Summary
نقدم بروتوكولا لزراعة أنسجة عضلة القلب البطينية البشرية خارج الجسم الحي. يسمح بإجراء تحليل مفصل لقوة الانكماش والحركيات ، بالإضافة إلى تطبيق الحمل المسبق واللاحق لمحاكاة البيئة الفسيولوجية في الجسم الحي عن كثب.
Abstract
شهدت زراعة الخلايا العضلية القلبية عددا كبيرا من التطورات ، بدءا من زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) إلى المواد العضوية المشتقة من iPSC. في عام 2019 ، تم عرض طريقة خارج الجسم الحي لزراعة شرائح عضلة القلب التي تم الحصول عليها من عينات القلب البشري ، بينما تقترب في حالة الجسم الحي من تقلص عضلة القلب. تنشأ هذه العينات في الغالب من عمليات زرع القلب أو مواضع أجهزة مساعدة البطين الأيسر. باستخدام اهتزاز ونظام زراعة مطور خصيصا ، يتم وضع شرائح بسماكة 300 ميكرومتر بين سلك ثابت وسلك زنبركي ، مما يسمح بزراعة مستقرة وقابلة للتكرار لعدة أسابيع. أثناء الزراعة ، يتم تحفيز الشرائح باستمرار وفقا للإعدادات الفردية. يمكن عرض الانقباضات وتسجيلها في الوقت الفعلي ، ويمكن تطبيق العوامل الدوائية بسهولة. يمكن جدولة بروتوكولات التحفيز المحددة من قبل المستخدم وتنفيذها لتقييم معلمات الانكماش الحيوية مثل تقوية ما بعد التوقف المؤقت ، وعتبة التحفيز ، وعلاقة تردد القوة ، وفترة الحراريات. علاوة على ذلك ، يتيح النظام إعدادا متغيرا قبل وبعد الحمل لزراعة أكثر فسيولوجية.
هنا ، نقدم دليلا خطوة بخطوة حول كيفية توليد زراعة ناجحة على المدى الطويل لشرائح عضلة القلب البطينية اليسرى البشرية ، باستخدام حل زراعة محاكاة حيوية تجاري.
Introduction
في العقد الماضي ، حققت زراعة خلايا عضلة القلب في المختبر تقدما كبيرا ، بدءا من تقنيات ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد (3D) إلى استخدام المواد العضوية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المتمايزة في الخلايا العضلية القلبية1،2،3. وقد أظهرت زراعة الخلايا خارج الجسم الحي والخلايا الأولية أنها ذات قيمة كبيرة ، خاصة بالنسبة للدراسات الجينية وتطوير الأدوية4،5،6. استخدام الأنسجة البشرية يحسن القيمة الانتقالية للنتائج. زراعة 3D على المدى الطويل من أنسجة عضلة القلب مع الهندسة سليمة، ومع ذلك، ليست راسخة بشكل جيد. الهندسة السليمة هي ميزة رئيسية لمحاكاة في ظروف الجسم الحي ، حيث أن وظيفة القلب المناسبة ، والتواصل بين الخلايا المختلفة ، وكذلك تفاعلات مصفوفة الخلايا هي شروط أساسية. مرت زراعة أنسجة عضلة القلب بمراحل مختلفة من التطور. كان معدل نجاح واستقرار زراعة أنسجة عضلة القلب خارج الجسم الحي منخفضا جدا في البداية ، لكن الأساليب الحديثة أسفرت عن نتائج واعدة7،8،9،10،11.
من بين هؤلاء ، كان فيشر وآخرون أول من أثبت أن الجدوى والأداء الانقباضي لأنسجة عضلة القلب البشرية يمكن الحفاظ عليها في زراعة الخلايا خارج الجسم الحي لعدة أسابيع7. استندت تقنيتهم إلى شرائح الأنسجة الرقيقة المقطوعة من عضلة القلب البشرية المزروعة ، والتي تم تركيبها في غرف زراعة مطورة حديثا توفر ظروفا ميكانيكية حيوية محددة وتحفيزا كهربائيا مستمرا. تشبه طريقة الزراعة هذه إلى حد كبير وظيفة أنسجة عضلة القلب في الجسم الحي ، وقد تم استنساخها من قبل العديد من مجموعات البحث المستقلة2،12،13،14،15. والأهم من ذلك، أن الغرف التي استخدمها فيشر وآخرون مكنت أيضا من التسجيل المستمر للقوى المتقدمة لمدة تصل إلى 4 أشهر، وبالتالي فتحت فرصا غير مسبوقة للبحوث الفسيولوجية والدوائية على عضلة القلب البشرية 7 السليمة.
تم تطوير تقنيات مماثلة بشكل مستقل من قبل مجموعات أخرى وتطبيقها على عضلة القلب البشرية والفئران والخنازير والأرانب7،10،11. طور بيتوليس وآخرون لاحقا طريقة أكثر فسيولوجية ، والتي تعيد إنتاج العلاقة الطبيعية بين القوة والطول خلال دورة الانكماش ، ولكنها أقل ملاءمة للتحليل عالي الإنتاجية16. على هذا النحو ، يمكن اعتبار النهج العام للزراعة المحاكاة الحيوية خطوة أخرى في الحد من التجارب على الحيوانات وصقلها واستبدالها (3R).
ومع ذلك، فإن استغلال هذه الإمكانات يتطلب إجراءات موحدة، وتحليلات عالية المحتوى، ومستوى إنتاجية مرتفعا. نحن نقدم تقنية تجمع بين التقطيع الآلي لعضلة القلب البشرية الحية مع الصيانة في المختبر في نظام زراعة المحاكاة الحيوية الذي أصبح متاحا تجاريا (انظر جدول المواد). مع النهج المقترح ، فإن عدد الشرائح الفردية التي يمكن إنشاؤها من عينة عضلة القلب عبر الجدارية واحد محدود فقط بوقت المعالجة. غالبا ما تنتج عينة ذات حجم وجودة كافيين (3 سم × 3 سم) 20-40 شريحة أنسجة يتم قطعها بسهولة باستخدام اهتزاز آلي. يمكن وضع هذه الشرائح في غرف الزراعة التابعة للنظام. تسمح الغرف بالتحفيز الكهربائي ، الذي يمكن تعديل معلماته (أي مدة النبض ، والقطبية ، والمعدل ، والتيار) ، بالإضافة إلى ضبط الحمل المسبق واللاحق ، باستخدام أسلاك زنبركية داخل الغرف. يتم تسجيل تقلص كل شريحة من حركة مغناطيس صغير متصل بسلك زنبركي ويتم عرضه كرسم بياني قابل للتفسير. يمكن تسجيل البيانات في جميع الأوقات وتحليلها باستخدام البرامج المتاحة مجانا. بصرف النظر عن وتيرة خط الأساس الثابتة ، يمكن تنفيذ البروتوكولات المجدولة لتقييم فترة المقاومة للحرارة وظيفيا ، وعتبة التحفيز ، وتقوية ما بعد التوقف المؤقت ، وعلاقة تردد القوة.
هذه الزراعة المحاكاة الحيوية طويلة الأجل لشرائح عضلة القلب المتعددة من قلب فردي تمهد الطريق للبحوث المستقبلية خارج الجسم الحي في كل من الأنسجة البشرية والحيوانية ، وتسهل فحص الآثار الدوائية العلاجية والسامة للقلب في طب القلب والأوعية الدموية. وقد تم تطبيقه بالفعل على مختلف الأساليب التجريبية2،12،13،15. هنا ، نقدم وصفا مفصلا خطوة بخطوة لإعداد الأنسجة البشرية ونقدم حلولا لمشاكل الزراعة التي تواجهها بشكل متكرر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جمع الأنسجة للتجارب الموصوفة هنا من قبل مجالس المراجعة المؤسسية بجامعة ميونيخ وجامعة الرور بوخوم. أجريت الدراسات وفقا لإعلان هلسنكي التوجيهي. أعطى المرضى موافقتهم الخطية المستنيرة قبل جمع الأنسجة.
1. اكتساب الأنسجة
- الحصول على الأنسجة البشرية من المرضى الذين يخضعون لزراعة القلب أو جراحة القلب.
- قبل شراء الأنسجة ، قم بإعداد 2 لتر من محلول الشلل القلبي (يشار إليه أيضا باسم المخزن المؤقت للتقطيع (الجدول 1)).
- بعد الحصول على خزعة البطين الأيسر (LV) بحجم 4 سم × 4 سم ، ضع الأنسجة على الفور (في غضون 5 دقائق بعد الاستئصال) في كوب بلاستيكي معقم للاستخدام مرة واحدة قابل للإغلاق يحتوي على حوالي 70 مل من المخزن المؤقت للتقطيع البارد (4 درجات مئوية). يحفظ عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يسمح مخزن التقطيع العازل المستخدم في هذا البروتوكول بالتخزين البارد (4 درجات مئوية) للأنسجة لمدة تصل إلى 36 ساعة. وهذا يسمح بالنقل البارد للأنسجة من العيادات غير القريبة من المختبر. ومع ذلك ، أثبتت أوقات النقل ≤ 24 ساعة أنها مثالية.
2. تحضير الأغاروز والاهتزاز
- تأكد من إعداد غرف زراعة كافية وتعقيمها (الشكل 1A).
- اغمر الغرف وأقطاب الجرافيت في 1 لتر من محلول الأيزوبروبانول بنسبة 10٪ وحرك بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، انقل الغرف إلى محلول إيزوبروبانول 100٪ لمدة 3 دقائق وأوتوكلاف أقطاب الجرافيت عند 120 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- دع الغرف وأقطاب الجرافيت تجف في الهواء تحت غطاء التدفق الرقائقي.
- قم بإرفاق لوحة دوائر كهربائية بكل غرفة من الغرف وفقا للمواضع المتاحة على الروك . ضع قطبين كهربائيين من الجرافيت على لوحة الدوائر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- ضع غطاء طبق بتري 35 مم أعلى الغرفة لمنع التلوث.
- قم بإعداد نظام زراعة Myodish (انظر جدول المواد) في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 عن طريق توصيل النظام بجهاز كمبيوتر (الشكل 1B).
- تحضير الأغاروز منخفض الذوبان بنسبة 4٪ في مخزن التقطيع المؤقت (بدون الجلوكوز ؛ الجدول 2). يمكن تخزين الأغاروز في 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر.
- في يوم التجربة ، قم بإذابة حجم مخزون من محلول الأغاروز باستخدام حمام مائي محدد عند 80 درجة مئوية. اعتمادا على الكمية ، يستغرق الذوبان حوالي 30 دقيقة.
- عندما يكون الأغاروز سائلا ، اسحب 8 مل من الأغاروز السائل في حقنة 10 مل ، مع 2 مل إضافية من الهواء. أغلق المحقنة بغطاء معقم وضعها رأسا على عقب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، لمنع الأغاروز من التصلب ، ولموازنة درجة حرارته لمنع تلف ارتفاع الحرارة للعينة.
- إذا كان موجودا، فقم بتشغيل جهاز تبريد المياه الخاص بالاهتزاز قبل 30 دقيقة على الأقل من تقطيع الأنسجة للسماح بسعة تبريد كافية. اضبط درجة حرارة دوران الماء على 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يحتوي كل من درج القطع ولوحة التبريد المستخدمة هنا على دوران مياه مدمج. يوصى بشدة بهذا للتبريد وتقليل مخاطر التلوث. ومع ذلك ، من الممكن أيضا استخدام الثلج كتقنية تبريد. أيضا ، لا يحتاج جهاز تبريد المياه إلى توصيله بصينية القطع و / أو لوحة التبريد الخاصة بالاهتزاز في هذه المرحلة من البروتوكول. - نظف صينية التقطيع الاهتزازية ولوحة العينات عن طريق تنظيف جميع الأسطح باستخدام الأيزوبروبانول بنسبة 100٪ لمدة 3 دقائق على الأقل.
ملاحظة: اعتمادا على نظام الاهتزاز المستخدم، قد يختلف إعداد الاهتزاز. ارجع إلى دليل الاهتزاز الموجود في المختبر للحصول على معلومات حول طرق الإعداد ومعايرة الشفرات. - املأ درج القطع بنسبة تصل إلى 90٪ -95٪ باستخدام مخزن التقطيع المؤقت. في الإعداد المستخدم حاليا ، يتوافق هذا مع حوالي 400 مل. قم بتوصيل أنابيب جهاز تبريد المياه بالصمامات الموجودة على صينية القطع ولوحة التبريد في الاهتزاز.
- قم بتطهير جميع الأدوات اللازمة للتحضير عن طريق غمرها في محلول أيزوبروبانول 100٪ لمدة 5 ثوان. قم بإزالة الأدوات من محلول الأيزوبروبانول وجففها في الهواء تحت غطاء التدفق الرقائقي.
3. تقليم وتضمين العينات
- انقل عينة الأنسجة إلى طبق بتري 100 مم مملوء بمخزن مؤقت للتقطيع البارد. احتفظ بالطبق على طبق تبريد عند 4 درجات مئوية (متصل بالمبرد أو يوضع على الجليد).
- إزالة ترابيكول الشغاف عن طريق عقد الشغاف مع ملاقط واستخدام مقص لقطع ما يقرب من 3 ملم من أنسجة الشغاف. بنفس الطريقة ، قم بإزالة الأنسجة الدهنية الزائدة تحت epicardium إذا كانت موجودة.
- ثبت عينة الأنسجة المقطوعة ، جانب الشغاف لأعلى ، على رقعة مطاطية 2 سم × 2 سم باستخدام أربع إبر 0.9 مم × 70 مم 20 جم مثبتة في وضع مربع (0.9 سم × 0.9 سم ؛ الشكل 1 جيم، د). تأكد من أن الحافة القطرية لكل طرف إبرة تشير إلى الداخل. هذا يعزز التثبيت ويمنع تلف عضلة القلب.
تنبيه: يجب أن يكون اتجاه المربع المذكور أعلاه متعامدا مع اتجاه الألياف العضلية السائد المتوقع. - قطع جميع الأنسجة الزائدة خارج مربع الإبرة الأربعة باستخدام مشرط. إذا سمح حجم العينة الأصلية ، استخدم عينتين من أنسجة عضلة القلب أثناء هذا التحضير من نفس العينة الخام.
- باستخدام الملقط، ضع العينة المشذبة على قطعة معقمة من الأنسجة لإزالة أي مخزن مؤقت للتقطيع الزائد المتبقي على العينة. لمنع جفاف العينة، لا تحتفظ بالعينة على الأنسجة لمدة تزيد عن 10 ثوان.
- ضع العينة (العينات) في طبق بتري 35 مم ، بحيث تقطع الشفرة عموديا على محاذاة الخلايا العضلية القلبية ويتجه العضلة إلى الأسفل. إذا كان المستحضر يتضمن عينتين، فتأكد من توسيط العينات وعدم لمس بعضها البعض.
- خذ حقنة الأغاروز من الحمام المائي واغمر العينة (العينات) في الأغاروز. (الشكل 2 ألف). اترك الأغاروز يتصلب لمدة 5 دقائق على طبق تبريد. يجب أن تبقى العينة (العينات) على اتصال مع طبق بتري ، مما يضمن أن تكون طائرة القطع موازية لاتجاه ألياف عضلة القلب السائد.
تنبيه: لا تفرغ المحقنة بالكامل، لمنع فقاعات الهواء. انتبه إلى كمية الأغاروز التي تترك في المحقنة أثناء غمر العينات. في حالة وجود فقاعات هواء في الطبق مع العينات ، اسحب فقاعات الهواء بعناية إلى المحقنة.
4. وضع العينات على صينية القطع
- قم بإزالة الأغاروز الصلب الذي يحتوي على العينة (العينات) من طبق بتري 35 مم باستخدام ملعقة أو أداة مماثلة ، عن طريق ربطه بين العينة وجانب طبق بتري. قطع بعض الأغاروز باستخدام مشرط مع الحفاظ على العينات مغطاة.
تنبيه: لا تقم بإزالة الكثير من الأغارو. يجب أن يكون هناك ما لا يقل عن 5 مم من الأغاروز على الجانبين الطويل والقصير في طائرة X / Z.
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات 4.2-4.4 في تتابع سريع (أي بحد أقصى 5 ثوان). احصل على جميع الأدوات المطلوبة في متناول اليد قبل البدء. لا يمكن تغيير موضع العينة بعد وضعها. حاول الحد من تعرض الغراء للهواء والرطوبة. سيؤدي التلامس مع الهواء أو السوائل إلى تصلب الغراء ، مما يجعله غير قابل للاستخدام. - باستخدام ماصة ، ضع ووزع 60 ميكرولتر من الغراء داخل وحول وسط منصة القطع.
- ضع الجانب الفوقي من العينة الموجودة في الأغاروز فوق المنطقة الملصقة باستخدام ملاقط. لا تقم بتغيير الموضع. يجب أن يكون الجانب الشغافي من العينة مرئيا في الأغارو. دع الغراء يتصلب لمدة 1 دقيقة. اضغط برفق على الأغاروز الذي يحتوي على العينة من الأعلى باستخدام أداة حادة (على سبيل المثال، ملاقط) مع منع قطع الأغاروز أو إتلافه.
- ضع منصة العينة في موضعها المحدد في درج القطع الخاص بالاهتزاز ، المليء بمخزن مؤقت للتقطيع.
5. بدء الاهتزاز
- اضبط سعة الاهتزاز على 1 مم وسرعة القطع الأولية على 0.07 مم/ثانية. اضبط سمك الشريحة على 300 ميكرومتر لقطع الشرائح.
- طالما أن الشفرة تقطع الأغاروز فقط ، فقم بزيادة سرعة القطع إلى أقصى حد لها ، والتي تبلغ في هذه الحالة 1.50 مم / ثانية. بمجرد أن يبدأ الاهتزاز في قطع الأنسجة ، قلل السرعة إلى 0.07 مم / ثانية على الفور.
ملاحظة: إذا لم يتم تقطيع الأنسجة بسلاسة، على سبيل المثال إذا كانت هناك مناطق ليفية كبيرة في العينة، فقد يساعد ذلك على زيادة سعة القطع حتى 1.5 مم وتقليل سرعة القطع إلى 0.04 مم/ثانية.
6. إعداد المتوسطة والحاضنة أثناء إجراء التقطيع
- املأ كل غرفة زراعة ب 2.4 مل من وسط الزراعة الكامل (الجدول 3).
- ضع غرف الزراعة المملوءة بالوسط على نظام الزراعة في الحاضنة المحددة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ CO 2 ، و 21٪ O2 ، ورطوبة 80٪. قم بموازنة الوسط لمدة 20 دقيقة على الأقل.
- قم بتوصيل نظام الزراعة بجهاز كمبيوتر وابدأ تشغيل البرنامج المقابل.
- اضبط سرعة الروك على 60 دورة في الدقيقة واضبط مسبقا معلمات التحفيز (نبضات التحفيز والتردد). بالنسبة لشرائح القلب البشرية ، اضبط التحفيز القياسي على نبضات ثنائية الطور مع تيار 50 مللي أمبير ، يتكون كل منها من تيار موجب 3 مللي ثانية ، وتوقف مؤقت 1 مللي ثانية ونبضة 3 مللي ثانية من التيار المقلوب ، بمعدل سرعة 30 نبضة في الدقيقة (BPM).
ملاحظة: في الأنسجة المحفوظة جيدا ، تبلغ عتبة التحفيز النموذجية حوالي 15 مللي أمبير. لضمان التحفيز الموثوق به ولحساب أي زيادة محتملة في عتبة التحفيز ، يوصى بتعيين التيار إلى قيمة تتجاوز عتبة التحفيز بمقدار ضعفين إلى ثلاثة أضعاف. - تحقق من مؤشرات القطب الكهربائي للبرنامج للتحقق من أن أقطاب غرف الزراعة تعمل بشكل صحيح.
ملاحظة: يلزم اتخاذ إجراء كلما تحول مؤشر القناة في برنامج الزراعة إلى اللون الأحمر. في هذه الحالة ، لا تكون شحنات النبض ثنائي القطب متوازنة.
7. تحضير الشرائح
ملاحظة: عادة ما تكون شرائح الشغاف الأولية غير مناسبة لزراعة الأنسجة ويجب التخلص منها بسبب التشكل غير المتساوي. بعد أول خمس إلى 10 شرائح ، يتحسن نسيج الشريحة ومورفولوجيا. الشريحة المثالية هي 1 سم × 1 سم على الأقل ، ولا تحتوي على بقع ليفية أو محدودة فقط ، وليست مجزأة ، ولها محاذاة ألياف متجانسة (الشكل 2B ، D). غالبا ما يكون التليف الخلالي ، الموجود بين ألياف الخلايا العضلية ، موجودا في فشل عضلة القلب البشرية. والمثير للدهشة أن هذا ليس مؤشرا سلبيا على نجاح الزراعة.
- صب كمية كافية من عازل التقطيع البارد في غطاء طبق بتري بطول 5 سم لضمان عدم جفاف الشرائح. ضع الشرائح في غطاء طبق بتري الذي يحتوي على مخزن التقطيع البارد.
- افصل الأغاروز عن الأنسجة باستخدام ملاقط. منع لمس الأنسجة. تعامل مع الأنسجة بعناية لأن أي ضرر يلحق بالأنسجة سيقلل من معدل نجاح الزراعة.
- تحديد اتجاه ألياف عضلة القلب عن طريق الفحص الدقيق ضد مصدر الضوء. هذا أمر مهم عند ربط المثلثات البلاستيكية بالأنسجة في الخطوة 7.6.
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوتين 7.4 و7.5 في تتابع سريع، في غضون 5 ثوان. - قم بإرفاق مثلثين بلاستيكيين بعينة باستخدام الغراء من أجل تثبيت الأنسجة داخل غرف الزراعة.
- ضع 1 ميكرولتر من الغراء على غطاء طبق بتري معقم. استخدم ملاقط مدمن مخدرات لالتقاط أحد المثلثات البلاستيكية المعقمة. اغمس الحافة الأمامية للمثلث بسرعة في الغراء والصق المثلث على العينة ، عموديا على محاذاة الخلايا العضلية القلبية. كرر ذلك للمثلث الآخر.
- قم بقص الأنسجة التي تتجاوز عرض المثلث باستخدام مشرط (الشكل 2C). ضع الشريحة مع المثلثين المثبتين مرة أخرى في مخزن التقطيع المؤقت الخاص بدرج القطع.
ملاحظة: كرر الخطوات من 7.2 إلى 7.5 حتى يتم إعداد شرائح كافية لملء غرف الزراعة. نوصي بإعداد بعض الشرائح الإضافية للسماح باستبدال الشرائح بتقلص ضعيف.
8. تركيب الشرائح
ملاحظة: يتم تحديد الحمل اللاحق من خلال صلابة سلك الزنبرك في غرف الزراعة. تتوفر ثلاثة أنواع مختلفة ، بناء على سمك سلك الزنبرك.
- خذ غرفة زراعة متوسطة الملء من الحاضنة. حدد إحدى الشرائح المعدة وأدخلها في الحجرة عن طريق توصيل مثلث واحد بكل دبوس.
- اضبط المسافة بين دبابيس التركيب وفقا لحجم العينة. تأكد من غمر العينة في الوسط. ضع الغرفة مرة أخرى في المقبس المخصص لها لنظام الزراعة في الحاضنة.
تحذير: لا تفرط في تمدد الأنسجة ولا تفرط في ثني سلك النوابض! - اضبط توتر التحميل المسبق بعد وضع الطبق على الهزاز.
- قلل الحمل المسبق عن طريق تدوير برغي الضبط عكس اتجاه عقارب الساعة. قم بذلك حتى لا يتغير الخط الأساسي للرسم البياني المقابل على شاشة الكمبيوتر بعد الآن.
- قم بزيادة التحميل المسبق بعناية (أي زيادة التوتر) عن طريق تدوير برغي الضبط في اتجاه عقارب الساعة. بالنسبة للغرف ذات الصلابة الأعلى ، استمر حتى زاد خط الأساس المقابل في الرسم البياني بمقدار 1000-1200 وحدة ، وهو ما يتوافق مع 1 mN من التحميل المسبق.
ملاحظة: يعتمد التعديل الدقيق على ثابت الزنبرك الفردي لغرفة الزراعة، والذي يمكن تحديده عن طريق المعايرة قبل التجربة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يسمح برنامج التسجيل بالنظر في معايرة الغرفة الفردية بحيث يتم عرض القوى بشكل موحد في μN. يوصى بتطبيق التحفيز الكهربائي من بداية الزراعة. على هذا النحو ، من الممكن أن تبدأ الشريحة في التعاقد أثناء ضبط التحميل المسبق. في هذه الحالة ، ركز على خط الأساس الانبساطي لتقييم الحمل المسبق.
9. تغيير الوسط
- تحضير وسط الزراعة وفقا للوصفة في الجدول 3. قبل وقت قصير من استخدام الوسط ، أضف 50 ميكرولتر من β-mercaptoethanol (50 mM) إلى أنبوب 50 mL. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- مرة واحدة كل 2 أيام ، تبادل جزئيا وسط الزراعة. تحديث الوسط كل 2 أيام ، إذا كان من المرغوب فيه زراعة شرائح عضلة القلب على المدى الطويل.
- قم بتسخين الوسط الطازج مسبقا في حمام مائي أو حاضنة الهواء الساخن على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة. قم بإزالة غرفة زراعة من الحاضنة وضعها تحت غطاء تدفق صفائحي.
تحذير: من الضروري الحفاظ على الغرفة ، وكذلك الوسط ، دافئا عند 37 درجة مئوية (> 35 درجة مئوية) لمنع التقلصات المفرطة بسبب انخفاض درجة الحرارة. قد يكون الضرر الأقل وضوحا موجودا كزيادة في التوتر الانبساطي في غضون ساعات قليلة بعد التبادل المتوسط. قد يبدو أن هذا يتعافى ، لكن الإجهاد المتكرر قد يؤدي إلى تراكم التدهور. - قم بإزالة الوسط من غرفة الزراعة ، مع ترك حوالي 0.8 مل في الغرفة. أضف 1.6 مل من الوسط الطازج إلى نفس الغرفة. يجب أن يكون الحجم الإجمالي للوسط حوالي 2.4 مل لكل غرفة.
- ضع غطاء الغرفة مرة أخرى وضع غرفة الزراعة مرة أخرى في موضعها الخاص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم عرض تقلص شرائح عضلة القلب على شاشة الكمبيوتر بعد إدخال غرفة الزراعة في الموصل المقابل لها (الشكل 3). بدأ تقلص شرائح عضلة القلب البشرية فور التحفيز. تقلصت الشرائح لمدة 5-10 دقائق. كان هذا مرئيا كزيادة في القوى الانبساطية ، الناجمة عن تقلص منشط لكسور الأنسجة التالفة. تم إرجاع هذه العملية بدرجات متفاوتة في غضون 1-1.5 ساعة. بعد الاستقرار ، أظهرت شرائح أنسجة LV البشرية قوى ارتعاش تتراوح بين 1 mN و 3 mN عند التحفيز. يظهر الانقباض على أنه زيادة قوية في قوة الانقباض ، يليه الانبساط مع انخفاض حاد بنفس القدر في قوة الانكماش.
تم تسجيل تقلص شرائح عضلة القلب بواسطة برنامج الزراعة وحفظه في ملف معين. تم تحويل كل ملف من ملفات البيانات الخام التي تم إنشاؤها إلى تنسيق ملف ثنائي Axon قابل للقراءة (.abf) لسهولة تحليل البيانات وتحديدها كميا. للتحليل الأولي، تم فتح ملف .abf في برنامج مناسب. تم اختيار حوالي 5 دقائق من بيانات الانكماش لتحديد متوسط سعة الانكماش خلال هذه الفترة. تم ذلك لعدة نقاط زمنية في ملف البيانات المسجل. أسفر رسم قيم الانكماش هذه بمرور الوقت عن رسم بياني مفيد لمقارنة تطور الانكماش في بيئة تحكم وتجريبية. للحصول على نظرة أكثر تقدما حول أداء الشرائح التي تم إنشاؤها ، تم تشغيل بروتوكولات التحفيز. خلال هذه البروتوكولات ، التي تستغرق حوالي 45 دقيقة ، تم تغيير معلمات التحفيز لتقييم معلمات اقتران الانكماش.
ويتألف بروتوكول التحفيز الحالي من أربعة أقسام متميزة: تقوية ما بعد التوقف، وعتبة التحفيز، وعلاقة القوة بالتردد، وفترة المقاومة للحرارة (الشكل 4، الجدول 4). أثناء تقوية ما بعد التوقف المؤقت ، يتم استئناف التحفيز بعد توقف قصير إما 3 أو 12 أو 50 أو 120 ثانية. لتحديد عتبة التحفيز ، يتم زيادة تيار التحفيز في خطوات من 3 مللي أمبير كل 10 ثوان ، بدءا من 8 مللي أمبير ويزيد إلى 90 مللي أمبير. مع هذا الاختبار ، يمكن تحديد الحد الأدنى من تيار التحفيز لكل شريحة. هذا لا يغير إعدادات التحفيز العامة خارج بروتوكول التحفيز. يتم تقييم العلاقة بين القوة والتردد من خلال زيادة تدريجية في تردد التحفيز (20 و 30 و 45 و 60 و 80 و 100 و 120 و 150 و 180 و 210 و 240 نبضة في الدقيقة) ، في حين يتم تقصير المدة الخاصة بكل خطوة بالتوازي. باستثناء أول إعدادين للتردد ، ينتج عن هذا النظام ما بين 20-40 تقلصا خلال كل خطوة. يتم تقييم الفترة الحرارية لكل شريحة عن طريق إرسال حافز سابق لأوانه (S2) بعد التحفيز الطبيعي (S1 ؛ 30 BPM). يتم تقصير الفاصل الزمني S1-S2 كل 10 ثوان.
لإثبات إمكانات نظام الزراعة المقدم كأداة لاختبار التدخلات الدوائية ، تم إعداد شرائح أنسجة LV البشرية خارج الجسم الحي من نفس المريض وتعرضت لعوامل دوائية تؤثر على مستويات أيون الكالسيوم داخل الخلايا (Ca2 +) (n = 1) بعد أسبوعين من الزراعة. يمنع مضاد Ca 2+-channel nifedipine من النوع L تدفق Ca 2+ إلى خلايا عضلة القلب وبالتالي يقلل من توافر Ca2+ داخل الخلايا ويقلل من الانقباض17. بسبب عمل موسع الأوعية الدموية ، يستخدم نيفيديبين كدواء مضاد لارتفاع ضغط الدم. لإثبات الاختلافات الدوائية لمضادات Ca2 + - channel ، تم التحقيق في الكالسيسيبتين للمقارنة. Calciseptine هو أيضا مضاد Ca2 + قناة من النوع L ، مستخرج من Dendroaspis p. polylepis venom18. لذلك ، فإنه يشترك في العمل السلبي للتقلص العضلي للنيفيديبين. ومع ذلك ، فإن الكالسيسيبتين له خصائص ربط مختلفة وهو أكثر قوة مقارنة ب nifedipine19. من أجل دراسة التعديلات الإيجابية والسلبية لتوافر Ca 2+ ، اختبرنا أيضا ناهض قناة الكالسيوم Bay-K8644 (1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-5-nitro-4-(2-[trifluoromethyl]phenyl)pyridine-3-carboxylic acid methyl ester)20.
عولجت ثلاث شرائح بالنيفيديبين (125 نانومتر) ، وكالسيسيبتين (70.8 نانومتر) ، و Bay-K8644 (417 نانومتر) على التوالي ، في حين لم تتلق الشريحة الرابعة أي دواء (مراقبة). تمت مقارنة قوى الانكماش تحت معلمات التحفيز العامة (تيار 50 مللي أمبير ، نبضات ثنائية الطور 3 مللي ثانية ، فاصل زمني 1 مللي ثانية ، ومعدل سرعة 30 نبضة بدقيقة) قبل العلاج وبعده. علاوة على ذلك ، قبل العلاج ، تم تشغيل بروتوكول تحفيز لتقييم قيم خط الأساس لتقوية ما بعد التوقف المؤقت ، وعتبة التحفيز ، وعلاقة تردد القوة ، وفترة الحرارية. بعد 30 دقيقة من العلاج ، تم تشغيل بروتوكول تحفيز ثان. وللقضاء على الفروق بين الأفراد، تم تطبيع سعة الانكماش لكل شريحة إلى مستوى خط الأساس قبل المعالجة. تم تحديد خط الأساس (أي 100٪) من خلال تحليل دورات الانكماش الخمس الأخيرة قبل بدء بروتوكول التحفيز قبل المعالجة.
عند تحليل تقلص الشرائح عند التحفيز العام ، لوحظ أن قوة انكماش الشرائح المعالجة بمضادات Ca2 + (nifedipine و calciseptine) انخفضت في غضون 10 دقائق بعد المعالجة (الشكل 5) وكان التأثير موجودا حتى 20 دقيقة بعد العلاج. في المقابل ، زاد ناهض قناة Ca2+ ذو بوابات الجهد Bay-K8644 من قوة انكماش الشريحة المعالجة. لم تظهر شريحة التحكم تغييرا جديرا بالملاحظة. تم تحليل بيانات الانكماش التي تم إنشاؤها خلال بروتوكولات التحفيز بطريقة مماثلة. هنا ، تمت مقارنة البيانات الناتجة عن بروتوكول التحفيز الذي تم إجراؤه قبل العلاج (ما قبل العلاج) ببيانات ما بعد العلاج لنفس بروتوكول التحفيز.
كما نوقش من قبل ، بدأ بروتوكول التحفيز بتقييم تقوية ما بعد التوقف. أثناء التوقف المؤقت ، يتم تناول Ca2 + إضافي بواسطة الشبكة الساركوبلازمية (SR) ، والتي يتم إطلاقها عند التحفيز الأول بعد التوقف. وبالتالي ، فإن تقوية ما بعد التوقف المؤقت تعكس إطلاق Ca2+ داخل الخلايا من SR. على هذا النحو ، يمكن استخدام هذه المعلمة لتقييم المساهمة النسبية ل Ca2 + الصادرة من SR بواسطة مستقبلات الريانودين. لتقييم تقوية الشرائح بعد توقف التحفيز ، تم تقسيم قوة الانقباض الأول بعد التوقف المؤقت على متوسط الانقباض قبل التوقف المعني. لم تظهر شريحة التحكم أي تغيير جدير بالملاحظة (الشكل 6A). ولوحظ أن تثبيط قنوات Ca 2+ من النوع L أدى إلى تقوية الانقباض الأول بعد توقف مؤقت لا يقل عن 50 ثانية (الشكل 6B,D)، مما يعكس مساهمة نسبية أعلى لإطلاق Ca 2+ داخل الخلايا في الانقباض الكلي. شوهد التأثير المعاكس في الشريحة المعالجة باستخدام Bay-K8644 ، والتي تحفز دخول Ca2 + خارج الخلية عبر قنوات Ca2+ من النوع L (الشكل 6C).
تم تقييم العلاقة بين القوة والتردد عن طريق زيادة معدل السرعة على التوالي حتى 180 نبضة في الدقيقة. للحصول على تصور أفضل ، تم تطبيع قوة الانكماش عند ترددات التحفيز المختلفة إلى انكماش خط الأساس عند 30 نبضة في الدقيقة ضمن نفس البروتوكول (= 100٪). أظهر تحليل البيانات أن العلاج بالكالسيزيبتين لم يغير من قدرة الشريحة على اتباع المحفزات عند زيادة وتيرة التحفيز عند مقارنة بيانات ما قبل المعالجة وبعدها (الشكل 7B). ولم يلاحظ أي تغيير في شريحة التحكم (الشكل 7 ألف). وخلافا للكالسيسيبتين، منع النيفيديبين زيادة الانقباض بمعدلات أعلى وخفض الحد الأقصى لمعدل الالتقاط إلى 80 نبضة في الدقيقة (الشكل 7D). أظهرت الشريحة المعالجة بناهض قناة Ca2+ Bay-K8644 زيادة في قوة الانكماش عند ترددات تحفيز منخفضة جدا (الشكل 7C). ومع ذلك ، عند الترددات الأعلى من 50 BPM ، يبدو أن قوة الانكماش أقل مما كانت عليه أثناء حالة ما قبل المعالجة. كما تم تحديد عتبة التحفيز وفترة المقاومة للحرارة قبل وبعد العلاج. ومع ذلك ، لم يلاحظ أي اختلافات ، وبالتالي لا يتم عرض البيانات.
الشكل 1: نظرة عامة على المواد المطلوبة ونظام الزراعة . (أ) غرفة زراعة فارغة متصلة بلوحة دوائر خضراء. تقيس لوحة الدوائر (1) الانكماش باستخدام مستشعر وتنقل البيانات إلى وحدة التحكم. (ب) ثماني غرف مملوءة موضوعة على الصفيحة الرئيسية الهزازة. تستخدم أغطية الأطباق البتري (35 مم) لتغطية الغرف. (ج) الأدوات (الجراحية) اللازمة لتقليم عينة عضلة القلب عبر الجدارية. يصور العديد من الملقط ، والشفرات اللازمة للاهتزاز ، ورقعة مطاطية للمساعدة في التشذيب. (D) أربع إبر 0.9 مم × 70 مم 20 جم مثبتة في وضع مربع (0.9 سم × 0.9 سم) بواسطة كتلة صلبة من البلاستيك. استخدام هذا البناء يمنع تلف وحركة العينة عند التشذيب وينتج عنه كتلة نسيج بالأبعاد المطلوبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: معالجة عينتين من الجهد المنخفض (أ) كتلتان من أنسجة عضلة القلب (حوالي 1 سم × 1 سم × 1 سم) مدمجة في الأغاروز الصلب منخفض الذوبان في طبق بتري 35 مم. لأغراض العرض التوضيحي ، تم استخدام أنسجة LV الخنازير. (ب) تمت إزالة كتلة الأغاروز مع العينات المضمنة من طبق بتري ، وتقليمها ، ولصقها على منصة القطع في الاهتزاز. هنا ، تم استخدام أنسجة LV الخنازير لأغراض العرض التوضيحي. لاحظ لون الأنسجة الموحد وغياب الأنسجة الليفية البيضاء ، المشار إليها بالسهم الأحمر. (ج) بعد التقطيع ، تتم إزالة الأغاروز بعناية ، ويتم توصيل المثلثات البلاستيكية (1) عموديا على اتجاه ألياف عضلة القلب. تشير الخطوط الحمراء إلى اتجاه ألياف عضلة القلب. (د) تم إعداد أنسجة LV البشرية ، والتي أظهرت الأنسجة الليفية البيضاء داخل الشرائح. هذا لا يقلل بالضرورة من معدل نجاح الزراعة. ومع ذلك فمن المستحسن استخدام شرائح التي لا تظهر التليف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: برنامج الزراعة. اعتمادا على عدد القنوات المستخدمة (بحد أقصى ثمانية) ، سيتم تصور تسجيل الانكماش في ما يصل إلى ثلاث نوافذ معينة (اثنتان مرئيتان في الشكل). يتم عرض كل غرفة زراعة كرسم بياني واحد للانكماش. في نافذة الإعدادات ، يمكن تغيير معلمات التحفيز وتخصيصها وفقا للوضع التجريبي المطلوب. تسمح هذه النافذة أيضا بتشغيل أو إيقاف بروتوكول / جدول التحفيز المحدد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: قراءة تقلص خمس شرائح عضلة القلب خلال بروتوكول تحفيز نموذجي. في جميع اللوحات، تظهر كل شريحة فردية بنفس اللون. (أ) يقيم التقوية بعد التوقف المؤقت الانقباض الأول بعد توقف تحفيزي قصير لمدة 3 و 12 و 50 و 120 ثانية على التوالي. (ب) تحديد عتبة التحفيز عن طريق زيادة تيار التحفيز بخطوات 3 مللي أمبير كل 10 ثوان من 8 مللي أمبير إلى 80 مللي أمبير. (ج) يتم تقييم العلاقة بين القوة والتردد لكل شريحة عن طريق الزيادات التدريجية في تردد التحفيز من 12 نبضة في الدقيقة إلى 240 نبضة في الدقيقة. تصبح مدة فترات التحفيز أقصر عند الترددات الأعلى للحفاظ على عدد النبضات ثابتا عند كل تردد. (د) لتقييم الفترة الحرارية ، تتعرض الشرائح للتحفيز السابق لأوانه (S2) على فترات متناقصة للحافز السابق (S1). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل قوة الانكماش قبل وبعد العلاج باستخدام العوامل المؤثرة على قناة Ca2+ من النوع L. تم تطبيع جميع البيانات (n = 1) إلى انقباض خط الأساس (متوسط خمس ضربات منفصلة قبل العلاج (0)). تمت إضافة مضادات قناة Ca2+ من النوع L nifedipine (125 nM) ، و calciseptine (70.8 nM) ، وناهض قناة Ca2 + من النوع L Bay-K8644 (417 nM) إلى تقلص شرائح عضلة القلب LV البشرية. لم تتلق شريحة التحكم أي علاج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تقوية ما بعد التوقف المؤقت للشرائح المعالجة والتحكم. لوحظت اختلافات في تقوية ما بعد التوقف المؤقت (خط الأساس مقابل ما بعد العلاج ؛ n = 1). هنا ، تم تطبيع سعة الانقباض الأول بعد التوقف المؤقت إلى متوسط سعة الانكماش قبل التوقف المعني. تم تعيين خط الأساس على أنه 100٪ ويشبه متوسط قوة الانكماش للدورات الخمس الأخيرة قبل بدء التوقف الأول. يعرض المحور Y الانقباض الأول الطبيعي بعد توقف مؤقت لفترات مختلفة. يعرض المحور X أطوال خط الأساس والإيقاف المؤقت. (أ) التحكم في الشريحة دون علاج. (ب) علاج الكالسيسيبتين. (ج) علاج Bay-K8644. (د) علاج النيفيديبين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تحليل علاقة تردد القوة. تم تطبيع بيانات الانكماش (n = 1) إلى قوة الانكماش عند 30 نبضة في الدقيقة ضمن البروتوكول المعني (= 100٪). (أ) لم تعالج شريحة المراقبة بأي مادة؛ ومع ذلك ، كانت جميع الجوانب الأخرى للزراعة هي نفسها تلك الموجودة في الشرائح المعالجة. (ب) علاج الكالسيسيبتين لشريحة عضلة القلب LV واحدة. (ج) علاج Bay-K8644. (د) علاج النيفيديبين. تم حذف البيانات المتعلقة بقوة انكماش هذه الشريحة أثناء ترددات التحفيز التي تزيد عن 80 نبضة في الدقيقة ، لأن الانكماش لم يكن يتبع تردد التحفيز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: تكوين مخزن التقطيع العازل المستخدم في النقل وأثناء إجراء التقطيع. لإعداد agarose ، يتم حذف الجلوكوز. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 2: تكوين هلام الأغاروز 4٪. يستخدم جل الأغاروز منخفض الذوبان الخالي من الجلوكوز لتضمين عينات الأنسجة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 3: إعداد الوسط للزراعة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول 4: تفاصيل بروتوكول التحفيز. يتكون بروتوكول التحفيز من أربعة أجزاء ، والتي يمكن تغييرها جميعا لتناسب احتياجات المشروع. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الماضي ، حققت أبحاث القلب والأوعية الدموية تقدما كبيرا في زراعة الخلايا العضلية القلبية. ومع ذلك ، فإن زراعة 3D من الخلايا العضلية القلبية مع الهندسة السليمة ليست راسخة بعد. بالمقارنة مع البروتوكولات السابقة المطبقة على زراعة أنسجة عضلة القلب خارج الجسم الحي ، فإن البروتوكول الذي وصفناه هنا يشبه البيئة الحية للأنسجة عن كثب. علاوة على ذلك ، فإن تطبيق الحمل المسبق واللاحق يسمح ببيئة أكثر محاكاة حيوية. نحن قادرون على تحليل وفهم التسجيل المستمر لبيانات الانكماش ومعلمات الانكماش للأنسجة.
عدد تقنيات زراعة أنسجة القلب والأوعية الدموية خارج الجسم الحي باستخدام إعدادات مماثلة محدودة11،21،22. تستخدم تقنية مماثلة لزراعة شرائح عضلة القلب التي تم نشرها صفيحة من 6 آبار لزراعة شرائح عضلة القلب10. ومع ذلك ، فإن أحد القيود المهمة لهذا الإعداد الخاص هو أن الشرائح لا تتعرض للحمل المسبق واللاحق ، كما أنها ليست قادرة على تقديم رؤية مفصلة للتقلص بمرور الوقت دون الحاجة إلى التعامل مع الأنسجة. الطريقة التي وصفناها هنا تقلل من خطر تلف الأنسجة أو العدوى. علاوة على ذلك ، فإنه يعطي نظرة شاملة للتغيرات المحتملة في القوة الانقباضية كلما تمت إضافة مادة ذات أهمية إلى الزراعة. بالإضافة إلى تحليل قوة الانكماش الطبيعية لكل شريحة ، يسمح الإعداد الحالي بتشغيل بروتوكولات محددة مسبقا بانتظام. هذا يسمح بجمع البيانات من مختلف المعلمات ذات الصلة من الأنسجة المزروعة.
الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول
يجب تجنب تلف الأنسجة ، ويمكن أن يحدث هذا بالفعل أثناء جراحة الزرع. إذا لم يتم نقل الأنسجة على الفور إلى محلول التخزين البارد بعد الاستئصال ، فقد يؤدي ذلك إلى تلف عينات الأنسجة. يحتوي البروتوكول الموصوف على العديد من الخطوات الحاسمة للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. يجب تحضير مركب تضمين أنسجة الأغاروز باستخدام مخزن التقطيع العازل بدون جلوكوز ، لمنع الكراميل المحتمل للجلوكوز أثناء عملية الذوبان قبل بدء البروتوكول. من المهم تجنب التلف الناجم عن ارتفاع الحرارة الناجم عن استخدام الأغاروز مباشرة من الحمام المائي 80 درجة مئوية ، بدلا من احتضان الأغاروز في حقنة عند 37 درجة مئوية. يجب أن تكون درجة الحرارة 4 درجات مئوية أثناء التخزين والقطع لتقليل عملية التمثيل الغذائي وتقليل نقص التروية. أيضا ، يجب التعامل مع الأنسجة بعناية ، عن طريق الاستيلاء على الأغاروز بدلا من الأنسجة نفسها ، عند تحريكها بين صينية القطع وطبق بتري لإرفاق المثلثات البلاستيكية. من الأهمية بمكان أن يتم إرفاق هذه المثلثات في الاتجاه الصحيح فيما يتعلق باتجاه ألياف عضلة القلب. سيؤدي اختلال محاذاة المثلثات إلى تلف الأنسجة.
بشكل عام ، تتراوح عتبة التحفيز للشرائح المقطوعة حديثا بين 10-20 مللي أمبير ، ويجب زيادة التيار بعناية. الإفراط في تحفيز الأنسجة بواسطة تيار مرتفع جدا يمكن أن يؤدي إلى تلف عينة لا رجعة فيه كذلك. بمجرد بدء التحفيز ، يكون تحريك الأنسجة عن طريق هز غرف الزراعة ضروريا ، ويجب ألا يتوقف أبدا لأكثر من 5 دقائق لضمان توافر الأكسجين والمواد المغذية الكافية للأنسجة.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتعديلات
فرط الانقباض
يعد فرط تقلص عينة أنسجة عضلة القلب أحد معايير الاستبعاد الرئيسية للبروتوكول الذي تمت مناقشته. يمكن أن يحدث هذا قبل وبعد إعداد شرائح عضلة القلب. في الحالات التي شعر فيها النسيج ، قبل التحضير ، بالتصلب عند الجس ، لوحظ فرط الانكماش في 70٪ على الأقل من المستحضرات. قد يحدث فرط تقلص عينة الأنسجة أيضا عند إدخالها على الروك ، والذي يعتمد على الأرجح على جودة الأنسجة أو الحالة المرضية للمريض. يمكن النظر إلى فرط الانقباض على أنه زيادة في النغمة الانبساطية أثناء تحفيز الأنسجة ، وهو ما يتوافق مع التقصير المنشط للخلايا العضلية القلبية التالفة في نقص تروية القلب. يمكن أن يكون فرط الانقباض أثناء التحفيز تدريجيا ، حيث يتجاوز الانكماش حد الكشف البالغ 12 mN. ومع ذلك ، قد ينعكس فرط الانقباض أيضا تلقائيا في غضون 30-60 دقيقة ، مما يشير إلى أن الأنسجة يمكن أن تتعافى. لتحسين استعادة الأنسجة ، يجب إعادة ضبط إعدادات التحميل المسبق (أي تكرار الخطوة 8.3) بعد 1 ساعة من الحضانة ، وكذلك في الأيام 2 و 4 و 6 بعد التحضير. قد يكون الانقباض المفرط موجودا مع وبدون الانقباض المحفز للعينات. ومع ذلك ، إذا لم يلاحظ أي انكماش في غضون 1 ساعة ، فلا ينبغي استخدام العينة. في هذه الحالة ، يكون النسيج قد تقلص بشكل مفرط إلى درجة لا يمكنه التعافي منها أو تعرض للتلف بخلاف ذلك. بشكل عام ، أظهرت زراعة شرائح عضلة القلب البشرية وفقا للبروتوكول المقدم ، أن لديها نسبة نجاح تبلغ 90٪.
التغيرات المتوقعة في قوة الانكماش
اعتمادا على العديد من العوامل (على سبيل المثال ، المريض ، التحضير ، تلف الأنسجة) ، من الممكن أن تخضع الشرائح العضلية التي أظهرت انكماشا مقبولا في البداية ، لانخفاض تدريجي في سعات الانقباض خلال ال 24 ساعة الأولى. في الواقع ، يمكن اعتبار هذا السلوك طبيعيا للشرائح التي تم الحصول عليها من القلوب البشرية الفاشلة في المرحلة النهائية. تم العثور على إعادة ضبط التحميل المسبق للشرائح كل يوم لمدة 3 أيام التالية لتخفيف هذه المشكلة وتحسين الانقباض. بعد 24 إلى 48 ساعة ، ومع ذلك ، يجب أن يبدأ الانقباض في الزيادة مرة أخرى. لاحظ أن الانكماش لن يعود إلى مستواه الملاحظ في البداية خلال الأيام الأولى من الزراعة.
بعد فترة وجيزة من التبادل المتوسط ، عندما يتم إرجاع العينات إلى الحاضنة ، يظهر الانكماش عادة زيادة ملحوظة في السعات. يساهم فتح وإغلاق الحاضنة في هذه الزيادة ، لأنه يتسبب في انخفاض مستوى CO2 . هذا يزيد من درجة الحموضة داخل وسط الزراعة المخزن ببيكربونات ، مما يسبب استجابة إيجابية للتقلص العضلي للشرائح. بعد التبادل المتوسط ، غالبا ما تنخفض القوة الانقباضية للشرائح لعدة ساعات حتى تصل إلى قيمتها الأولية أو تتجاوزها. لمنع بروتوكولات التحفيز من التأثر بالتبادل المتوسط ، لا ينبغي تنفيذ بروتوكولات التحفيز إلا بعد 1 ساعة على الأقل من التبادل المتوسط.
قيود الطريقة
ميزة التقنية الحالية بالمقارنة مع طرق الزراعة السابقة لأنسجة عضلة القلب البشرية ، هي إمكانية تطبيق (وتعديل) الحمل المسبق واللاحق على الأنسجة المتعاقدة. ومع ذلك ، من الصعب تحديد الحمل المطبق من حيث توتر الجدار ، على الرغم من أنه يمكن تقدير هذا الحمل من ثابت الزنبرك وأبعاد الشريحة. من المفترض أن هناك علاقة إيجابية بين جدوى أنسجة عضلة القلب وسعة تقلص عينة الأنسجة. ومع ذلك ، لا توجد حاليا طريقة تسمح باختبار الجدوى لكل شريحة على حدة قبل تركيبها على الغرف. يمكن إجراء تلطيخ MTT اللوني على شرائح مقطوعة لا تستخدم للزراعة ، لتحديد صلاحية خلايا عضلة القلب. في الخلايا القابلة للحياة ، سيقلل NADPH من ملح MTT الأصفر في بلورات الفورمازان الأرجوانية. هناك قيد آخر هو أنه في الوقت الحالي ، تقتصر العناصر الغذائية في وسط الزراعة على المكونات الأساسية. وبالتالي ، تختلف العناصر الغذائية والعوامل المتداولة عن البيئة الحية التي تم الحصول على الأنسجة منها. ومع ذلك ، يمكن استكمال الوسط أو تعديله حسب الحاجة.
التطبيقات المحتملة للطريقة
هناك العديد من التطبيقات المحتملة لهذه الطريقة سواء من حيث سمية القلب واختبار المخدرات ، وكذلك في فهم الفيزيولوجيا المرضية لأمراض القلب. أولا ، يمكن استخدام النظام المستخدم في البروتوكول الذي تمت مناقشته لفحوصات الأدوية وسمية القلب. بمساعدة بروتوكولات التحفيز القابلة للبرمجة ، يمكن تحليل التغيرات الفسيولوجية استجابة لإدارة الدواء. فيما يتعلق بتفسير الفترة الحرارية ، يجب النظر في أن هذه معلمة وظيفية ، لا تعكس بدقة تأثير الأدوية على المدة المحتملة للعمل. ثانيا ، يمكن استخدام غرف الزراعة لمختلف تجارب الزراعة المشتركة لعضلة القلب بالاشتراك مع الخلايا المناعية. باستخدام هذه الزراعة المشتركة ، يمكن تقييم الآثار المباشرة للعوامل التي تفرز الخلايا المناعية على تقلص عضلة القلب. وأخيرا، يمكن أيضا زراعة عينات اعتلال عضلة القلب غير المزروعة، على الرغم من أن عينات الأنسجة غير المزروعة هذه أصغر حجما بشكل عام وبالتالي يصعب معالجتها. ومع ذلك، قد يفتح هذا الباب أمام إمكانيات لتحديد أهداف علاجية جديدة وتطوير أدوية مستهدفة. من الممكن أيضا استخدام هذه التقنية لتوصيف الأنسجة الخاصة بالمريض ، مما يقربنا خطوة واحدة من الطب الشخصي. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام الطريقة المقدمة لأنسجة عضلة القلب غير البشرية ، ومن الأمثلة على ذلك الخنزير والأرنب. يجب النظر في أنه لا يمكن الحصول على معدل ضربات القلب الفسيولوجي المرتفع للثدييات الصغيرة (الفأر / الفئران) ، لأن متطلبات O2 الأعلى اللاحقة لا يمكن الوفاء بها في ظل ظروف زراعة عضلة القلب باستخدام الإعداد الذي تمت مناقشته. وبالتالي ، يصعب محاكاة بيئة شبه فسيولوجية في هذه الحالات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JH ، PS ، DM ، و KL ليس لديهم ما يكشفون عنه. AD و TS مساهمان في InVitroSys GmbH ، التي توفر نظام زراعة Myodish.
Acknowledgments
تم تمويل البحث من خلال منح DZHK 81Z0600207 (JH و PS و DM) و 81X2600253 (AD و TS).
يود المؤلفون أن يشكروا كلوديا فاهني ومي بينغ وو وماتياس سيميش على دعمهم في إعداد الإعدادات، وكذلك على الصيانة المنتظمة لزراعة الأنسجة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish culture system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
References
- George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
- Lu, K., et al. Progressive stretch enhances growth and maturation of 3D stem-cell-derived myocardium. Theranostics. 11 (13), 6138-6153 (2021).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS one. 7 (5), 38147 (2012).
- Klumm, M. J., et al. Long-term cultivation of human atrial myocardium. Frontiers in Physiology. 13, 839139 (2022).
- Krane, M., et al. Sequential defects in cardiac lineage commitment and maturation cause hypoplastic left heart syndrome. Circulation. 144 (17), 1409-1428 (2021).
- Miller, J. M., et al. Heart slice culture system reliably demonstrates clinical drug-related cardiotoxicity. Toxicology and Applied Pharmacology. , 406 (2020).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Kang, C., et al. Human organotypic cultured cardiac slices: new platform for high throughput preclinical human trials. Scientific Reports. 6 (1), 1-13 (2016).
- Ou, Q., et al. Slicing and culturing pig hearts under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), e60913 (2020).
- Ou, Q., et al. Physiological biomimetic culture system for pig and human heart slices. Circulation research. 125 (6), 628-642 (2019).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 1-15 (2019).
- Abu-Khousa, M., et al. The degree of t-system remodeling predicts negative force-frequency relationship and prolonged relaxation time in failing human myocardium. Frontiers in Physiology. 11, 182 (2020).
- Bojkova, D., et al. SARS-CoV-2 infects and induces cytotoxic effects in human cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 116 (14), 2207-2215 (2020).
- Esfandyari, D. A. -O., et al. MicroRNA-365 regulates human cardiac action potential duration. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
- Moretti, A., et al. Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine. 26 (2), 207-214 (2020).
- Pitoulis, F. G., et al. Remodelling of adult cardiac tissue subjected to physiological and pathological mechanical load in vitro. Cardiovascular Research. 118 (3), 814-827 (2021).
- Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
- de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).
- Schleifer, K. J. Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).
- Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent. Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
