Summary
Apresentamos um protocolo para o cultivo ex vivo de tecido miocárdio ventricular humano. Permite uma análise detalhada da força de contração e cinética, bem como a aplicação de carga pré e posterior para imitar o ambiente fisiológico in vivo mais de perto.
Abstract
O cultivo de cardiomiócitos tem visto um grande número de desenvolvimentos, desde o cultivo de células bidimensionais (2D) até organoides derivados do iPSC. Em 2019, foi demonstrada uma forma ex vivo de cultivar fatias de miocárdio obtidas a partir de amostras de coração humano, ao mesmo tempo em que se aproximava da condição in vivo de contração do miocárdio. Estas amostras são originárias principalmente de transplantes cardíacos ou colocações de dispositivos de assistência à esquerda. Utilizando um vibratome e um sistema de cultivo especialmente desenvolvido, fatias de 300 μm de espessura são colocadas entre um fio fixo e um fio de mola, permitindo um cultivo estável e reprodutível por várias semanas. Durante o cultivo, as fatias são continuamente estimuladas de acordo com as configurações individuais. Contrações podem ser exibidas e registradas em tempo real, e agentes farmacológicos podem ser prontamente aplicados. Os protocolos de estimulação definidos pelo usuário podem ser agendados e realizados para avaliar parâmetros vitais de contração, como potencialização pós-pausa, limiar de estimulação, relação força-freqüência e período refratário. Além disso, o sistema permite uma configuração variável de pré e pós-carga para um cultivo mais fisiológico.
Aqui, apresentamos um guia passo-a-passo sobre como gerar um cultivo bem-sucedido a longo prazo de fatias de miocárdio ventricular esquerdo humano, utilizando uma solução comercial de cultivo biomimético.
Introduction
Na última década, o cultivo in vitro de células miocárdias fez grandes avanços, desde técnicas 2D e tridimensionais (3D) até o uso de organoides e células-tronco pluripotentes induzidas diferenciadas em miócitos cardíacos 1,2,3. Os cultivos de ex vivo e células primárias têm se mostrado de grande valor, especialmente para estudos genéticos e desenvolvimento de medicamentos 4,5,6. O uso de tecidos humanos melhora o valor translacional dos resultados. O cultivo 3D a longo prazo de tecidos miocárdios com geometria intacta, no entanto, não é bem estabelecido. A geometria intacta é uma característica fundamental para imitar condições in vivo, já que a função cardíaca adequada, a comunicação entre diferentes células, bem como as interações entre matriz celular são pré-requisitos. O cultivo de tecido miocárdio passou por várias fases de desenvolvimento. A taxa de sucesso e a estabilidade do cultivo de tecido miocárdio ex vivo foram inicialmente bastante baixas, mas abordagens recentes produziram resultados promissoresde 7,8,9,10,11.
Entre eles, Fischer et al. foram os primeiros a demonstrar que a viabilidade e o desempenho contítil do tecido miocárdio humano podem ser mantidos no cultivo de células ex vivo por muitas semanas7. Sua técnica foi baseada em fatias finas de tecido cortadas do miocárdio humano explantado, que foram montadas em câmaras de cultivo recém-desenvolvidas que forneceram condições biomecânicas definidas e estimulação elétrica contínua. Este método de cultivo se assemelha muito à função in vivo do tecido miocárdio, e foi reproduzido por vários grupos de pesquisa independentes 2,12,13,14,15. É importante ressaltar que as câmaras utilizadas por Fischer et al. também permitiram o registro contínuo de forças desenvolvidas por até 4 meses, e assim abriram oportunidades inéditas para pesquisas fisiológicas e farmacológicas sobre miocárdio humanointacto 7.
Técnicas semelhantes foram desenvolvidas independentemente por outros grupos e aplicadas ao miocárdio humano, rato, suíno e coelho 7,10,11. Pitoulis et al. desenvolveram posteriormente um método mais fisiológico, que reproduz a relação normal de comprimento de força durante um ciclo de contração, mas é menos adequado para análise de alto rendimento16. Como tal, a abordagem geral do cultivo biomimético pode ser considerada como mais um passo para a redução, refinamento e substituição (3R) de experimentos animais.
No entanto, a exploração desse potencial requer procedimentos padronizados, análises de alto conteúdo e um alto nível de rendimento. Apresentamos uma técnica que combina o corte automatizado do miocárdio humano vivo com a manutenção in vitro em um sistema de cultivo biomimético que se tornou comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais). Com a abordagem proposta, o número de fatias individuais que podem ser geradas a partir de uma única amostra miocárdia transmural é limitado apenas pelo tempo de processamento. Uma amostra de tamanho e qualidade suficientes (3 cm x 3 cm) muitas vezes produz 20-40 fatias de tecido sendo convenientemente cortadas com um vibratome automatizado. Essas fatias podem ser colocadas em câmaras de cultivo pertencentes ao sistema. As câmaras permitem estimulação elétrica, cujas parâmetros podem ser moduladas (ou seja, duração do pulso, polaridade, taxa e corrente), bem como o ajuste da pré e pós-carga, utilizando fios de mola dentro das câmaras. A contração de cada fatia é registrada a partir do movimento de um pequeno ímã ligado a um fio de mola e exibido como um gráfico interpretável. Os dados podem ser registrados o tempo todo e analisados usando software livremente disponível. Além do ritmo constante da linha de base, protocolos programados podem ser realizados para avaliar funcionalmente seu período refratário, limiar de estimulação, potencialização pós-pausa e relação de frequência de força.
Este cultivo biomimético de longo prazo de múltiplas fatias de miocárdio de um coração individual abre caminho para futuras pesquisas ex vivo em tecido humano e animal, e facilita a triagem para efeitos terapêuticos e cardiotóxicos de drogas na medicina cardiovascular. Já foi aplicado em diversas abordagens experimentais 2,12,13,15. Aqui, damos uma descrição detalhada passo a passo da preparação do tecido humano e fornecemos soluções para problemas de cultivo frequentemente encontrados.
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Protocol
A coleta de tecidos para os experimentos aqui descritos foi aprovada pelos Conselhos de Revisão Institucional da Universidade de Munique e do Bochum ruhr-university. Os estudos foram realizados de acordo com as diretrizes da Declaração de Helsinque. Os pacientes deram seu consentimento por escrito informado antes da coleta de tecidos.
1. Aquisição de tecidos
- Obtenha tecido humano de pacientes submetidos a transplante de coração ou cirurgia cardíaca.
- Antes de obter o tecido, prepare 2 L de solução cardioplégica (ainda chamada de tampão de corte (Tabela 1)).
- Após obter uma biópsia ventricular transmural (LV) de 4 cm x 4 cm de tamanho, coloque o tecido imediatamente (dentro de 5 minutos após a excisão) em um béquer estéril de plástico closable contendo aproximadamente 70 mL de tampão de corte frio (4 °C). Mantenha a 4 °C.
NOTA: O tampão de corte utilizado neste protocolo permite o armazenamento a frio (4 °C) do tecido por até 36 h. Isso permite o transporte frio do tecido de clínicas que não estão próximas ao laboratório. No entanto, os tempos de transporte ≤ 24 h provaram ser ótimos.
2. Preparação agarose e vibratome
- Certifique-se de que as câmaras de cultivo suficientes sejam preparadas e esterilizadas (Figura 1A).
- Submergir as câmaras e eletrodos de grafite em 1 L de uma solução isopropanol de 10% e agitar durante a noite. No dia seguinte, transfira as câmaras para uma solução de isopropanol 100% por 3 min e autoclave os eletrodos de grafite a 120 °C por 10 min.
- Deixe as câmaras e eletrodos de grafite secarem sob um capô de fluxo laminar.
- Conecte uma placa de circuito a cada uma das câmaras de acordo com as posições disponíveis no roqueiro. Coloque dois eletrodos de grafite na placa de circuito de acordo com as instruções do fabricante.
- Coloque uma tampa de placa de Petri de 35 mm em cima da câmara para evitar contaminação.
- Configure o sistema de cultivo Myodish (ver Tabela de Materiais) em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2 conectando o sistema a um computador (Figura 1B).
- Prepare a 4% de baixa derretimento em tampão de corte (sem glicose; Tabela 2). A agarose pode ser armazenada a 4 °C por 6 meses.
- No dia do experimento, derreta um volume de estoque de solução agarose usando um banho de água a 80 °C. Dependendo da quantidade, o derretimento leva aproximadamente 30 minutos.
- Quando a agarose for líquida, elasenhe 8 mL de líquido em uma seringa de 10 mL, com um adicional de 2 mL de ar. Feche a seringa com uma tampa estéril e coloque-a de cabeça para baixo em um banho de água de 37 °C por 20 minutos, para evitar que a agarose se solidifique e equilibre sua temperatura para evitar danos de hipertermia da amostra.
- Se presente, ligue o dispositivo de resfriamento de água do vibratome pelo menos 30 minutos antes do corte tecidual para permitir capacidade de resfriamento suficiente. Coloque a temperatura da circulação da água para 4 °C.
NOTA: A bandeja de corte e a placa de resfriamento utilizada aqui continham uma circulação de água embutida. Isso é altamente recomendado para resfriamento e para diminuir os riscos de contaminação. No entanto, também é possível usar o gelo como técnica de resfriamento. Além disso, o dispositivo de resfriamento de água não precisa ser conectado à bandeja de corte do vibratome e/ou placa de resfriamento neste ponto do protocolo. - Limpe a bandeja de fatiamento do vibratome e a placa de amostra, lavando todas as superfícies com isopropanol 100% por pelo menos 3 minutos.
NOTA: Dependendo do sistema vibratome utilizado, a configuração do vibratome pode diferir. Consulte o manual do vibratome presente no laboratório para obter informações sobre os métodos de configuração e calibração da lâmina. - Encha a bandeja de corte até 90%-95% com tampão de corte. Na configuração atualmente utilizada, isso corresponde a aproximadamente 400 mL. Conecte a tubulação do dispositivo de resfriamento de água às válvulas da bandeja de corte do vibratome e da placa de resfriamento.
- Desinfete todas as ferramentas necessárias para a preparação submergindo-as em uma solução de isopropanol 100% para 5 s. Remova as ferramentas da solução isopropanol e seque ao ar sob o capô de fluxo laminar.
3. Aparar e incorporar as amostras
- Transfira a amostra de tecido para uma placa de Petri de 100 mm cheia de tampão de corte frio. Mantenha o prato em uma placa de resfriamento a 4 °C (conectado ao refrigerador ou colocado no gelo).
- Remova a trabecula do endocárdio segurando o endoárdio com pinças e usando uma tesoura para cortar aproximadamente 3 mm de tecido endocárdio. Da mesma forma, remova o tecido adiposo excessivo sob o epicárdio se estiver presente.
- Fixar a amostra de tecido cortado, lado do endocárdio para cima, a um patch de borracha de 2 cm x 2 cm usando quatro agulhas de 0,9 mm x 70 mm 20 G fixadas em posição quadrada (0,9 cm x 0,9 cm; Figura 1C, D). Certifique-se de que a borda diagonal de cada ponta da agulha está apontando para dentro. Isso aumenta a fixação e evita danos ao miocárdio.
ATENÇÃO: A orientação do quadrado acima mencionado deve ser ortogonal à direção predominante de miofibra esperada. - Corte todo o excesso de tecido fora do quadrado de quatro agulhas usando um bisturi. Se o tamanho da amostra original permitir, use duas amostras de tecidos miocárdios durante esta preparação da mesma amostra bruta.
- Usando pinças, coloque a amostra aparada em um pedaço de tecido estéril para remover qualquer excesso de tampão de corte deixado na amostra. Para evitar a secagem da amostra, não mantenha a amostra no tecido por mais de 10 s.
- Coloque a amostra em uma placa de Petri de 35 mm, de tal forma que a lâmina corte perpendicularmente ao alinhamento do cardiomioco e o epicárdio esteja voltado para baixo. Se a preparação incluir duas amostras, certifique-se de que as amostras estão centradas e não se toquem.
- Pegue a seringa agarose do banho de água e submerse a amostra em agarose. (Figura 2A). Deixe a agarose solidificar por 5 minutos em uma placa de resfriamento. A amostra deve manter contato com a placa de Petri, o que garantirá que o plano de corte será paralelo à direção predominante da fibra miocárdia.
ATENÇÃO: Não esvazie totalmente a seringa, a fim de evitar bolhas de ar. Preste atenção à quantidade de agarose que é deixada na seringa durante o submerso das amostras. No caso de bolhas de ar no prato com as amostras, puxe cuidadosamente bolhas de ar de volta para a seringa.
4. Colocar as amostras na bandeja de corte
- Remova a agarose solidificada contendo a amostra(s) da placa de Petri de 35 mm usando uma espátula ou ferramenta semelhante, tecendo-a entre a amostra e o lado da placa de Petri. Corte parte da agarose usando um bisturi enquanto mantém as amostras cobertas.
ATENÇÃO: Não remova muito da agarose. Deve haver pelo menos 5 mm de agarose nos lados longos e curtos no plano X/Z.
NOTA: As etapas 4.2-4.4 precisam ser realizadas em rápida sucessão (ou seja, máximo de 5 s). Tenha todas as ferramentas necessárias ao alcance antes de iniciar. Nenhum reposicionamento da amostra é possível após a colocação. Tente limitar a exposição da cola ao ar e à umidade. O contato com o ar ou fluidos solidificará a cola, tornando-a inutilizável. - Com uma pipeta, coloque e distribua 60 μL de cola dentro e ao redor do centro da plataforma de corte.
- Coloque o lado epicárido da amostra contida em agarose em cima da área colada usando pinças. Não reposicione. O lado endocárdio da amostra deve ser visível na agarose. Deixe a cola solidificar por 1 min. Pressione suavemente a agarose contendo a amostra da parte superior com uma ferramenta sem corte (por exemplo, pinças) enquanto evita cortar ou danificar a ágarose.
- Coloque a plataforma de amostra em sua posição designada na bandeja de corte do vibratome, preenchida com tampão de corte.
5. Começando o vibratome
- Defina amplitude de vibração para 1 mm e a velocidade inicial de corte para 0,07 mm/s. Coloque a espessura da fatia em 300 μm para cortar fatias.
- Desde que a lâmina corte apenas a agarose, aumente a velocidade de corte ao máximo, que neste caso é de 1,50 mm/s. Assim que o vibratome começar a cortar o tecido, diminua a velocidade para 0,07 mm/s imediatamente.
NOTA: Se o tecido não for fatiado sem problemas, por exemplo, se houver grandes áreas fibrosas na amostra, pode ajudar a aumentar a amplitude de corte até 1,5 mm e reduzir a velocidade de corte para 0,04 mm/s.
6. Preparação média e incubadora durante o procedimento de corte
- Encha cada câmara de cultivo com 2,4 mL de meio de cultivo completo (Tabela 3).
- Coloque as câmaras de cultivo preenchidas com médio no sistema de cultivo na incubadora fixada em 37 °C, 5% CO2, 21% O2 e umidade de 80%. Equilibre o meio por pelo menos 20 minutos.
- Conecte o sistema de cultivo com um computador e inicie o programa de software correspondente.
- Defina a velocidade do roqueiro a 60 rpm e predefinir os parâmetros de estimulação (pulsos de estimulação e frequência). Para fatias cardíacas humanas, defina a estimulação padrão para impulsos bifásicos com corrente de 50 mA, cada uma composta por corrente positiva de 3 ms, uma pausa de 1 ms e um pulso de 3 ms de corrente invertida, a uma taxa de ritmo de 30 batidas por minuto (BPM).
NOTA: Em tecidos bem preservados, o limiar típico de estimulação é de cerca de 15 mA. Para garantir uma estimulação confiável e para explicar qualquer possível aumento do limiar de estimulação, recomenda-se definir a corrente para um valor que exceda o limiar de estimulação em duas a três vezes. - Verifique os indicadores de eletrodos do software para verificar se os eletrodos das câmaras de cultivo estão funcionando corretamente.
NOTA: Ação é necessária sempre que o indicador de canal no software de cultivo fica vermelho. Neste caso, as cargas de pulso bipolar não são equilibradas.
7. Preparando as fatias
NOTA: As fatias subendocardiais iniciais não são comumente adequadas para o cultivo de tecidos e precisam ser descartadas devido à morfologia desigual. Após as primeiras cinco a 10 fatias, a textura da fatia e a morfologia melhoram. A fatia ideal é de pelo menos 1 cm x 1 cm, não tem ou apenas manchas fibrosas limitadas, não é fragmentada e tem alinhamento de fibras homogêneas (Figura 2B, D). A fibrose intersticial, localizada entre as fibras do miócito, está frequentemente presente na falha do miocárdio humano. Surpreendentemente, este não é um preditor negativo do sucesso do cultivo.
- Despeje uma quantidade adequada de tampão de corte frio em uma tampa de placa de Petri de 5 cm para garantir que as fatias não sequem. Coloque as fatias na tampa da placa de Petri contendo o tampão de corte frio.
- Separe a ágarose do tecido usando pinças. Evite tocar no tecido. Manuseie o tecido cuidadosamente, pois qualquer dano ao tecido reduzirá a taxa de sucesso do cultivo.
- Determine a direção das fibras do miocárdio por uma inspeção minuciosa contra uma fonte de luz. Isso é importante ao fixar os triângulos plásticos ao tecido na etapa 7.6.
NOTA: As etapas 7.4 e 7.5 precisam ser realizadas em rápida sucessão, dentro de 5 s. - Conecte dois triângulos plásticos a uma amostra usando cola para ancorar o tecido dentro das câmaras de cultivo.
- Coloque 1 μL de cola em uma tampa estéril da placa de Petri. Use uma pinça ligada para pegar um dos triângulos plásticos autoclavados. Mergulhe rapidamente a borda frontal do triângulo na cola e cole o triângulo na amostra, perpendicular ao alinhamento do cardiomiócito. Repita para o outro triângulo.
- Corte o tecido que exceda a largura do triângulo com um bisturi (Figura 2C). Coloque a fatia com os dois triângulos montados de volta no tampão de corte da bandeja de corte.
NOTA: Repita as etapas 7,2 a 7,5 até que sejam preparadas fatias suficientes para encher as câmaras de cultivo. Recomendamos preparar algumas fatias adicionais para permitir a substituição de fatias por contração ruim.
8. Montagem das fatias
NOTA: A carga posterior é determinada pela rigidez do fio de mola nas câmaras de cultivo. Três tipos diferentes estão disponíveis, com base na espessura do fio de mola.
- Pegue uma câmara de cultivo de preenchimento médio da incubadora. Selecione uma das fatias preparadas e insira-a na câmara conectando um triângulo a cada pino.
- Ajuste a distância entre os pinos de montagem de acordo com o tamanho da amostra. Certifique-se de que a amostra está submersa em meio. Coloque a câmara de volta em seu soquete designado do sistema de cultivo na incubadora.
ATENÇÃO: Não estique demais o tecido e não dobre demais o fio de mola! - Coloque a tensão de pré-carga após a colocação do prato no roqueiro.
- Diminua a pré-carga girando o parafuso de ajuste no sentido anti-horário. Faça isso até que a linha de base do gráfico correspondente na tela do computador não mude mais.
- Aumente cuidadosamente a pré-carga (ou seja, aumente a tensão) girando o parafuso de ajuste no sentido horário. Para as câmaras com maior rigidez, continue até que a linha de base correspondente no gráfico tenha aumentado em 1000-1200 unidades, o que corresponde a 1 mN de pré-carga.
NOTA: O ajuste exato dependerá da constante de mola individual de uma câmara de cultivo, que pode ser determinada pela calibração antes de um experimento de acordo com as instruções do fabricante. O software de gravação permite a consideração da calibração individual da câmara para que as forças sejam exibidas uniformemente em μN. Recomenda-se aplicar estimulação elétrica desde o início do cultivo. Como tal, é bem possível que a fatia comece a contrair durante o ajuste de pré-carga. Neste caso, concentre-se na linha de base diastólica para avaliar a pré-carga.
9. Mudando o meio
- Prepare o meio de cultivo de acordo com a receita na Tabela 3. Pouco antes do uso do meio, adicione 50 μL de β-mercaptoetanol (50 mM) a um tubo de 50 mL. Armazenar a 4 °C.
- Uma vez a cada 2 dias, troque parcialmente o meio de cultivo. Refrescar o meio a cada 2 dias, se desejar o cultivo a longo prazo das fatias do miocárdio.
- Pré-aqueça o meio fresco em banho-maria ou incubadora de ar quente a 37 °C por 30-45 min. Remova uma câmara de cultivo da incubadora e coloque-a sob uma coifa de fluxo laminar.
ATENÇÃO: É essencial manter a câmara, assim como o médio, aquecido a 37 °C (> 35 °C) para evitar hiperconduções devido à baixa temperatura. Danos menos distintos podem estar presentes como um aumento da tensão diastólica dentro de poucas horas após a troca média. Isso pode parecer se recuperar, mas o estresse repetido pode resultar em deterioração acumulada. - Retire o meio da câmara de cultivo, deixando aproximadamente 0,8 mL na câmara. Adicione 1,6 mL de meio fresco à mesma câmara. O volume total de médio deve ser de cerca de 2,4 mL por câmara.
- Coloque a tampa da câmara de volta e coloque a câmara de cultivo de volta em sua respectiva posição.
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Representative Results
A contração das fatias do miocárdio foi exibida na tela do computador após a inserção da câmara de cultivo em seu conector correspondente (Figura 3). A contração das fatias do miocárdio humano começou imediatamente após a estimulação. As fatias hipercontratadas por 5-10 min. Isso foi visível como um aumento das forças diastólicas, causadas por uma contratura tônica de frações de tecido danificadas. Esse processo foi revertido para diferentes graus dentro de 1-1,5 h. Após a estabilização, as fatias de tecido lv humano mostraram forças de contração variando entre 1 mN e 3 mN após a estimulação. O systole é mostrado como um forte aumento da força de contração, seguido por diastole com uma diminuição igualmente íngreme da força de contração.
A contração das fatias do miocárdio foi registrada pelo software de cultivo e salva em um arquivo designado. Cada um dos arquivos de dados brutos gerados foram convertidos em um formato de arquivo binário Axon legível (.abf) para fácil análise e quantificação dos dados. Para a análise inicial, o arquivo .abf foi aberto em um programa apropriado. Foram selecionados aproximadamente 5 minutos de dados de contração para estabelecer a amplitude média de contração durante esse período. Isso foi feito por vários pontos de tempo no arquivo de dados gravado. A plotagem desses valores de contração ao longo do tempo rendeu um gráfico útil para comparar o desenvolvimento de contração em um ambiente de controle e experimental. Para obter uma visão mais avançada sobre o desempenho das fatias geradas, foram executados protocolos de estimulação. Durante esses protocolos, que levam aproximadamente 45 min, os parâmetros de estimulação foram alterados para avaliar parâmetros de acoplamento de contração.
O protocolo de estimulação atual consistiu em quatro seções distintas: potencialização pós-pausa, limiar de estimulação, relação força-freqüência e período refratário (Figura 4, Tabela 4). Durante a potencialização pós-pausa, a estimulação é retomada após uma breve parada de 3, 12, 50 ou 120 s. Para determinar o limiar de estimulação, a corrente de estimulação é aumentada em etapas de 3 mA a cada 10 s, começando em 8 mA e aumentando para 90 mA. Com este teste, a corrente de estimulação mínima pode ser determinada para cada fatia. Isso não altera as configurações de estimulação geral fora do protocolo de estimulação. A relação força-freqüência é avaliada por um aumento passo a passo da frequência de estimulação (20, 30, 45, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 210 e 240 BPM), enquanto a respectiva duração de cada etapa é encurtada em paralelo. Com exceção das duas primeiras configurações de frequência, esse regime rende entre 20-40 contrações durante cada etapa. O período refratário de cada fatia é avaliado enviando um estímulo prematuro (S2) após um estímulo normal (S1; 30 BPM). O intervalo S1-S2 é encurtado a cada 10 s.
Para demonstrar o potencial do sistema de cultivo apresentado como ferramenta de teste de intervenções farmacológicas, as fatias de tecido LV humano ex vivo foram preparadas a partir do mesmo paciente e submetidas a agentes farmacológicos que influenciam os níveis de íon de cálcio intracelular (Ca2+) (n = 1) após 2 semanas de cultivo. O antagonista ca2+canal nifedipine do tipo L inibe o influxo ca2+ nas células miocárdias e, portanto, reduz a disponibilidade intracelular de Ca2+ e reduz a contratilidade17. Por causa de sua ação vasodilatador, a nifedipina é usada como uma droga anti-hipertensiva. Para demonstrar diferenças farmacológicas dos antagonistas ca2+canais, a calciseptina foi investigada para comparação. Calciseptine também é um antagonista do tipo L Ca2+-canal, extraído do Veneno de Dendroaspis p. polylepis 18. Portanto, compartilha a ação inotrópica negativa da nifedípitina. No entanto, a calciseptina tem características de ligação diferentes e é mais potente em comparação com a nifedipine19. Para estudar as modulações positivas e negativas da disponibilidade de Ca2+ , também testamos o agonista do canal de cálcio Bay-K8644 (1,4-Dihydro-2,6-dimetila-5-nitro-4-(2-[trifluorometila]fenil)piridina-3-carboxílico ácido metil ester)20.
Três fatias foram tratadas com nifedipina (125 nM), calciseptina (70,8 nM) e Bay-K8644 (417 nM), respectivamente, enquanto a quarta fatia não recebeu droga (controle). As forças de contração sob parâmetros de estimulação geral (corrente de 50 mA, pulsos bifásicos de 3 ms de duração, intervalo de 1 ms e taxa de ritmo de 30 BPM) foram comparadas antes e depois do tratamento. Além disso, antes do tratamento, foi executado um protocolo de estimulação para avaliar os valores básicos para potencialização pós-pausa, limiar de estimulação, relação força-freqüência e período refratário. Após 30 minutos de tratamento, um segundo protocolo de estimulação foi executado. Para eliminar as diferenças inter-individuais, a amplitude de contração de cada fatia foi normalizada ao seu nível de linha de base antes do tratamento. A linha de base (ou seja, 100%) foi determinada pela análise dos últimos cinco ciclos de contração antes do início do protocolo de estimulação pré-tratamento.
Ao analisar a contração das fatias na estimulação geral, observou-se que a força de contração das fatias tratadas com antagonistas Ca2+ (nifedipine e calciseptina) diminuiu dentro de 10 minutos pós-tratamento (Figura 5) e o efeito foi presente até 20 min após o tratamento. Em contraste, a tensão fechada ca2+ canal agonista Bay-K8644 aumentou a força de contração da fatia tratada. A fatia de controle não mostrou uma mudança notável. Os dados de contração gerados durante os protocolos de estimulação foram analisados de forma semelhante. Aqui, os dados gerados pelo protocolo de estimulação realizado antes do tratamento (pré-tratamento) foram comparados aos dados pós-tratamento do mesmo protocolo de estimulação.
Como discutido anteriormente, o protocolo de estimulação começou com a avaliação da potencialização pós-pausa. Durante a pausa, o Ca2+ adicional é tomado pelo ânticulo sarcoplasmático (SR), que é liberado após a primeira estimulação após a pausa. Assim, a potencialização pós-pausa reflete a liberação intracelular ca2+ do SR. Como tal, este parâmetro pode ser usado para avaliar a contribuição relativa de Ca2+ liberado da RS pelo receptor de ryanodine. Para avaliar a potencialização das fatias após uma pausa de estimulação, a força da primeira contração após a pausa foi dividida pela contração média antes da respectiva pausa. A fatia de controle não mostrou nenhuma alteração notável (Figura 6A). Observou-se que a inibição dos canais Ca2+ tipo L levou à potencialização da primeira contração após uma pausa de pelo menos 50 s (Figura 6B,D), refletindo uma maior contribuição relativa da liberação intracelular Ca2+ para a contratilidade total. O efeito oposto foi observado na fatia tratada com Bay-K8644, que estimula a entrada de Ca2+extracelular através dos canais Ca2+ tipo L (Figura 6C).
A relação força-freqüência foi avaliada pelo aumento sucessivo da taxa de ritmo até 180 BPM. Para melhor visualização, a força de contração em diferentes frequências de estimulação foi normalizada para a contração da linha de base em 30 BPM dentro do mesmo protocolo (=100%). A análise dos dados mostrou que o tratamento com calciseptina não alterou a capacidade da fatia de seguir os estímulos após o aumento da frequência de estimulação ao comparar os dados pré e pós-tratamento (Figura 7B). Não foi observada alteração na fatia de controle (Figura 7A). Ao contrário da calciseptina, a nifedipina impediu um aumento da contração a taxas de ritmo mais altas e reduziu a taxa máxima de captura para 80 BPM (Figura 7D). A fatia tratada com o canal Ca2+ agonista Bay-K8644 mostrou uma força de contração aumentada em frequências de estimulação muito baixas (Figura 7C). No entanto, em frequências superiores a 50 BPM, a força de contração parecia ser menor do que durante a condição pré-tratamento. O limiar de estimulação e o período refratário também foram determinados pré e pós-tratamento. No entanto, não foram observadas diferenças e, portanto, os dados não são mostrados.
Figura 1: Visão geral dos materiais necessários e do sistema de cultivo. (A) Uma câmara de cultivo vazia conectada a uma placa de circuito verde. A placa de circuito (1) mede a contração com um sensor e transmite os dados para o controlador. (B) Oito câmaras cheias colocadas na placa principal de balanço. As tampas da placa de Petri (35 mm) são usadas para cobrir as câmaras. (C) As ferramentas (cirúrgicas) necessárias para aparar a amostra miocárdio transmural. São representadas várias pinças, as lâminas necessárias para o vibratome, e um patch de borracha para ajudar no corte. (D) Quatro agulhas de 0,9 mm x 70 mm de 20 G fixadas em posição quadrada (0,9 cm x 0,9 cm) por um bloco sólido de plástico. O uso deste construto evita danos e movimentos da amostra ao aparar e produz um bloco de tecido com as dimensões necessárias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Processamento de duas amostras de LV. (A) Dois blocos de tecido miocárdio (aproximadamente 1 cm x 1 cm x 1 cm) embutidos em agarose de baixo derretimento solidificado em uma placa de Petri de 35 mm. Para fins de demonstração, foi utilizado tecido LV suíno. (B) O bloco de agarose com as amostras incorporadas foi removido da placa de Petri, aparado e colado na plataforma de corte do vibratome. Aqui, o tecido LV suíno foi usado para fins de demonstração. Observe a cor do tecido uniforme e a ausência de tecido fibroso branco, indicado pela seta vermelha. (C) Após o corte, a agarose é cuidadosamente removida, e triângulos plásticos (1) são conectados perpendiculares à direção das fibras do miocárdio. As linhas vermelhas indicam a direção das fibras do miocárdio. (D) Foi preparado tecido LV humano, que mostrou tecido fibroso branco dentro das fatias. Isso não necessariamente reduz a taxa de sucesso do cultivo; no entanto, recomenda-se o uso de fatias que não exibam fibrose. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O software de cultivo. Dependendo do número de canais utilizados (máximo de oito), o registro de contração será visualizado em até três janelas designadas (duas visíveis na figura). Cada câmara de cultivo é exibida como um gráfico de contração. Na janela de configurações, os parâmetros de estimulação podem ser alterados e adaptados à situação experimental desejada. Esta janela também permite iniciar ou parar o protocolo/cronograma de estimulação selecionado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Leia a contração de cinco fatias de miocárdio durante um protocolo típico de estimulação. Em todos os painéis, cada fatia individual é mostrada na mesma cor. (A) A potencialização pós-pausa avalia a primeira contração após uma breve pausa de estimulação de 3, 12, 50 e 120 segundos, respectivamente. (B) Determinação do limiar de estimulação aumentando a corrente de estimulação em passos de 3 mA a cada 10 s de 8 mA para 80 mA. (C) A relação força-freqüência de cada fatia é avaliada por aumentos passo a passo da frequência de estimulação de 12 BPM para 240 BPM. A duração dos períodos de estimulação torna-se menor em frequências mais altas para manter o número de batidas constantes em cada frequência. (D) Para avaliar o período refratário, as fatias são expostas a estímulos prematuros (S2) em intervalos decrescentes ao estímulo anterior (S1). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Análise da força de contração antes e depois do tratamento com o canal Ca2+ tipo L+ que afeta os agentes. Todos os dados (n = 1) foram normalizados para a contratlidade da linha de base (média de cinco batidas separadas antes do tratamento (0)). Os antagonistas do canal Ca2+ nifedipine (125 nM), calciseptina (70,8 nM) e Agonista de canal Ca2+ do canal L-2+ Bay-K8644 (417 nM) foram adicionados à contração de fatias de miocárdio LV humanas. A fatia de controle não recebeu tratamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Potencialização pós-pausa das fatias tratadas e de controle. Foram observadas diferenças na potencialização pós-pausa (linha de base versus pós-tratamento; n = 1). Aqui, a amplitude da primeira contração após uma pausa foi normalizada para a amplitude média de contração antes da respectiva pausa. A linha de base foi definida como 100% e se assemelha à força média de contração dos últimos cinco ciclos antes da primeira pausa começar. O eixo Y exibe a primeira contração normalizada após uma pausa de várias durações. O eixo X mostra a linha de base e os comprimentos de pausa. (A) Controle da fatia sem tratamento. (B) Tratamento calciseptina. (C) Tratamento Bay-K8644. (D) Tratamento de nifedipina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Análise da relação de frequência de força. Os dados de contração (n = 1) foram normalizados à força de contração em 30 BPM dentro do respectivo protocolo (= 100%). (A) A fatia de controle não foi tratada com nenhuma substância; no entanto, todos os outros aspectos do cultivo foram os mesmos das fatias tratadas. (B) Tratamento de calciseptina de uma fatia de miocárdio LV. (C) Tratamento Bay-K8644. (D) Tratamento de nifedipina. Foram omitidos dados sobre a força de contração desta fatia durante as frequências de estimulação acima de 80 BPM, pois a contração não seguia a frequência de estimulação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Composição do tampão de corte utilizado para o transporte e durante o procedimento de corte. Para a preparação da ágarose, a glicose é omitida. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 2: Composição do gel de 4% de agarose. Este gel de agarose de baixo derretimento sem glicose é usado para incorporar as amostras de tecido. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 3: Preparação do meio para cultivo. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela 4: Detalhes do protocolo de estimulação. O protocolo de estimulação consiste em quatro partes, que todas podem ser alteradas para atender às necessidades do projeto. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
No passado, a pesquisa cardiovascular fez grandes avanços no cultivo de cardiomiócitos. No entanto, o cultivo 3D de cardiomiócitos com geometria intacta ainda não está bem estabelecido. Em comparação com os protocolos anteriores aplicados para o cultivo ex vivo do tecido miocárdio, o protocolo que descrevemos aqui se assemelha mais ao ambiente in vivo do tecido. Além disso, a aplicação de pré e pós-carga permite um ambiente mais biomimético. Somos capazes de analisar e entender completamente o registro contínuo dos dados de contração e parâmetros de contração do tecido.
O número de técnicas de cultivo de tecido cardiovascular ex vivo utilizando configurações semelhantes é limitadoem 11,21,22. Uma técnica semelhante para o cultivo de fatias de miocárdio que foi publicada usa uma placa de 6 poços para o cultivo de fatias de miocárdio10. No entanto, uma limitação importante dessa configuração em particular é que as fatias não estão expostas à pré e pós-carga, nem é capaz de produzir uma visão detalhada da contração ao longo do tempo sem a necessidade de manusear o tecido. O método que descrevemos aqui reduz o risco de danos teciduais ou infecção. Além disso, dá uma visão abrangente das possíveis mudanças na força contratual sempre que uma substância de interesse é adicionada ao cultivo. Além da análise da força de contração normal de cada fatia, a configuração atual permite executar regularmente protocolos pré-definidos. Isso permite a coleta de dados de diferentes parâmetros relevantes do tecido cultivado.
Passos críticos dentro do protocolo
Danos teciduais devem ser evitados, e isso já pode ocorrer durante a cirurgia de explant. Se o tecido não for imediatamente transferido para a solução de armazenamento a frio após a excisão, isso pode resultar em amostras de tecido danificadas. O protocolo descrito contém várias etapas que são fundamentais para obter resultados confiáveis e reprodutíveis. O composto de incorporação do tecido agarose deve ser preparado usando o tampão de corte sem glicose, para evitar a possível caramelização da glicose durante o processo de fusão antes do início do protocolo. É importante evitar danos causados pela hipertermia causada pelo uso da ágarose diretamente do banho de água de 80 °C, em vez de incubar a agarose em uma seringa a 37 °C. A temperatura deve ser de 4 °C durante o armazenamento e corte para reduzir o metabolismo e minimizar a isquemia. Além disso, o tecido deve ser manuseado com cuidado, agarrando a agarose em vez do tecido em si, ao movê-lo entre a bandeja de corte e a placa de Petri para anexar os triângulos plásticos. É de extrema importância que esses triângulos estejam ligados na direção adequada em relação à direção das fibras miocáridas. O desalinhamento dos triângulos resultará em danos teciduais.
Em geral, o limiar de estimulação de fatias recém-cortadas é entre 10-20 mA, e a corrente deve ser cuidadosamente aumentada. A superestimulação do tecido por uma corrente muito alta pode levar a danos amostrais irreversíveis também. Uma vez iniciada a estimulação, a agitação tecidual balançando as câmaras de cultivo é necessária, e nunca deve ser interrompida por mais de 5 minutos para garantir a disponibilidade adequada de oxigênio e nutrientes ao tecido.
Solução de problemas e modificações
Hiper contratura
A hiperconstrução da amostra de tecido miocárdio é um dos principais critérios de exclusão do protocolo discutido. Isso pode ocorrer antes e depois da preparação das fatias do miocárdio. Nos casos em que, antes da preparação, o tecido se sentia rígido após a palpação, a hipercontratação era observada em pelo menos 70% das preparações. A hiperconstrução da amostra de tecido também pode ocorrer após a inserção no roqueiro, o que provavelmente depende da qualidade do tecido ou do estado da doença do paciente. A hiperconstrução pode ser vista como um aumento do tom diastólico durante a estimulação do tecido, correspondendo ao encurtamento tônico de cardiomiócitos danificados na isquemia cardíaca. A hiper contratura durante a estimulação pode ser progressiva, pelo qual a contração excede o limite de detecção de 12 mN. No entanto, a hiper contratura também pode reverter espontaneamente dentro de 30-60 min, sugerindo que o tecido pode se recuperar. Para melhorar a recuperação do tecido, as configurações de pré-carga devem ser reajustadas (ou seja, repetir o passo 8.3) após 1h de incubação, bem como nos dias 2, 4 e 6 após a preparação. A hiperconstrução pode estar presente tanto com como sem a contração estimulada das amostras. No entanto, se não for observada contração dentro de 1h, a amostra não deve ser utilizada. Neste caso, o tecido tem hipercontratado a um grau do qual não pode se recuperar ou foi danificado de outra forma. Em geral, o cultivo de fatias de miocárdio humano de acordo com o protocolo apresentado, mostrou ter uma taxa de sucesso de 90%.
Mudanças esperadas da força de contração
Dependendo de uma infinidade de fatores (por exemplo, paciente, preparação, dano tecidual), é possível que as mióslices que apresentaram contração aceitável inicialmente, sofrerão um declínio progressivo nas amplitudes contratuais durante as primeiras 24 horas. Na verdade, esse comportamento pode até ser considerado normal para fatias obtidas de corações desemarmadores humanos. O reajuste da pré-carga das fatias por dia para os 3 dias seguintes foi encontrado para aliviar esse problema e melhorar a contração. Após 24 a 48 h, no entanto, a contração deve começar a aumentar novamente. Note-se que a contração não voltará ao seu nível inicialmente observado nos primeiros dias de cultivo.
Logo após a troca média, quando as amostras são devolvidas à incubadora, a contração normalmente mostra amplitudes marcadamente aumentadas. A abertura e o fechamento da incubadora contribuem para esse aumento, pois faz com que o nível de CO2 caia. Isso aumenta o pH dentro do meio de cultivo tamponado bicarbonato, o que causa uma resposta inotrópica positiva das fatias. Após a troca média, a força contratetil das fatias muitas vezes diminui por várias horas até atingir ou superar seu valor inicial. Para evitar que os protocolos de estimulação sejam afetados pela troca média, os protocolos de estimulação não devem ser executados até pelo menos 1h após a troca média.
Limitações do método
Uma vantagem da técnica atual em comparação com os métodos de cultivo anteriores para tecido miocárdio humano, é a possibilidade de aplicar (e modular) pré-e-afterload ao tecido contraídor. No entanto, é difícil quantificar a carga aplicada em termos de tensão de parede, embora essa carga possa ser estimada a partir da constante da mola e das dimensões da fatia. Supõe-se que há uma relação positiva entre a viabilidade do tecido miocárdio e a amplitude de contração da amostra de tecido. No entanto, atualmente não há nenhum método que permita testes de viabilidade de cada fatia individual antes de montá-la nas câmaras. Uma coloração colorimétrica de MTT pode ser realizada em fatias cortadas que não são utilizadas para cultivo, para determinar a viabilidade das células do miocárdio. Em células viáveis, o NADPH reduzirá o sal MTT amarelo em cristais de formazan roxos. Outra limitação é que, atualmente, os nutrientes no meio de cultivo estão limitados aos ingredientes básicos. Assim, nutrientes e fatores circulantes são diferentes do ambiente in vivo do qual o tecido foi obtido. No entanto, o meio pode ser suplementado ou modificado conforme necessário.
Aplicações potenciais do método
Existem várias aplicações potenciais do método tanto em termos de cardiotoxicidade e testes medicamentosos, quanto na compreensão da fisiopatologia de doenças cardíacas. Primeiro, o sistema utilizado no protocolo discutido pode ser usado para exames de drogas e cardiotoxicidade. Com a ajuda dos protocolos de estimulação programáveis, mudanças fisiológicas podem ser analisadas em resposta à administração de medicamentos. Em relação à interpretação do período refratário, é preciso considerar que se trata de um parâmetro funcional, o que não reflete estritamente o efeito dos medicamentos sobre a duração potencial da ação. Em segundo lugar, as câmaras de cultivo podem ser utilizadas para vários experimentos de co-cultivo de miocárdio em combinação com células imunes. Usando este co-cultivo, os efeitos diretos dos fatores secretos das células imunes na contração do miocárdio podem ser avaliados. Finalmente, as amostras de cardiomiopatia não transplantadas também podem ser cultivadas, embora essas amostras de tecido não transplantado sejam geralmente menores e, portanto, mais difíceis de processar. No entanto, isso pode abrir possibilidades para a identificação de novos alvos terapêuticos e o desenvolvimento de medicamentos direcionados. Também é concebível usar a técnica para caracterização de tecido específico do paciente, aproximando-nos da medicina personalizada. Além disso, o método apresentado pode ser utilizado para tecido miocárdio não humano, exemplos dos quais são suínos e coelhos. Deve-se considerar que a alta frequência cardíaca fisiológica de pequenos mamíferos (camundongo/rato) não pode ser obtida, pois o requisito subsequente de O2 não pode ser satisfeito nas condições de cultivo do miocárdio utilizando a configuração discutida. Assim, um ambiente quase fisiológico é difícil de imitar nesses casos.
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Disclosures
JH, PS, DM e KL não têm nada a revelar. AD e TS são acionistas da InVitroSys GmbH, que fornece o sistema de cultivo Myodish.
Acknowledgments
A pesquisa foi financiada por bolsas DZHK 81Z0600207 (JH, PS e DM) e 81X2600253 (AD e TS).
Os autores gostariam de agradecer Claudia Fahney, Mei-Ping Wu e Matthias Semisch pelo apoio na preparação das configurações, bem como pela manutenção regular do cultivo de tecidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish culture system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
References
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
- Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
- Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).
- Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
- Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).
- Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
- Esfandyari, D. A. -O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
- Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
- Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
- Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
