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Biology

Preparación de muestras para el análisis rápido de lípidos en el cerebro de Drosophila utilizando imágenes de espectrometría de masas de desorción / ionización láser asistidas por matriz

Published: July 14, 2022 doi: 10.3791/63930
Automatic Translation
*1,5,6, *1,2, *3, 1,4, 7, 1,4,5, 1,4,5, 8, 9,10, 2, 1
1Advanced Science Research Center, Neuroscience Initiative, the City University of New York, Graduate Center New York, 2Advanced Science Research Center, Structural Biology Initiative, the City University of New York, Graduate Center, 3National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 4The City College of New York, CUNY, 5Macaulay Honors College, CUNY, 6Graduate School of Public Health and Health Policy, The City University of New York, 7Princeton University, 8Ardrey Kell High School, 9The Borough of Manhattan Community College, CUNY, 10Gallatin School of Individualized Study, New York University
* These authors contributed equally

Summary

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada sobre la preparación adecuada de la muestra para el análisis de lípidos y metabolitos en tejidos pequeños, como el cerebro de Drosophila , utilizando imágenes de espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI).

Abstract

El perfil lipídico, o lipidómica, es una técnica bien establecida utilizada para estudiar todo el contenido de lípidos de una célula o tejido. La información adquirida de la lipidómica es valiosa para estudiar las vías involucradas en el desarrollo, la enfermedad y el metabolismo celular. Muchas herramientas e instrumentaciones han ayudado a proyectos de lipidómica, especialmente varias combinaciones de técnicas de espectrometría de masas y cromatografía líquida. La espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI MSI) ha surgido recientemente como una poderosa técnica de imagen que complementa los enfoques convencionales. Esta novedosa técnica proporciona información única sobre la distribución espacial de los lípidos dentro de los compartimentos tisulares, que antes era inalcanzable sin el uso de modificaciones excesivas. La preparación de muestras del enfoque MALDI MSI es fundamental y, por lo tanto, es el foco de este documento. Este artículo presenta un análisis rápido de lípidos de un gran número de cerebros de Drosophila incrustados en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) para proporcionar un protocolo detallado para la preparación de tejidos pequeños para el análisis de lípidos o análisis de metabolitos y moléculas pequeñas a través de MALDI MSI.

Introduction

Los lípidos están involucrados en una amplia gama de procesos biológicos y pueden clasificarse ampliamente en cinco categorías basadas en su diversidad estructural: ácidos grasos, triacilgliceroles (TAG), fosfolípidos, lípidos de esteroles y esfingolípidos1. Las funciones fundamentales de los lípidos son proporcionar fuentes de energía para los procesos biológicos (es decir, TAG) y formar membranas celulares (es decir, fosfolípidos y colesterol). Sin embargo, se han observado funciones adicionales de los lípidos en el desarrollo y las enfermedades, y se han estudiado ampliamente en el campo biomédico. Por ejemplo, los informes han demostrado que los ácidos grasos de diferentes longitudes pueden tener funciones terapéuticas únicas. Las cadenas cortas de ácidos grasos pueden estar involucradas en los mecanismos de defensa contra enfermedades autoinmunes, las cadenas de ácidos grasos de longitud media producen metabolitos que pueden mitigar las convulsiones y las cadenas largas de ácidos grasos generan metabolitos que pueden usarse para tratar trastornos metabólicos2. En el sistema nervioso, el colesterol derivado de la glía y los fosfolípidos han demostrado ser vitales para la sinaptogénesis 3,4. Otros tipos de lípidos se han mostrado prometedores en aplicaciones médicas, incluyendo esfingolípidos utilizados en sistemas de administración de fármacos y sacarolípidos utilizados para apoyar el sistema inmunológico 5,6. Las numerosas funciones y posibles aplicaciones terapéuticas de los lípidos en el campo biomédico han hecho de la lipidómica, el estudio de las vías e interacciones de los lípidos celulares, un campo crítico y cada vez más importante.

La lipidómica hace uso de la química analítica para estudiar el lipidoma a gran escala. Los principales métodos experimentales utilizados en lipidómica se basan en espectrometría de masas (SM) junto con diversas técnicas de cromatografía y movilidad iónica 7,8. El uso de MS en el área es ventajoso debido a su alta especificidad y sensibilidad, velocidad de adquisición y capacidades únicas para (1) detectar lípidos y metabolitos de lípidos que ocurren incluso a niveles bajos y transitorios, (2) detectar cientos de compuestos lipídicos diferentes en un solo experimento, (3) identificar lípidos previamente desconocidos y (4) distinguir entre isómeros lipídicos. Entre los desarrollos en EM, incluyendo la ionización por electrospray de desorción (DESI), MALDI y la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS), MALDI MSI ha surgido como una poderosa técnica de imagen que complementa los enfoques convencionales basados en EM al proporcionar información única sobre la distribución espacial de los lípidos dentro de los compartimentos tisulares 9,10.

El flujo de trabajo típico de la lipidómica consiste en la preparación de muestras, la adquisición de datos mediante tecnología de espectrometría de masas y el análisis de datos11. El estudio de lípidos y metabolitos en muestras ha llevado a la aparición de técnicas para comprender las condiciones fisiológicas y patológicas de los procesos metabólicos en los organismos. Si bien la comprensión de las interacciones biológicas es importante, la sensibilidad de los lípidos y metabolitos hace que sean difíciles de visualizar e identificar sin colorantes u otras modificaciones. Los cambios en los niveles o distribución de metabolitos pueden conducir a cambios fenotípicos. Una herramienta utilizada para el perfil metabolómico es MALDI MSI, una técnica de imagen in situ sin etiquetas capaz de detectar cientos de moléculas simultáneamente. Las imágenes MALDI permiten la visualización de metabolitos y lípidos en muestras al tiempo que preservan su integridad y distribución espacial. La tecnología anterior para el perfil de lípidos implicaba el uso de productos químicos radiactivos para mapear individualmente los lípidos, mientras que las imágenes MALDI renuncian a esto y permiten la detección de una variedad de lípidos simultáneamente.

El metabolismo de los lípidos y la homeostasis desempeñan funciones importantes en la fisiología celular, como el mantenimiento y desarrollo del sistema nervioso. Un aspecto esencial del metabolismo lipídico del sistema nervioso es el desplazamiento de lípidos entre las neuronas y las células gliales, que está mediado por lipoproteínas transportadoras moleculares, incluyendo lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL)12. Las lipoproteínas contienen apolipoproteínas (Apo), como ApoB y ApoD, que funcionan como bloques estructurales de carga lipídica y como ligandos para los receptores de lipoproteínas. La diafonía neurona-glía de lípidos involucra a múltiples jugadores como ApoD, ApoE y ApoJ derivados de la glía, y sus receptores neuronales de LDL (LDLR)13,14. En Drosophila, la apolipoforina, un miembro de la familia ApoB, es un importante portador de lípidos hemolinfáticos15. La apolipoforina tiene dos receptores de lipoforina estrechamente relacionados (LpRs), LpR1 y LpR2, que son homólogos de LDLR15,16 en mamíferos. En estudios previos, se descubrió que la lipocalina secretada por astrocitos Glial Lazarillo (GLaz), un homólogo de Drosophila de la ApoD humana, y su receptor neuronal LpR1 median cooperativamente el transporte de lípidos neurona-glia, regulando así la morfogénesis de las dendritas17. Por lo tanto, se especuló que la pérdida de LpR1 causaría una disminución en el contenido total de lípidos en el cerebro de Drosophila. MALDI MSI sería una herramienta adecuada para perfilar el contenido de lípidos en pequeños tejidos de cerebros mutantes y de Drosophila mutantes y salvajes de LpR1−/−, como se demuestra en este estudio.

A pesar de la creciente popularidad de MALDI MSI, el alto costo del instrumento y la complejidad experimental a menudo impiden su implementación en laboratorios individuales. Por lo tanto, la mayoría de los estudios MALDI MSI se realizan utilizando instalaciones centrales compartidas. Al igual que con otras aplicaciones de MALDI MSI, un proceso cuidadoso de preparación de muestras para lipidómica es fundamental para lograr resultados confiables. Sin embargo, debido a que la preparación de la muestra de portaobjetos se realiza típicamente en laboratorios de investigación individuales, existe la posibilidad de variación en la adquisición de MALDI MSI. Para combatir esto, este artículo tiene como objetivo proporcionar un protocolo detallado para la preparación de muestras biológicas pequeñas antes de la medición de MALDI MSI utilizando el análisis lipídico de un gran grupo de cerebros adultos de Drosophila en modo de iones positivos como ejemplo11,17. Sin embargo, algunas clases de fosfolípidos y la mayoría de los metabolitos pequeños se detectan favorablemente mediante imágenes MALDI en modo de iones negativos, que se describió anteriormente11. Por lo tanto, con estos dos estudios de ejemplo, esperamos proporcionar protocolos detallados de preparación de muestras de varias combinaciones: tejido grande independiente versus tejido pequeño incrustado, montaje de descongelación versus montaje de diapositiva caliente y modo de iones positivos versus modo de iones negativos.

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Protocol

1. Incrustación de cabezal de mosca

NOTA: Todo el procedimiento toma ~ 45-60 min.

  1. Prepare la etapa óptima del compuesto de temperatura de corte (compuesto OCT) con una superficie plana.
    1. Agregue OCT en un criomold de plástico (15 mm x 15 mm x 5 mm) a la mitad de la profundidad del criomold y evite la formación de burbujas. Deje el molde sobre una superficie plana durante varios minutos y luego transfiéralo a hielo seco.
    2. Mantenga el criomold plano sobre el hielo seco y permita que la OCT forme una superficie plana y uniforme. Espere hasta que la OCT esté completamente solidificada en el molde. Utilice inmediatamente las etapas OCT congeladas o almacénelas a -80 °C.
  2. Anestesiar moscas adultas usando CO 2 (es decir, una almohadilla de CO2 ).
    1. Prepare una placa de Petri que contenga un trozo de toallita de laboratorio. Use agua para humedecer parte de la toallita para reducir la electricidad estática. Mantenga la toallita medio húmeda y la mitad seca.
    2. En el ámbito de disección 1, use fórceps para cortar la cabeza de la mosca. Recoja 4-5 cabezas cada vez y colóquelas en el área seca de la toallita de laboratorio.
      NOTA: La colección de 4-5 cabezas toma ~ 2 minutos.
  3. Transfiera la etapa OCT del hielo seco al ámbito de disección.
    1. Tome la etapa OCT de hielo seco al microscopio 2, transfiera inmediatamente los cabezales a la etapa OCT y colóquelos rápidamente, lo que lleva ~ 30 s para evitar que OCT se derrita. Deje ~ 1 mm de espacio en blanco alrededor de cada cerebro de mosca para garantizar un soporte adecuado de la OCT y 4-5 mm de espacio en blanco desde el borde del bloque para proporcionar un espacio adecuado para manejar la sección. Si la probóscide es demasiado larga, retire la punta; Si no es demasiado largo, manténgalo intacto. Vuelva a colocar la etapa OCT en hielo seco y déjela actuar durante ~ 3 minutos para asegurarse de que la etapa OCT permanezca congelada y sólida.
    2. Cuando la etapa OCT esté de vuelta en el hielo seco y esperando la solidificación, recoja otra ronda de cabezas. Repita los pasos 1.2 y 1.3 para transferir muestras adicionales al espacio restante en el escenario.
      NOTA: Por lo general, se preparan ocho cabezas para cada genotipo, y cuatro genotipos se utilizan en una etapa de OCT en este laboratorio.
    3. Use dos microscopios de disección, uno al lado del otro, para evitar cambiar el enfoque y aumentar el tiempo necesario para transferir y organizar los cabezales en la etapa OCT y para reducir el riesgo de fusión de la etapa OCT.
  4. Después de que todas las cabezas de mosca estén alineadas, deje que la etapa OCT se asiente en el hielo seco durante otros 5-10 minutos.
  5. Retire la etapa OCT del hielo seco, colóquela sobre una superficie plana (banco) y luego, rápidamente, agregue una gran cantidad de compuesto OCT para cubrir todas las muestras y llene todo el criomolde, que toma ~ 3 s.
  6. Transfiera inmediatamente el criomold de nuevo al hielo seco y congele todo el bloque OCT que contiene los tejidos incrustados. Deje que la etapa OCT repose en el hielo seco durante otros 5-10 minutos. Etiquete las muestras en el margen del criomolde.
  7. Almacene las muestras congeladas a -80 °C hasta que estén listas para seccionarlas.

2. Criosección del tejido

NOTA: Cuando manipule los portaobjetos de óxido de indio y estaño (ITO), use guantes en todo momento para evitar la contaminación de los tejidos. También se recomienda usar una máscara para evitar respirar directamente sobre el tobogán.

  1. Confirme el lado recubierto con ITO probando la conductividad de las guías ITO utilizando un voltímetro ajustado a resistencia. Marque el lado con una medida de resistencia como el lado al que adherir el tejido. Etiquételo y siempre coloque una toallita de laboratorio en la parte inferior del portaobjetos para evitar la contaminación del portaobjetos.
  2. Permita que los tejidos se equilibren en la cámara de criostato durante 30-45 min.
    1. Para evitar la fusión de la OCT, coloque todas las herramientas necesarias, como fórceps y un pincel de artista de punta delgada en la cámara de criostato con anticipación para preenfriarlas.
  3. Limpie el criostato, preferiblemente con etanol al 70%. Limpie la placa antivuelco y la plataforma y retire las cuchillas usadas. Use toallitas limpias adicionales para asegurarse de que el etanol se haya evaporado y que todas las superficies estén secas antes de comenzar la sección.
  4. Ajustar la temperatura de la cámara de criostato y la cabeza de la muestra de acuerdo con el tipo de tejido (por ejemplo, -14 °C para el hígado, -20 °C para el músculo y -25 °C para la piel10; -18 °C para las cabezas de mosca en este protocolo).
  5. Monte el tejido en el portamuestras usando OCT. Tenga cuidado de usar suficiente OCT para cubrir la base del bloque OCT y monte el bloque lo más plano posible.
  6. Coloque una cuchilla limpia en el escenario y bloquéela. Coloque la cabeza de la muestra hacia la etapa según sea necesario para lograr el ángulo de corte deseado.
    1. Coloque el bloque de muestras en una orientación donde todos los genotipos/grupos de tratamiento se coloquen verticalmente a la cuchilla.
      NOTA: Esto garantiza un plano de corte consistente y evita la contaminación cruzada de diferentes grupos. Si corta un bloque diferente de tejido, cambie a una nueva cuchilla entre muestras para evitar la contaminación cruzada.
  7. Comience a cortar en secciones gruesas (50-100 μm) hasta que se encuentre la región de interés (por ejemplo, la región deseada del cerebro).
    1. Cepilla constantemente las piezas adicionales con un pincel de artista preenfriado para mantener el escenario limpio.
  8. Cambie el grosor de las secciones a 10-12 μm una vez que se alcance la región deseada.
    1. Ajuste ligeramente la temperatura de la cámara según sea necesario. Por ejemplo, establezca una temperatura más alta si la sección tiende a descamarse o desmoronarse fácilmente.
      NOTA: La temperatura recomendada para los bloques OCT es de -18 °C.
  9. Recoja cuidadosamente la sección deseada y adhiérala a la diapositiva ITO. Realice esta operación en la cámara de criostato.
    1. Tome un portaobjetos ITO a temperatura ambiente y colóquelo sobre la sección, acérquese a la sección suave y rápidamente para que la sección se adhiera al portaobjetos sin dejar rastros en la etapa de criostato.
      NOTA: La OCT se derretirá y se aferrará al portaobjetos.
  10. Coloque el portaobjetos a un lado en una rejilla o toallita de laboratorio fuera del criostato entre las colecciones de varias secciones.
  11. Si se desea comparar diferentes muestras de la misma cohorte, coloque las secciones de varias muestras en una sola diapositiva para un análisis simultáneo y una variación mínima. Si es necesario, sepáralos en dos diapositivas, ya que el soporte de destino MALDI puede acomodar dos diapositivas en una sola ejecución.
  12. Transporta las diapositivas en una caja de vacío a un desecador con desecante como capa inferior. Secar los portaobjetos al vacío durante 30-60 min.
    NOTA: Alternativamente, si el laboratorio no está equipado con un desecador de vacío, los portaobjetos deben mantenerse a -20 °C durante todo el proceso hasta su almacenamiento a -80 °C en 24 h o enviarse en hielo seco para evitar el deterioro de lípidos o metabolitos.
  13. Proceda a la deposición de la matriz. Utilice ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) en metanol/agua (70/30, v/v) como matriz.
  14. Si los portaobjetos no se ejecutan inmediatamente, almacene los portaobjetos a -80 °C (hasta 1 mes para secciones de cerebro de mosca y 6 meses para secciones de cerebro de roedores), o envíe inmediatamente la muestra a las instalaciones centrales de MALDI con hielo seco adecuado. Para un almacenamiento y envío óptimos, coloque los portaobjetos en un transportador de portaobjetos y selle de forma segura la abertura con película de cera. Selle con una bolsa con cremallera, colóquela en otra bolsa con cremallera que contenga desecante y etiquete el exterior.
    NOTA: Consulte el trabajo anterior para conocer los pasos seguidos del escaneo de diapositivas, la deposición de matrices y los procedimientos de imágenes MALDI11.
  15. Realice la deposición de la matriz utilizando el pulverizador automático de matriz HTX M5 y una solución de 40 mg / ml de DHB en metanol / agua (70/30, v / v). Pulverizar la matriz a un caudal personalizado de 0,12 ml/min y una temperatura de la boquilla de 85 °C durante 10 pasadas. Use una presión de gas N2 de 10 psi.
    NOTA: Si la presión del gas N2 en el pulverizador se reduce por debajo de 5 psi, un mecanismo de seguridad en el pulverizador apagará el calentador de inmediato para evitar cualquier daño al pulverizador con una velocidad de pulverización de 1.300 mm/min, una separación entre pistas de 2 mm, un caudal de 3 L/min y una altura de boquilla de 40 mm.
  16. Utilice un instrumento MS de tiempo de vuelo (TOF) MALDI (consulte la Tabla de materiales) en modo de iones positivos para adquirir un espectro de masas dentro de los rangos de masa de m / z 50-1,000.
    1. Para calibrar el instrumento, coloque 0,5 μL de emulsión de fósforo rojo en acetonitrilo en los portaobjetos ITO y utilice sus espectros para calibrar el instrumento en el rango de masa de 50-1.000 m/z aplicando una curva de calibración cuadrática2.
    2. Establezca los diámetros de punto láser en Medio, ya que es el perfil de haz modulado para un ancho ráster de 40 μm, y recopile datos de imágenes sumando 500 disparos a una tasa de repetición láser de 1.000 Hz por posición de matriz.
    3. Utilice software (consulte la Tabla de materiales) para registrar y procesar los datos espectrales. Realice análisis de datos de imágenes utilizando la normalización de la raíz cuadrática media (RMS) para generar imágenes de iones con un ancho de contenedor de ±0,10 Da. Alinee los espectros de la OCT y el tejido cerebral del mismo experimento utilizando el software para evaluar los picos superpuestos y la interferencia de supresión de iones de la OCT (Figura suplementaria S1). Después del experimento, procesar los portaobjetos MALDI que contienen las muestras de tejido mediante tinción de hematoxilina y eosina (H&E), como se describió anteriormente11.

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Representative Results

Se planteó la hipótesis de que la pérdida del receptor neuronal LpR1 de la lipocalina secretada por astrocitos Glial Lazarillo (GLaz), un homólogo de Drosophila de la ApoD humana, podía causar una disminución en el contenido general de lípidos en el cerebro de Drosophila. Para probar esto, se utilizó MALDI MSI para perfilar los lípidos en cerebros mutantes y de Drosophila mutantes y de tipo salvaje LpR1−/−, que se explica a continuación.

El experimento se realizó de acuerdo con el flujo de trabajo que se muestra en la figura 1. Los cerebros de moscas adultas fueron cosechados como se describió anteriormente. Se incrustaron en OCT, y se usó hielo seco para congelar el bloque OCT. El bloque de tejido OCT se crioseccionó a 12 μm de espesor y a -18 °C tanto para la cabeza de la muestra como para la cámara. Los portaobjetos ITO con criosecciones montadas en ellos se desecaron en vacío durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, la deposición de la matriz se llevó a cabo utilizando el pulverizador automático de matriz HTX M5 y una solución de 40 mg / ml de DHB en metanol / agua (70/30, v / v).

El instrumento MALDI time of flight (TOF) MS Autoflex en modo de iones positivos adquirió un espectro de masas dentro de los rangos de masa de 50-1.000 m/z. El espectro de la OCT y el tejido cerebral del mismo experimento se alinearon en SCiLS para evaluar los picos superpuestos y la interferencia de supresión de iones de la OCT (Figura suplementaria S1).

Los resultados de la Figura 2 muestran imágenes de salida del software de análisis de datos MALDI MSI de espectros m/z seleccionados donde los valores seleccionados mostraron una diferencia significativa en la distribución de lípidos entre LpR1 knockout y Drosophila de tipo salvaje. Las exploraciones revelaron una reducción general en el contenido de lípidos en el mutante LpR1−/−. Cada espectro fue analizado manualmente, y la identificación del analito se logró mediante referencias cruzadas de bases de datos METLIN y estudios previamente publicados 3,4. El triacilglicerol (TAG) y el fosfatidilglicerol (PG) se expresaron altamente en los cerebros de control en comparación con el mutante LpR1−/− (mostrando un cambio de hasta 10 veces en el TAG). Además, el diglicerol (DAG), la fosfatidilcolina (PC) y la fosfatidiletanolamina (PE) también se expresaron mínimamente en el genotipo mutante LpR1−/-.

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo de imágenes de espectrometría de masas MALDI-TOF. (A) Los cerebros de Drosophila están alineados en OCT colocados sobre hielo seco. (B-D) El bloque de tejido se criosecciona en secciones de 12 μm de espesor a -15 °C. La sección se aplana con un cepillo preenfriado y se derrite por descongelación en el lado recubierto de ITO de un portaobjetos de vidrio mantenido a temperatura ambiente. (E) La diapositiva está marcada con marcadores fiduciarios, recubierta con matriz y colocada en el instrumento MALDI. (F) La imagen MALDI de un cerebro de Drosophila se obtiene a una resolución de 40 μm utilizando DHB como matriz. Las regiones de los ojos (rojo, m/z 370.2), tejido de la cabeza (verde, m/z 184.1) y cerebro (azul, m/z 788.6) se muestran en la imagen multicanal superpuesta. (G) La tinción H&E se realiza en la misma sección de tejido después de MALDI MSI. (H) El flujo de trabajo de preparación, almacenamiento y transporte de muestras. Barras de escala = 500 μm (F,G). Abreviaturas: MALDI-TOF = desorción/ionización láser asistida por matriz tiempo de vuelo; OCT = compuesto de temperatura de corte óptima; ITO = óxido de indio y estaño; DHB = ácido 2,5,-dihidroxibenzoico; H&E = hematoxilina y eosina; MSI = imágenes de espectrometría de masas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imágenes representativas del análisis de MALDI MS que revelan una disminución general en el contenido de lípidos en el cerebro mutante LpR1−/−. Se muestran secciones representativas del cerebro de moscas adultas teñidas con H&E (izquierda). Las especies lipídicas, sus respectivos valores m/z y las escalas del mapa de calor son las indicadas. En la parte inferior, el pliegue promedio de reducción en el mutante LpR1−/− en comparación con los controles de al menos cuatro réplicas biológicas se muestra como números junto a las flechas. Barra de escala = 1 mm. Esta cifra ha sido modificada de Yin et al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Espectros de masas de OCT y tejido cerebral de Drosophila . Las criosecciones del bloqueo OCT cerebral de Drosophila de la Figura 1 se cubrieron uniformemente con matriz DHB antes de la obtención de imágenes MALDI. El espectro de masas de la región OCT en blanco seleccionada y la región del tejido cerebral de las moscas control y mutantes se mostraron en el rango de m / z 1-1,000 y m / z 520-900 (enriquecido con lípidos), respectivamente. La interferencia de OCT está asociada tanto con fenómenos de supresión de iones como con problemas de señal superpuestos. Abreviaturas: OCT = compuesto de temperatura de corte óptima; DHB = ácido 2,5-dihidroxibenzoico; MALDI = desorción/ionización láser asistida por matriz. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Como se demostró en el estudio sobre las variaciones en la composición de lípidos en cerebros mutantes y salvajes de Drosophila, MALDI MSI puede ser una valiosa técnica de imagen sin etiqueta para el análisis in situ de patrones de distribución molecular dentro de órganos de pequeños insectos. De hecho, debido a que los lípidos se distribuyen tanto en el tejido cerebral como en los cuerpos grasos de las cabezas de Drosophila, los enfoques lipidómicos convencionales basados en cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS) pueden detectar solo señales combinadas de ambas regiones cuando se utiliza la extracción de cabeza completa. En términos generales, el análisis lipidómico diferencial de subregiones dentro de órganos de un insecto tan pequeño como Drosophila es una tarea muy laboriosa y desafiante para los enfoques LC-MS18. Requeriría la disección de esas regiones, lo que impone grandes desafíos. En contraste, MALDI MSI proporciona una resolución adecuada para distinguir diferentes estructuras anatómicas, incluso dentro del pequeño cerebro de Drosophila. El beneficio de una cantidad mínima de requerimiento de tejido en comparación con la LC-MS convencional también podría aplicarse a muestras preciosas como biopsias clínicas. Además, las muestras preparadas para MALDI MSI también podrían ser examinadas mediante técnicas complementarias como TOF-SIMS e inmunohistoquímica, lo que permitiría la integración de los datos obtenidos de enfoques transversales19,20.

Uno de los pasos más importantes en MALDI MSI es la preparación de la muestra, la parte del experimento que explica la mayoría de las diferencias en los resultados de los estudios metabolómicos llevados a cabo en diferentes laboratorios21. El objetivo principal aquí es proporcionar un protocolo de preparación de muestras completo pero práctico para el análisis MALDI MSI de lípidos y metabolitos en organismos tan pequeños como los insectos Drosophila con la esperanza de ayudar a los investigadores con la implementación de MALDI MSI en sus estudios desde la biología básica hasta la ciencia traslacional.

Además de las precauciones para minimizar los cambios en los perfiles moleculares (tanto la abundancia como la distribución espacial) como se discutió anteriormente11, varias otras prácticas deben adaptarse al manipular tejidos pequeños. En primer lugar, el tiempo entre la recolección de tejido biológico y la congelación en la OCT debe minimizarse para reducir la probabilidad de isquemia postmortem21. En segundo lugar, se debe asegurarse de que se prepare una etapa plana de OCT antes de colocar el tejido en el bloque, lo cual es crucial para tener secciones de planos comparables en diferentes tejidos durante la sección. En tercer lugar, el corte de tejido biológico a pequeña escala o muestras preciosas necesita una práctica adecuada antes del experimento. Mientras que la OCT ayuda a cortar secciones uniformes, pueden surgir complicaciones en términos de curvatura o descamación del tejido. Para combatir el curling, se debe permitir que la sección descanse en el escenario durante unos segundos antes de retirar la placa antivuelco. Con dos pinceles, uno se puede usar para mantener la parte superior de la sección quieta, mientras que el otro se puede usar para desplegar la sección. Se debe tener cuidado para minimizar el contacto con el tejido trabajando principalmente con los bordes de las secciones de bloque. En cuarto lugar, aunque el método de montaje de descongelación podría usarse para menos cerebros de mosca (<10 cerebros), sería imposible transferir una sección que contiene una gran cantidad de cerebros de mosca (>30 cerebros) a un tobogán ITO frío sin perder un número notable de cerebros, que fácilmente se caerían de la sección de bloque una vez levantados. Por lo tanto, para un análisis rápido de una gran cantidad de cerebros de mosca, se debe utilizar el montaje de deslizamiento caliente. En particular, la diferencia de temperatura entre la sección OCT y el portaobjetos hará que la sección se adhiera y se adhiera al portaobjetos muy rápidamente. Por lo tanto, no se debe presionar la corredera caliente contra la sección y la etapa de criostato; en su lugar, uno debe acercarse suave y rápidamente a las secciones para permitir que la sección se adhiera a la diapositiva ITO sin tocar la etapa de criostato. No observamos ningún rastro notable de las secciones dejadas en la etapa de criostato en comparación con el método de montaje de descongelación. En quinto lugar, una deposición uniforme y fina de la matriz MALDI es crucial para lograr información espacial sólida y precisa durante la adquisición. Se recomienda utilizar un portaobjetos en blanco para probar la deposición de la matriz para una cobertura adecuada antes de proceder al portaobjetos que contiene la muestra.

Con su creciente popularidad y avances, se espera que MALDI MSI llegue a una base más amplia de usuarios y se convierta en una herramienta estándar para las mediciones de masa molecular de analitos como aminoácidos, metabolitos, lípidos, péptidos y proteínas, y otras moléculas pequeñas extraídas directamente de tejidos biológicos10. Sin embargo, tiene sus propias limitaciones y desafíos. Cuando se preparan muestras frágiles y de pequeña escala para MALDI MSI, se necesitan agentes incrustantes como OCT para el seccionamiento. Sin embargo, la OCT contiene una combinación de polímeros (poli(alcohol vinílico), polietilenglicerol y cloruro de benzalconio), que crea una señal de fondo polimérica que puede interferir con la señal del analito22. Se ha informado que los compuestos de incrustación alternativos, como la gelatina y la carboximetilcelulosa (CMC), demuestran menos efectos de supresión de iones. La gelatina muestra señales menos intensas que están más dispersas en el rango de baja masa de 100-600 m / z20,23,24. CMC también se ha utilizado en MALDI MSI de Drosophila para visualizar metabolitos como GABA, aunque requiere sumergir las cabezas en etanol al 70% antes de la incrustación para una adhesión óptima25.

A pesar de la tendencia de OCT a la supresión de señales, este protocolo procede con su uso debido a la capacidad superior de OCT para proporcionar una sección confiable de un gran número de muestras al tiempo que preserva la morfología del cerebro. Los investigadores han descubierto que, mientras que la gelatina y la CMC se dividen bien en espesores altos como 20 μm, solo la OCT es capaz de producir secciones consecutivas de 12 μm de manera confiable26. La CMC y la gelatina carecen de la integridad estructural y el agarre hermético del tejido que proporciona la OCT, lo que establece el límite del número de tejidos pequeños, como el cerebro de la mosca, que se acomodarán en un bloque26. Se ha informado que las señales de MS de las secciones de mosca integradas en OCT son comparables a las incrustadas en gelatina y CMC26. Nuestros datos no publicados también indicaron que las secciones cerebrales de mosca montadas en caliente e integradas en OCT generaron señales lipídicas robustas comparables al tejido incrustado en gelatina montado en deshielo. En general, debido a la capacidad superior de la OCT para preservar la integridad de la morfología del tejido y permitir un seccionamiento preciso de la muestra en comparación con otros compuestos de incrustación, su uso con muestras de alta fragilidad, como matrices de cerebros de Drosophila , sigue siendo una opción. En ese escenario, solo debe hacerse la cuantificación relativa de la comparación de muestras del mismo experimento, pero no la cuantificación absoluta. Con respecto a nuestro estudio informado del modelo de Drosophila en el análisis de lípidos, se concluyó que los beneficios de la OCT superan sus limitaciones. Además, se deben realizar experimentos de prueba para probar si las señales de EM de los analitos objetivo estarían enmascaradas por las señales de OCT.

Además, es necesario adaptar varias prácticas para minimizar los efectos de la supresión de iones. Primero, uno debe procesar las muestras de diferentes grupos al mismo tiempo para garantizar el mismo grado de supresión de iones, si lo hay. En segundo lugar, en la selección de la región de interés para el escaneo MALDI, se debe evitar la región OCT y delinear solo la región del tejido. Por último, se debe seleccionar una región de OCT en blanco para escanearla como control negativo para excluir las señales de OCT durante el análisis de datos.

El campo de la lipidómica surgió a principios de la década de 2000 y ha avanzado rápidamente en los últimos años, en gran parte debido a los desarrollos en espectrometría de masas, incluido MALDI MSI27. Estas técnicas avanzadas han ayudado a impulsar el campo hacia aplicaciones biológicas y biomédicas. Por ejemplo, la lipidómica se puede emplear en estudios neurológicos, ya que los cambios en los niveles de tráfico y composición de lípidos cerebrales se pueden utilizar como biomarcadores de enfermedad. Además, la lipidómica ha llevado a la identificación de nuevas moléculas de señalización, el desarrollo de pruebas de eficacia de medicamentos, el descubrimiento de mecanismos subyacentes a las condiciones fisiopatológicas y más28. A pesar de los notables logros alcanzados por el campo en los últimos años, todavía hay áreas que exigen crecimiento. Por ejemplo, la capacidad de un lípido para ser cuantificado con precisión utilizando la tecnología actual sigue siendo objeto de debate29. Además, el mapeo completo del lipidoma celular tiene mucho progreso que hacer. Se espera que estas áreas, entre otras en el campo, experimenten un crecimiento significativo en los próximos años.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy y Mayan Hein cuentan con el apoyo del Programa de Investigación de Verano de CUNY (CSURP) de la Fundación Sloan. Jun Yin cuenta con el apoyo del programa de investigación intramuros del Proyecto de los Institutos Nacionales de Salud Número 1ZIANS003137. El apoyo para este proyecto fue proporcionado por un Premio PSC-CUNY a Ye He y Rinat Abzalimov, financiado conjuntamente por el Congreso de Personal Profesional y la Universidad de la Ciudad de Nueva York.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) Millipore Sigma Aldrich 85707-1G-F
Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 Fisher Scientific NC9464347
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Fisher Scientific 14-373-65
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE Fisher Scientific 50-111-2302
autoflex speed MALDI-TOF MS system Bruker Daltonics Inc MALDI-TOF MS instrument
BD Syringe with Luer-Lok Tips Fisher Scientific 14-823-16E
BD Vacutainer General Use Syringe Needles Fisher Scientific 23-021-020
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG Fisher Scientific NC0380464
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics AC219095000
Epson Perfection V600 Photo Scanner Amazon Perfection V600
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer Fisher Scientific HS15986
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter Fisher Scientific 01-241-1
FlexImaging v3.0 Bruker Daltonics Inc Bruker MS imaging analysis software
HPLC Grade Methanol Fisher Scientific MMX04751
HPLC Grade Water Fisher Scientific W5-1
HTX M5 Sprayer HTX Technologies, LLC Automatic heated matrix sprayer
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
MSC Ziploc Freezer Bag Fisher Scientific 50-111-3769
SCiLS Lab (2015b) SCiLS Lab Advanced MALDI MSI data analysis software
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat Fisher Thermo Scientific 95-713-0
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator Fisher Scientific 08-642-7

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References

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Preparación de muestras para el análisis rápido de lípidos en el cerebro de <em>Drosophila</em> utilizando imágenes de espectrometría de masas de desorción / ionización láser asistidas por matriz
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