-TOF kütle spektrometresi görüntülemenin iş akışı. (A) Drosophila beyinleri, kuru buzun üzerine yerleştirilen OCT'de hizalanır. (B-D) Doku bloğu -15 °C'de 12 μm kalınlığında kesitlere kriyoseksiyon yapılır. Bölüm, önceden soğutulmuş bir fırça kullanılarak düzleştirilir ve oda sıcaklığında tutulan bir cam sürgünün İTO kaplı tarafına çözülerek eritilir. (E) Slayt, referans işaretleyicilerle işaretlenir, matrisle kaplanır ve MALDI cihazına yerleştirilir. (F) Bir Drosophila beyninin MALDI görüntüsü, DHB'yi matris olarak kullanarak 40 μm çözünürlükte elde edilir. Göz bölgeleri (kırmızı, m/z 370.2), baş dokusu (yeşil, m/z 184.1) ve beyin (mavi, m/z 788.6) bindirmeli çok kanallı görüntüde gösterilmiştir. (G) H&E boyama, MALDI MSI sonrası aynı doku kesitinde yapılır. (H) Numune hazırlama, depolama ve taşıma iş akışı. Ölçek çubukları = 500 μm (F,G). Kısaltmalar: MALDI-TOF = matris yardımlı lazer desorpsiyonu/iyonizasyon-uçuş süresi; OCT = optimum kesme sıcaklığı bileşiği; ITO = indiyum kalay oksit; DHB = 2,5,-dihidroksibenzoik asit; H&E = hematoksilin ve eozin; MSI = kütle spektrometresi görüntüleme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: MALDI MS analizinden elde edilen temsili görüntüler, LpR1-/-mutant beyindeki lipit içeriğinde genel bir azalma olduğunu ortaya koymaktadır. Temsili H&E boyalı yetişkin sinek beyin bölümleri gösterilmiştir (solda). Lipid türleri, ilgili m / z değerleri ve ısı haritasının ölçekleri belirtildiği gibidir. Altta, en az dört biyolojik kopyadan gelen kontrollere kıyasla LpR1 - / - mutantındaki ortalama azalma katı, okların yanındaki sayılar olarak gösterilir. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakam Yin ve ark.17'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: OCT ve Drosophila beyin dokusunun kütle spektrumları. Şekil 1'deki Drosophila beyin OCT bloğunun kriyoseksiyonları, MALDI görüntülemeden önce DHB matriksi ile eşit olarak kaplandı. Hem kontrol hem de mutant sineklerden seçilen boş OCT bölgesinin ve beyin dokusu bölgesinin kütle spektrumu sırasıyla m / z 1-1.000 ve m / z 520-900 (lipid bakımından zenginleştirilmiş) aralığında gösterilmiştir. OCT'nin girişimi hem iyon bastırma fenomeni hem de örtüşen sinyal sorunları ile ilişkilidir. Kısaltmalar: OCT = optimum kesme sıcaklığı bileşiği; DHB = 2,5-dihidroksibenzoik asit; MALDI = matris yardımlı lazer desorpsiyonu/iyonizasyonu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mutant ve vahşi tip Drosophila beyinlerindeki lipit kompozisyonundaki varyasyonlar üzerine yapılan çalışmada gösterildiği gibi, MALDI MSI, küçük böceklerin organlarındaki moleküler dağılım modellerinin yerinde analizi için değerli bir etiketsiz görüntüleme tekniği olabilir. Gerçekten de, lipitler Drosophila kafalarının hem beyin dokusunda hem de yağ gövdelerinde dağıldığından, sıvı kromatografisi ve kütle-spektrometriye (LC-MS) dayanan geleneksel lipidomik yaklaşımlar, tüm kafa ekstraksiyonu kullanıldığında her iki bölgeden sadece kombine sinyalleri tespit edebilir. Genel olarak, Drosophila gibi küçük bir böceğin organlarındaki alt bölgelerin diferansiyel lipidomik analizi, LC-MS yaklaşımları için çok zahmetli ve zorlu bir iştir18. Bu bölgelerin diseksiyonunu gerektirecek ve bu da büyük zorluklar doğuracaktır. Buna karşılık, MALDI MSI, küçük Drosophila beyninde bile farklı anatomik yapıları ayırt etmek için yeterli çözünürlük sağlar. Geleneksel LC-MS'e kıyasla minimum miktarda doku gereksiniminin yararı, klinik biyopsiler gibi değerli örneklere de uygulanabilir. Ayrıca MALDI MSI için hazırlanan örnek slaytlar TOF-SIMS ve immünohistokimya gibi disiplinler arası yaklaşımlardan elde edilen verilerin entegrasyonunu sağlayacak tamamlayıcı tekniklerle de incelenebilir19,20.
MALDI MSI'daki en önemli adımlardan biri, deneyin farklı laboratuvarlarda yürütülen metabolomik çalışmalardan elde edilen sonuçlardaki farklılıkların çoğunu açıklayan kısmı olan numune hazırlamadır21. Buradaki temel amaç, araştırmacıların temel biyolojiden translasyonel bilime kadar olan çalışmalarında MALDI MSI'ın uygulanmasına yardımcı olma umuduyla, Drosophila böcekleri kadar küçük organizmalardaki lipitlerin ve metabolitlerin MALDI MSI analizi için kapsamlı ama pratik bir numune hazırlama protokolü sağlamaktır.
Daha önce tartışıldığı gibi moleküler profillerdeki değişiklikleri (hem bolluk hem de mekansal dağılım) en aza indirgemek için alınan önlemlere ek olarak11, küçük dokuları ele alırken diğer bazı uygulamaların uyarlanması gerekir. İlk olarak, postmortem iskemi olasılığını azaltmak için OCT'de biyolojik doku hasadı ile donma arasındaki süre en aza indirilmelidir21. İkincisi, dokuyu bloğa yerleştirmeden önce OCT'nin düz bir aşamasının hazırlandığından emin olunmalıdır, bu da kesitleme sırasında farklı dokular arasında karşılaştırılabilir düzlemlerden kesitlere sahip olmak için çok önemlidir. Üçüncüsü, küçük ölçekli biyolojik dokuların veya değerli numunelerin kesilmesi, deneyden önce yeterli uygulamaya ihtiyaç duyar. OCT eşit kesitlerin kesilmesine yardımcı olurken, doku kıvrılması veya dökülmesi açısından komplikasyonlar ortaya çıkabilir. Curling ile mücadele etmek için, rulo plakasını çıkarmadan önce bölümün sahnede birkaç saniye dinlenmesine izin verilmelidir. İki fırçayla, biri bölümün üstünü sabit tutmak için kullanılabilirken, diğeri bölümü açmak için kullanılabilir. Öncelikle blok kesitlerinin kenarları ile çalışılarak doku ile teması en aza indirmeye özen gösterilmelidir. Dördüncüsü, çözülme montaj yöntemi daha az sinek beyni (<10 beyin) için kullanılabilse de, çok sayıda sinek beyni (>30 beyin) içeren bir bölümü, kaldırıldıktan sonra blok bölümünden kolayca düşecek olan kayda değer sayıda beyni kaybetmeden soğuk bir ITO slaytına aktarmak imkansız olacaktır. Bu nedenle, çok sayıda sinek beyninin hızlı analizi için, sıcak slayt montajının kullanılması gerekir. Özellikle, OCT bölümü ile slayt arasındaki sıcaklık farkı, bölümün çok hızlı bir şekilde yapışmasına ve slayda yapışmasına neden olacaktır. Bu nedenle, sıcak slaytı bölüme ve kriyostat aşamasına bastırmamalıdır; bunun yerine, bölümün kriyostat aşamasına dokunmadan ITO slaytına bağlanmasına izin vermek için bölümlere nazikçe ve hızlı bir şekilde yaklaşılmalıdır. Kriyostat aşamasında geride kalan kesitlerin çözülme montaj yöntemine kıyasla gözle görülür bir iz bırakmadığını gözlemledik. Beşincisi, MALDI matrisinin düzgün ve ince bir birikimi, edinme sırasında güçlü ve doğru mekansal bilgi elde etmek için çok önemlidir. Numuneyi içeren slayda geçmeden önce matris birikimini uygun kapsama açısından test etmek için boş bir slayt kullanılması önerilir.
Artan popülaritesi ve ilerlemeleri ile MALDI MSI'nın daha geniş bir kullanıcı tabanına ulaşması ve amino asitler, metabolitler, lipitler, peptitler ve proteinler gibi analitlerin ve doğrudan biyolojik dokulardan ekstrakte edilen diğer küçük moleküllerin moleküler kütle ölçümleri için standart bir araç haline gelmesi beklenmektedir10. Bununla birlikte, kendi sınırlamaları ve zorlukları vardır. MALDI MSI için kırılgan ve küçük ölçekli numuneler hazırlanırken, kesitleme için OCT gibi gömme ajanları gereklidir. Bununla birlikte, OCT, analit sinyali22'ye müdahale edebilecek polimerik bir arka plan sinyali oluşturan polimerlerin (poli (vinil alkol), polietilen gliserol ve benzalkonyum klorür) bir kombinasyonunu içerir. Jelatin ve karboksimetil selüloz (CMC) gibi alternatif gömme bileşiklerinin daha az iyon baskılayıcı etki gösterdiği bildirilmiştir. Jelatin, 100-600 m / z20,23,24 düşük kütle aralığında daha fazla dağılmış daha az yoğun sinyaller gösterir. CMC, GABA gibi metabolitleri görselleştirmek için Drosophila'nın MALDI MSI'sında da kullanılmıştır, ancak optimal yapışma25 için gömmeden önce kafaların% 70 etanol içine daldırılmasını gerektirir.
OCT'nin sinyal bastırma eğilimine rağmen, bu protokol, OCT'nin beyin morfolojisini korurken çok sayıda numunenin güvenilir bir şekilde bölümlenmesini sağlama konusundaki üstün yeteneği nedeniyle kullanımına devam eder. Araştırmacılar, jelatin ve CMC kesitinin 20 μm gibi yüksek kalınlıklarda iyi olmasına rağmen, sadece OCT'nin ardışık 12 μm kesitleri güvenilir bir şekilde26 üretebildiğini bulmuşlardır. CMC ve jelatin, OCT'nin sağladığı yapısal bütünlükten ve dokunun sıkı tutulmasından yoksundur, bu da sinek beyni gibi küçük dokuların sayısının sınırını bir blok26'da barındırır. OCT'ye gömülü sinek bölümlerinden gelen MS sinyallerinin, jelatin ve CMC26'ya gömülü olanlarla karşılaştırılabilir olduğu bildirilmiştir. Yayınlanmamış verilerimiz ayrıca, sıcaklığa monte edilmiş, OCT'ye gömülü sinek beyin bölümlerinin, çözülmeye monte edilmiş jelatin gömülü dokuyla karşılaştırılabilir sağlam lipit sinyalleri ürettiğini göstermiştir. Genel olarak, OCT'nin doku morfolojisinin bütünlüğünü koruma ve diğer gömme bileşiklerine kıyasla hassas numune kesitlemesini sağlama konusundaki üstün yeteneği nedeniyle, Drosophila beyin dizileri gibi yüksek kırılganlığa sahip örneklerle kullanımı bir seçenek olmaya devam etmektedir. Bu senaryoda, yalnızca aynı deneyden alınan örneklerin karşılaştırılmasının göreceli nicelleştirilmesi yapılmalı, ancak mutlak niceleme yapılmamalıdır. Lipid analizinde Drosophila modeli ile ilgili rapor edilen çalışmamızla ilgili olarak, OKT'nin faydalarının sınırlamalarından daha ağır bastığı sonucuna varılmıştır. Ek olarak, hedeflenen analitlerin MS sinyallerinin OCT sinyalleri tarafından maskelenip maskelenmeyeceğini test etmek için deneme deneyleri yapılmalıdır.
Ayrıca, iyon baskılanmasının etkilerini en aza indirmek için çeşitli uygulamaların uyarlanması gerekir. İlk olarak, eğer varsa, aynı iyon baskılamasını sağlamak için farklı grupların numuneleri aynı anda işlenmelidir. İkincisi, MALDI taraması için ilgilenilen bölgenin seçiminde, OCT bölgesinden kaçınılmalı ve sadece doku bölgesi belirtilmelidir. Son olarak, veri analizi sırasında sinyalleri OCT'den dışlamak için negatif kontrol olarak taranmak üzere boş bir OCT bölgesi seçilmelidir.
Lipidomik alanı 2000'li yılların başında ortaya çıktı ve büyük ölçüde MALDI MSI27 de dahil olmak üzere kütle spektrometrisindeki gelişmeler nedeniyle son yıllarda hızla ilerledi. Bu ilerleyen teknikler, alanın biyolojik ve biyomedikal uygulamalara yönlendirilmesine yardımcı olmuştur. Örneğin, lipidomikler nörolojik çalışmalarda kullanılabilir, çünkü beyin lipid kaçakçılığı düzeylerindeki değişiklikler ve kompozisyon hastalığın biyobelirteçleri olarak kullanılabilir. Ek olarak, lipidomikler yeni sinyal moleküllerinin tanımlanmasına, ilaç etkinlik testlerinin geliştirilmesine, patofizyolojik koşulların altında yatan mekanizmaların keşfine ve daha fazlasına yol açmıştır28. Alanın son birkaç yılda elde ettiği kayda değer başarılara rağmen, hala büyüme talep eden alanlar var. Örneğin, bir lipitin mevcut teknoloji kullanılarak doğru bir şekilde ölçülebilmesi yeteneği tartışma konusu olmaya devam etmektedir29. Ek olarak, hücresel lipidomun tam haritalanmasının yapılması gereken çok ilerleme vardır. Bu alanların, alandaki diğerlerinin yanı sıra, önümüzdeki yıllarda önemli bir büyüme yaşaması beklenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy ve Maya Hein, Sloan Vakfı CUNY Yaz Araştırma Programı (CSURP) tarafından desteklenmektedir. Jun Yin, Ulusal Sağlık Enstitüleri Projesi Numarası 1ZIANS003137'nin intramural araştırma programı tarafından desteklenmektedir. Bu projeye destek, Profesyonel Personel Kongresi ve New York Şehir Üniversitesi tarafından ortaklaşa finanse edilen Ye He ve Rinat Abzalimov'a PSC-CUNY Ödülü ile sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) | Millipore Sigma Aldrich | 85707-1G-F | |
| Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 | Fisher Scientific | NC9464347 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
| Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE | Fisher Scientific | 50-111-2302 | |
| autoflex speed MALDI-TOF MS system | Bruker Daltonics Inc | MALDI-TOF MS instrument | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles | Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG | Fisher Scientific | NC0380464 | |
| Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics | AC219095000 | ||
| Epson Perfection V600 Photo Scanner | Amazon | Perfection V600 | |
| Fisherbrand 5-Place Slide Mailer | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter | Fisher Scientific | 01-241-1 | |
| FlexImaging v3.0 | Bruker Daltonics Inc | Bruker MS imaging analysis software | |
| HPLC Grade Methanol | Fisher Scientific | MMX04751 | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| HTX M5 Sprayer | HTX Technologies, LLC | Automatic heated matrix sprayer | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| MSC Ziploc Freezer Bag | Fisher Scientific | 50-111-3769 | |
| SCiLS Lab (2015b) | SCiLS Lab | Advanced MALDI MSI data analysis software | |
| Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat | Fisher Thermo Scientific | 95-713-0 | |
| Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator | Fisher Scientific | 08-642-7 |
References
- Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
- Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
- Baldwin, K. T., Eroglu, C.
- Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
- Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
- Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
- Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
- Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
- Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
- Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
- Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
- Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
- Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
- Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
- Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
- Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
- Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
- Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
- Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
- Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
- Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
- Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
- Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
- Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
- Han, X.
- Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).
