Summary
Presentamos un protocolo para el cultivo ex vivo de tejido miocárdico ventricular humano. Permite un análisis detallado de la fuerza de contracción y la cinética, así como la aplicación de pre y postcarga para imitar más de cerca el entorno fisiológico in vivo .
Abstract
El cultivo de cardiomiocitos ha visto un gran número de desarrollos, que van desde el cultivo de células bidimensionales (2D) hasta los organoides derivados de iPSC. En 2019, se demostró una forma ex vivo de cultivar rebanadas de miocardio obtenidas de muestras de corazón humano, mientras se acercaba a la condición in vivo de contracción miocárdica. Estas muestras se originan principalmente en trasplantes de corazón o colocaciones de dispositivos de asistencia ventricular izquierda. Utilizando un vibratomo y un sistema de cultivo especialmente desarrollado, se colocan rodajas de 300 μm de espesor entre un alambre fijo y un alambre de resorte, lo que permite un cultivo estable y reproducible durante varias semanas. Durante el cultivo, las rebanadas se estimulan continuamente de acuerdo con los entornos individuales. Las contracciones se pueden mostrar y registrar en tiempo real, y los agentes farmacológicos se pueden aplicar fácilmente. Los protocolos de estimulación definidos por el usuario se pueden programar y realizar para evaluar parámetros vitales de contracción como la potenciación posterior a la pausa, el umbral de estimulación, la relación fuerza-frecuencia y el período refractario. Además, el sistema permite un ajuste variable de pre y postcarga para un cultivo más fisiológico.
Aquí, presentamos una guía paso a paso sobre cómo generar un cultivo exitoso a largo plazo de cortes de miocardio del ventrículo izquierdo humano, utilizando una solución de cultivo biomimético comercial.
Introduction
En la última década, el cultivo in vitro de células miocárdicas ha realizado grandes avances, que van desde técnicas 2D y tridimensionales (3D) hasta el uso de organoides y células madre pluripotentes inducidas diferenciadas en miocitos cardíacos 1,2,3. Los cultivos de células primarias y ex vivo han demostrado ser de gran valor, especialmente para estudios genéticos y desarrollo de fármacos 4,5,6. El uso de tejidos humanos mejora el valor traslacional de los resultados. Sin embargo, el cultivo 3D a largo plazo de tejidos miocárdicos con geometría intacta no está bien establecido. La geometría intacta es una característica clave para imitar las condiciones in vivo, ya que la función cardíaca adecuada, la comunicación entre diferentes células, así como las interacciones célula-matriz son requisitos previos. El cultivo de tejido miocárdico pasó por varias fases de desarrollo. La tasa de éxito y la estabilidad del cultivo de tejido miocárdico ex vivo fueron inicialmente bastante bajas, pero los enfoques recientes han arrojado resultados prometedores 7,8,9,10,11.
Entre ellos, Fischer et al. fueron los primeros en demostrar que la viabilidad y el rendimiento contráctil del tejido miocárdico humano se pueden mantener en el cultivo de células ex vivo durante muchas semanas7. Su técnica se basaba en finas rebanadas de tejido cortadas a partir de miocardio humano explantado, que se montaban en cámaras de cultivo recientemente desarrolladas que proporcionaban condiciones biomecánicas definidas y estimulación eléctrica continua. Este método de cultivo se asemeja mucho a la función in vivo del tejido miocárdico, y ha sido reproducido por varios grupos de investigación independientes 2,12,13,14,15. Es importante destacar que las cámaras utilizadas por Fischer et al. también permitieron el registro continuo de las fuerzas desarrolladas durante un máximo de 4 meses, y por lo tanto abrieron oportunidades sin precedentes para la investigación fisiológica y farmacológica sobre el miocardio humano intacto7.
Técnicas similares fueron desarrolladas de forma independiente por otros grupos y aplicadas al miocardio humano, de ratas, porcinos yconejos 7,10,11. Pitoulis et al. desarrollaron posteriormente un método más fisiológico, que reproduce la relación fuerza-longitud normal durante un ciclo de contracción, pero es menos adecuado para el análisis de alto rendimiento16. Como tal, el enfoque general del cultivo biomimético puede considerarse como un paso más en la reducción, refinamiento y reemplazo (3R) de los experimentos con animales.
Sin embargo, la explotación de este potencial requiere procedimientos estandarizados, análisis de alto contenido y un alto nivel de rendimiento. Presentamos una técnica que combina el corte automatizado de miocardio humano vivo con el mantenimiento in vitro en un sistema de cultivo biomimético que ha llegado a estar disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales). Con el enfoque propuesto, el número de rebanadas individuales que se pueden generar a partir de una sola muestra transmural de miocardio solo está limitado por el tiempo de procesamiento. Una muestra de tamaño y calidad suficientes (3 cm x 3 cm) a menudo produce 20-40 rebanadas de tejido que se cortan convenientemente con un vibratomo automatizado. Estas rodajas se pueden colocar en cámaras de cultivo pertenecientes al sistema. Las cámaras permiten la estimulación eléctrica, cuyos parámetros se pueden modular (es decir, la duración del pulso, la polaridad, la velocidad y la corriente), así como el ajuste de la precarga y la poscarga, utilizando cables de resorte dentro de las cámaras. La contracción de cada rebanada se registra a partir del movimiento de un pequeño imán unido a un cable de resorte y se muestra como un gráfico interpretable. Los datos se pueden registrar en todo momento y analizar utilizando software disponible gratuitamente. Además de la estimulación basal constante, se pueden realizar protocolos programados para evaluar funcionalmente su período refractario, umbral de estimulación, potenciación posterior a la pausa y relación fuerza-frecuencia.
Este cultivo biomimético a largo plazo de múltiples rebanadas de miocardio de un corazón individual allana el camino para futuras investigaciones ex vivo en tejidos humanos y animales, y facilita la detección de efectos farmacológicos terapéuticos y cardiotóxicos en medicina cardiovascular. Ya se ha aplicado a diversos enfoques experimentales 2,12,13,15. Aquí, damos una descripción detallada paso a paso de la preparación del tejido humano y proporcionamos soluciones para los problemas de cultivo que se encuentran con frecuencia.
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Protocol
La recolección de tejidos para los experimentos descritos aquí fue aprobada por las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Munich y la Universidad Ruhr-Bochum. Los estudios se realizaron de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki. Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la recolección de tejidos.
1. Adquisición de tejidos
- Obtener tejido humano de pacientes sometidos a trasplante de corazón o cirugía cardíaca.
- Antes de obtener el tejido, prepare 2 L de solución cardiopléjica (también conocida como tampón de corte (Tabla 1)).
- Después de obtener una biopsia transmural del ventrículo izquierdo (VI) transmural de 4 cm x 4 cm de tamaño, coloque el tejido inmediatamente (dentro de los 5 minutos posteriores a la escisión) en un vaso de precipitados estéril de plástico de un solo uso que contenga aproximadamente 70 ml de tampón de corte frío (4 ° C). Mantener a 4 °C.
NOTA: El tampón de corte utilizado en este protocolo permite el almacenamiento en frío (4 °C) del tejido durante un máximo de 36 h. Esto permite el transporte en frío del tejido desde clínicas que no están cerca del laboratorio. Sin embargo, los tiempos de transporte ≤ 24 h han demostrado ser óptimos.
2. Preparación de la agarosa y el vibratomo
- Asegúrese de que se preparen y esterilizen suficientes cámaras de cultivo (Figura 1A).
- Sumergir las cámaras y los electrodos de grafito en 1 L de una solución de isopropanol al 10% y agitar durante la noche. Al día siguiente, transfiera las cámaras a una solución de isopropanol al 100% durante 3 min y autoclave los electrodos de grafito a 120 °C durante 10 min.
- Deje que las cámaras y los electrodos de grafito se sequen al aire bajo una campana de flujo laminar.
- Conecte una placa de circuito a cada una de las cámaras de acuerdo con las posiciones disponibles en el balancín. Coloque dos electrodos de grafito en la placa de circuito según las instrucciones del fabricante.
- Coloque una tapa de placa de Petri de 35 mm en la parte superior de la cámara para evitar la contaminación.
- Configure el sistema de cultivo Myodish (ver Tabla de Materiales) en una incubadora a 37 °C y 5% CO2 conectando el sistema a una computadora (Figura 1B).
- Prepare la agarosa de baja fusión al 4% en tampón de corte (sin glucosa; Tabla 2). La agarosa se puede almacenar a 4 °C durante 6 meses.
- El día del experimento, derrita un volumen de caldo de solución de agarosa utilizando un baño de agua a 80 ° C. Dependiendo de la cantidad, la fusión tarda aproximadamente 30 min.
- Cuando la agarosa es líquida, extraiga 8 ml de agarosa líquida en una jeringa de 10 ml, con 2 ml adicionales de aire. Cierre la jeringa con una tapa estéril y colóquela boca abajo en un baño de agua a 37 °C durante 20 min, para evitar que la agarosa se solidifique y para equilibrar su temperatura para evitar el daño por hipertermia de la muestra.
- Si está presente, encienda el dispositivo de enfriamiento por agua del vibratomo al menos 30 minutos antes de cortar el tejido para permitir una capacidad de enfriamiento suficiente. Ajuste la temperatura de la circulación del agua a 4 °C.
NOTA: La bandeja de corte y la placa de enfriamiento utilizadas aquí contenían una circulación de agua incorporada. Esto es muy recomendable para el enfriamiento y para reducir los riesgos de contaminación. Sin embargo, también es posible utilizar el hielo como técnica de enfriamiento. Además, el dispositivo de enfriamiento por agua no necesita estar conectado a la bandeja de corte y / o placa de enfriamiento del vibratomo en este punto del protocolo. - Limpie la bandeja de corte y la placa de muestra del vibratomo enjuagando todas las superficies con 100% de isopropanol durante al menos 3 min.
NOTA: Dependiendo del sistema vibratome utilizado, la configuración del vibratome puede diferir. Consulte el manual del vibratomo presente en el laboratorio para obtener información sobre la configuración y los métodos de calibración de la cuchilla. - Llene la bandeja de corte hasta un 90%-95% con tampón de corte. En la configuración utilizada actualmente, esto corresponde a aproximadamente 400 ml. Conecte el tubo del dispositivo de enfriamiento por agua a las válvulas de la bandeja de corte y la placa de enfriamiento del vibratomo.
- Desinfectar todas las herramientas necesarias para la preparación sumergiéndolas en una solución 100% isopropanol durante 5 s. Retire las herramientas de la solución de isopropanol y séquelas al aire debajo de la campana de flujo laminar.
3. Recorte e incrustación de las muestras
- Transfiera la muestra de tejido a una placa de Petri de 100 mm llena de tampón de corte frío. Mantenga el plato en una placa de enfriamiento a 4 ° C (conectado al refrigerador o colocado sobre hielo).
- Retire las trabéculas endocárdicas sosteniendo el endocardio con pinzas y usando tijeras para cortar aproximadamente 3 mm de tejido endocárdico. De la misma manera, elimine el exceso de tejido adiposo debajo del epicardio si está presente.
- Fijar la muestra de tejido cortado, lado endocárdico hacia arriba, a un parche de goma de 2 cm x 2 cm utilizando cuatro agujas de 0,9 mm x 70 mm 20 G que se fijan en posición cuadrada (0,9 cm x 0,9 cm; Figura 1C, D). Asegúrese de que el borde diagonal de cada punta de la aguja apunte hacia adentro. Esto mejora la fijación y previene el daño al miocardio.
PRECAUCIÓN: La orientación del cuadrado mencionado anteriormente debe ser ortogonal a la dirección miofibra predominante esperada. - Corte todo el exceso de tejido fuera del cuadrado de cuatro agujas con un bisturí. Si el tamaño de la muestra original lo permite, utilice dos muestras de tejidos miocárdicos durante esta preparación a partir de la misma muestra cruda.
- Usando pinzas, coloque la muestra recortada en un pedazo estéril de tejido para eliminar cualquier exceso de tampón de corte que quede en la muestra. Para evitar que se seque la muestra, no la mantenga en el tejido por más de 10 s.
- Coloque la(s) muestra(s) en una placa de Petri de 35 mm, de modo que la cuchilla corte perpendicularmente a la alineación de los cardiomiocitos y el epicardio esté mirando hacia abajo. Si la preparación incluye dos muestras, asegúrese de que las muestras estén centradas y no se toquen entre sí.
- Tome la jeringa de agarosa del baño de agua y sumerja la(s) muestra(s) en agarosa. (Figura 2A). Deje que la agarosa se solidifique durante 5 minutos en una placa de enfriamiento. La(s) muestra(s) debe(n) permanecer en contacto con la placa de Petri, lo que asegurará que el plano de corte sea paralelo a la dirección predominante de la fibra miocárdica.
PRECAUCIÓN: No vacíe completamente la jeringa, con el fin de evitar burbujas de aire. Preste atención a la cantidad de agarosa que queda en la jeringa durante la inmersión de las muestras. En el caso de burbujas de aire en el plato con las muestras, tire cuidadosamente de las burbujas de aire hacia la jeringa.
4. Colocación de las muestras en la bandeja de corte
- Retire la agarosa solidificada que contiene la(s) muestra(s) de la placa de Petri de 35 mm utilizando una espátula o herramienta similar, encajándola entre la muestra y el lado de la placa de Petri. Corte parte de la agarosa con un bisturí mientras mantiene las muestras cubiertas.
PRECAUCIÓN: No retire demasiado de la agarosa. Debe quedar al menos 5 mm de agarosa en los lados largo y corto en el plano X / Z.
NOTA: Los pasos 4.2-4.4 deben realizarse en rápida sucesión (es decir, máximo de 5 s). Tener todas las herramientas necesarias a su alcance antes de comenzar. No es posible el reposicionamiento de la muestra después de la colocación. Trate de limitar la exposición del pegamento al aire y la humedad. El contacto con el aire o los fluidos solidificará el pegamento, haciéndolo inutilizable. - Con una pipeta, coloque y distribuya 60 μL de pegamento dentro y alrededor del centro de la plataforma de corte.
- Coloque el lado epicárdico de la muestra contenida en la agarosa sobre el área pegada con pinzas. No reposicionar. El lado endocárdico de la muestra debe ser visible en la agarosa. Deje que el pegamento se solidifique durante 1 min. Presione suavemente la agarosa que contiene la muestra desde la parte superior con una herramienta roma (por ejemplo, pinzas) mientras evita cortar o dañar la agarosa.
- Coloque la plataforma de muestra en su posición designada en la bandeja de corte del vibrátomo, llena de tampón de corte.
5. Arranque del vibratomo
- Ajuste la amplitud de vibración a 1 mm y la velocidad de corte inicial a 0,07 mm/s. Ajuste el grosor de la rebanada a 300 μm para cortar las rodajas.
- Siempre que la cuchilla solo corte la agarosa, aumente la velocidad de corte a su máximo, que en este caso es de 1.50 mm / s. Tan pronto como el vibratome comience a cortar el tejido, disminuya la velocidad a 0.07 mm / s inmediatamente.
NOTA: Si el tejido no se corta suavemente, por ejemplo, si hay grandes áreas fibróticas en la muestra, puede ayudar a aumentar la amplitud de corte hasta 1,5 mm y reducir la velocidad de corte a 0,04 mm / s.
6. Preparación del medio y la incubadora durante el procedimiento de corte
- Llene cada cámara de cultivo con 2,4 ml de medio de cultivo completo (Tabla 3).
- Coloque las cámaras de cultivo llenas de medio en el sistema de cultivo en la incubadora a 37 ° C, 5% CO2, 21% O2 y una humedad del 80%. Equilibrar el medio durante al menos 20 min.
- Conecte el sistema de cultivo con una computadora e inicie el programa de software correspondiente.
- Ajuste la velocidad del balancín a 60 rpm y preestablezca los parámetros de estimulación (pulsos de estimulación y frecuencia). Para las rebanadas cardíacas humanas, establezca la estimulación estándar a impulsos bifásicos con corriente de 50 mA, cada una de las cuales consiste en 3 ms de corriente positiva, una pausa de 1 ms y un pulso de 3 ms de corriente invertida, a una velocidad de ritmo de 30 latidos por minuto (BPM).
NOTA: En tejidos bien conservados, el umbral de estimulación típico es de alrededor de 15 mA. Para garantizar una estimulación fiable y tener en cuenta cualquier posible aumento del umbral de estimulación, se recomienda establecer la corriente en un valor que supere el umbral de estimulación de dos a tres veces. - Verifique los indicadores de electrodos del software para verificar que los electrodos de las cámaras de cultivo funcionen correctamente.
NOTA: Se necesita acción cada vez que el indicador de canal en el software de cultivo se vuelve rojo. En este caso, las cargas de pulso bipolar no están equilibradas.
7. Preparación de las rodajas
NOTA: Las rebanadas subendocárdicas iniciales comúnmente no son adecuadas para el cultivo de tejidos y deben descartarse debido a la morfología desigual. Después de las primeras cinco a 10 rebanadas, la textura y la morfología de la rebanada mejoran. La rebanada ideal es de al menos 1 cm x 1 cm, no tiene parches fibróticos o solo tiene parches fibróticos limitados, no está fragmentado y tiene una alineación de fibra homogénea (Figura 2B, D). La fibrosis intersticial, ubicada entre las fibras de los miocitos, a menudo está presente en el miocardio humano fallido. Sorprendentemente, esto no es un predictor negativo del éxito del cultivo.
- Vierta una cantidad adecuada de tampón de corte frío en una tapa de placa de Petri de 5 cm para asegurarse de que las rebanadas no se sequen. Coloque las rodajas en la tapa de la placa de Petri que contiene el tampón de corte en frío.
- Separe la agarosa del tejido usando pinzas. Evite tocar el tejido. Maneje el tejido con cuidado, ya que cualquier daño al tejido reducirá la tasa de éxito del cultivo.
- Determine la dirección de las fibras miocárdicas mediante una inspección cercana contra una fuente de luz. Esto es importante cuando se unen los triángulos de plástico al tejido en el paso 7.6.
NOTA: Los pasos 7.4 y 7.5 deben realizarse en rápida sucesión, dentro de los 5 s. - Conecte dos triángulos de plástico a una muestra con pegamento para anclar el tejido dentro de las cámaras de cultivo.
- Coloque 1 μL de pegamento en una tapa estéril de placa de Petri. Use una pinza enganchada para recoger uno de los triángulos de plástico en autoclave. Sumerja rápidamente el borde frontal del triángulo en el pegamento y pegue el triángulo sobre la muestra, perpendicular a la alineación de los cardiomiocitos. Repita para el otro triángulo.
- Recorte el tejido que exceda el ancho del triángulo con un bisturí (Figura 2C). Coloque la rodaja con los dos triángulos montados de nuevo en el búfer de corte de la bandeja de corte.
NOTA: Repita los pasos 7.2 a 7.5 hasta que se preparen suficientes rebanadas para llenar las cámaras de cultivo. Recomendamos preparar algunas rebanadas adicionales para permitir el reemplazo de las rebanadas con una contracción deficiente.
8. Montaje de las rodajas
NOTA: La poscarga está determinada por la rigidez del alambre de resorte en las cámaras de cultivo. Hay tres tipos diferentes disponibles, según el grosor del cable de resorte.
- Tome una cámara de cultivo de llenado medio de la incubadora. Seleccione una de las rodajas preparadas e insértela en la cámara conectando un triángulo a cada pasador.
- Ajuste la distancia entre los pasadores de montaje de acuerdo con el tamaño de la muestra. Asegúrese de que la muestra esté sumergida en medio. Vuelva a colocar la cámara en su zócalo designado del sistema de cultivo en la incubadora.
PRECAUCIÓN: ¡No estire demasiado el tejido y no doble demasiado el alambre del resorte! - Ajuste la tensión de precarga después de colocar el plato en el balancín.
- Disminuya la precarga girando el tornillo de ajuste en sentido contrario a las agujas del reloj. Haga esto hasta que la línea de base del gráfico correspondiente en la pantalla de la computadora ya no cambie.
- Aumente cuidadosamente la precarga (es decir, aumente la tensión) girando el tornillo de ajuste en el sentido de las agujas del reloj. Para las cámaras con mayor rigidez, continúe hasta que la línea de base correspondiente en el gráfico haya aumentado en 1000-1200 unidades, lo que corresponde a 1 mN de precarga.
NOTA: El ajuste exacto dependerá de la constante de resorte individual de una cámara de cultivo, que se puede determinar mediante calibración antes de un experimento de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El software de grabación permite considerar la calibración de la cámara individual para que las fuerzas se muestren uniformemente en μN. Se recomienda aplicar estimulación eléctrica desde el inicio del cultivo. Como tal, es muy posible que la rebanada comience a contraerse durante el ajuste de precarga. En este caso, concéntrese en la línea de base diastólica para evaluar la precarga.
9. Cambiar el medio
- Prepare el medio de cultivo de acuerdo con la receta de la Tabla 3. Poco antes de usar el medio, agregue 50 μL de β-mercaptoetanol (50 mM) a un tubo de 50 mL. Conservar a 4 °C.
- Una vez cada 2 días, intercambie parcialmente el medio de cultivo. Refresque el medio cada 2 días, si se desea el cultivo a largo plazo de las rodajas de miocardio.
- Precaliente el medio fresco en un baño de agua o incubadora de aire caliente a 37 °C durante 30-45 min. Retire una cámara de cultivo de la incubadora y colóquela debajo de una campana de flujo laminar.
PRECAUCIÓN: Es esencial mantener la cámara, así como el medio, caliente a 37 °C (> 35 °C) para evitar hipercontracciones debido a la baja temperatura. El daño menos distintivo puede estar presente como un aumento de la tensión diastólica dentro de unas pocas horas después del intercambio medio. Esto puede parecer que se recupera, pero el estrés repetido puede resultar en un deterioro acumulado. - Retire el medio de la cámara de cultivo, dejando aproximadamente 0,8 ml en la cámara. Añadir 1,6 ml de medio fresco a la misma cámara. El volumen total del medio debe ser de alrededor de 2,4 ml por cámara.
- Coloque la cubierta de la cámara hacia atrás y vuelva a colocar la cámara de cultivo en su posición respectiva.
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Representative Results
La contracción de las rodajas de miocardio se mostró en la pantalla de la computadora después de la inserción de la cámara de cultivo en su conector correspondiente (Figura 3). La contracción de las rebanadas de miocardio humano comenzó inmediatamente después de la estimulación. Las rebanadas hipercontraídas durante 5-10 min. Esto fue visible como un aumento de las fuerzas diastólicas, causadas por una contractura tónica de fracciones de tejido dañadas. Este proceso se revirtió en diversos grados dentro de 1-1.5 h. Después de la estabilización, las rodajas de tejido del VI humano mostraron fuerzas de contracción que variaron entre 1 mN y 3 mN tras la estimulación. La sístole se muestra como un fuerte aumento en la fuerza de contracción, seguido de la diástole con una disminución igualmente pronunciada de la fuerza de contracción.
La contracción de las rebanadas de miocardio fue registrada por el software de cultivo y guardada en un archivo designado. Cada uno de los archivos de datos sin procesar generados se convirtió a un formato de archivo binario Axon legible (.abf) para facilitar el análisis y la cuantificación de los datos. Para el análisis inicial, el archivo .abf se abrió en un programa apropiado. Se seleccionaron aproximadamente 5 min de datos de contracción para establecer la amplitud de contracción promedio durante este período. Esto se hizo para múltiples puntos de tiempo en el archivo de datos registrados. El trazado de estos valores de contracción a lo largo del tiempo arrojó un gráfico útil para comparar el desarrollo de la contracción en un entorno control y experimental. Para obtener una visión más avanzada del rendimiento de las rebanadas generadas, se ejecutaron protocolos de estimulación. Durante estos protocolos, que duran aproximadamente 45 min, se modificaron los parámetros de estimulación para evaluar los parámetros de acoplamiento de contracción.
El protocolo de estimulación actual constaba de cuatro secciones distintas: potenciación post-pausa, umbral de estimulación, relación fuerza-frecuencia y período refractario (Figura 4, Tabla 4). Durante la potenciación posterior a la pausa, la estimulación se reanuda después de una breve interrupción de 3, 12, 50 o 120 s. Para determinar el umbral de estimulación, la corriente de estimulación se incrementa en pasos de 3 mA cada 10 s, comenzando en 8 mA y aumentando a 90 mA. Con esta prueba, se puede determinar la corriente de estimulación mínima para cada rebanada. Esto no altera la configuración general de estimulación fuera del protocolo de estimulación. La relación fuerza-frecuencia se evalúa mediante un aumento gradual de la frecuencia de estimulación (20, 30, 45, 60, 80, 100, 120, 150, 180, 210 y 240 BPM), mientras que la duración respectiva de cada paso se acorta en paralelo. A excepción de los dos primeros ajustes de frecuencia, este régimen produce entre 20-40 contracciones durante cada paso. El período refractario de cada rebanada se evalúa enviando un estímulo prematuro (S2) después de un estímulo normal (S1; 30 BPM). El intervalo S1-S2 se acorta cada 10 s.
Para demostrar el potencial del sistema de cultivo presentado como herramienta para probar intervenciones farmacológicas, se prepararon rodajas de tejido del VI humano ex vivo del mismo paciente y se sometieron a agentes farmacológicos que influyen en los niveles intracelulares de iones de calcio (Ca2+) (n = 1) después de 2 semanas de cultivo. El antagonista del canal Ca2+ de tipo L nifedipino inhibe la afluencia de Ca2+ en las células miocárdicas y, por lo tanto, disminuye la disponibilidad intracelular de Ca2+ y reduce la contractilidad17. Debido a su acción vasodilatadora, la nifedipina se utiliza como un fármaco antihipertensivo. Para demostrar las diferencias farmacológicas de los antagonistas de los canales Ca2+, se investigó la calciseptina para la comparación. La calciseptina es también un antagonista del canal Ca2+ de tipo L, extraído del veneno de Dendroaspis p. polylepis 18. Por lo tanto, comparte la acción inotrópica negativa de nifedipino. Sin embargo, la calciseptina tiene diferentes características de unión y es más potente en comparación con la nifedipina19. Con el fin de estudiar las modulaciones positivas y negativas de la disponibilidad de Ca2+ , también probamos el agonista del canal de calcio Bay-K8644 (1,4-Dihydro-2,6-dimethyl-5-nitro-4-(2-[trifluoromethyl]phenyl)pyridine-3-carboxylic acid methyl ester)20.
Tres rebanadas fueron tratadas con nifedipino (125 nM), calciseptina (70,8 nM) y Bay-K8644 (417 nM) respectivamente, mientras que la cuarta rebanada no recibió ningún fármaco (control). Las fuerzas de contracción bajo los parámetros generales de estimulación (corriente de 50 mA, pulsos bifásicos de 3 ms de duración, intervalo de 1 ms y tasa de estimulación de 30 BPM) se compararon antes y después del tratamiento. Además, antes del tratamiento, se ejecutó un protocolo de estimulación para evaluar los valores basales de potenciación posterior a la pausa, el umbral de estimulación, la relación fuerza-frecuencia y el período refractario. Después de 30 minutos de tratamiento, se ejecutó un segundo protocolo de estimulación. Para eliminar las diferencias interindividuales, la amplitud de contracción de cada rebanada se normalizó a su nivel basal antes del tratamiento. La línea de base (es decir, el 100%) se determinó analizando los últimos cinco ciclos de contracción antes del inicio del protocolo de estimulación previo al tratamiento.
Al analizar la contracción de las rebanadas a la estimulación general, se observó que la fuerza de contracción de las rebanadas tratadas con antagonistas de Ca2+ (nifedipino y calciseptina) disminuyó a los 10 min post-tratamiento (Figura 5) y el efecto estuvo presente hasta 20 min post-tratamiento. En contraste, el agonista del canal Ca2+ dependiente de voltaje Bay-K8644 aumentó la fuerza de contracción de la rebanada tratada. El segmento de control no mostró un cambio notable. Los datos de contracción generados durante los protocolos de estimulación fueron analizados de manera similar. Aquí, los datos generados por el protocolo de estimulación realizado antes del tratamiento (pre-tratamiento) se compararon con los datos post-tratamiento del mismo protocolo de estimulación.
Como se discutió anteriormente, el protocolo de estimulación comenzó con la evaluación de la potenciación posterior a la pausa. Durante la pausa, el retículo sarcoplásmico (SR) absorbe Ca2+ adicional, que se libera tras la primera estimulación después de la pausa. Por lo tanto, la potenciación posterior a la pausa refleja la liberación intracelular de Ca2 + de la SR. Como tal, este parámetro se puede utilizar para evaluar la contribución relativa de Ca2+ liberado del SR por el receptor de rianodina. Para evaluar la potenciación de las rodajas después de una pausa de estimulación, la fuerza de la primera contracción después de la pausa se dividió por la contracción promedio antes de la pausa respectiva. El segmento de control no mostró ningún cambio notable (Figura 6A). Se observó que la inhibición de los canales de Ca2+ tipo L condujo a la potenciación de la primera contracción después de una pausa de al menos 50 s (Figura 6B,D), reflejando una mayor contribución relativa de la liberación intracelular de Ca2+ a la contractilidad total. El efecto contrario se observó en la rebanada tratada con Bay-K8644, que estimula la entrada de Ca2+ extracelular a través de los canales Ca2+ de tipo L (Figura 6C).
La relación fuerza-frecuencia se evaluó aumentando sucesivamente la tasa de estimulación hasta 180 BPM. Para una mejor visualización, la fuerza de contracción a diferentes frecuencias de estimulación se normalizó a la contracción basal a 30 BPM dentro del mismo protocolo (=100%). El análisis de los datos mostró que el tratamiento con calciseptina no cambió la capacidad del corte para seguir los estímulos al aumentar la frecuencia de estimulación al comparar los datos previos y posteriores al tratamiento (Figura 7B). No se observó ningún cambio en el segmento de control (Figura 7A). Contrariamente a la calciseptina, la nifedipina previno un aumento de la contractilidad a tasas de estimulación más altas y redujo la tasa máxima de captura a 80 BPM (Figura 7D). La rebanada tratada con el agonista del canal Ca2+ Bay-K8644 mostró un aumento de la fuerza de contracción a frecuencias de estimulación muy bajas (Figura 7C). Sin embargo, a frecuencias superiores a 50 BPM, la fuerza de contracción pareció ser menor que durante la condición previa al tratamiento. El umbral de estimulación y el período refractario también se determinaron antes y después del tratamiento. Sin embargo, no se observaron diferencias y, por lo tanto, los datos no se muestran.
Figura 1: Descripción general de los materiales requeridos y el sistema de cultivo. (A) Una cámara de cultivo vacía conectada a una placa de circuito verde. La placa de circuito (1) mide la contracción con un sensor y transmite los datos al controlador. (B) Ocho cámaras llenas colocadas en la placa principal de balanceo. Las tapas de placas de Petri (35 mm) se utilizan para cubrir las cámaras. (C) Las herramientas (quirúrgicas) necesarias para recortar la muestra transmural de miocardio. Se representan varias pinzas, las cuchillas necesarias para el vibrátomo y un parche de goma para ayudar en el recorte. (D) Cuatro agujas de 0,9 mm x 70 mm 20 G que se fijan en posición cuadrada (0,9 cm x 0,9 cm) mediante un bloque sólido de plástico. El uso de esta construcción evita el daño y el movimiento de la muestra al recortar y produce un bloque de tejido con las dimensiones requeridas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Procesamiento de dos muestras de VI. (A) Dos bloques de tejido miocárdico (aproximadamente 1 cm x 1 cm x 1 cm) incrustados en agarosa solidificada de baja fusión en una placa de Petri de 35 mm. Para fines de demostración, se utilizó tejido porcino del VI. (B) El bloque de agarosa con las muestras incrustadas se retiró de la placa de Petri, se recortó y se pegó a la plataforma de corte del vibratome. Aquí, el tejido porcino del VI se utilizó con fines de demostración. Observe el color uniforme del tejido y la ausencia de tejido fibrótico blanco, indicado por la flecha roja. (C) Después del corte, la agarosa se retira cuidadosamente y los triángulos de plástico (1) se conectan perpendicularmente a la dirección de las fibras miocárdicas. Las líneas rojas indican la dirección de las fibras miocárdicas. (D) Se preparó tejido humano del VI, que mostraba tejido fibrótico blanco dentro de las rodajas. Esto no necesariamente reduce la tasa de éxito del cultivo; sin embargo, se recomienda utilizar rebanadas que no muestren fibrosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El software de cultivo. Dependiendo del número de canales utilizados (máximo de ocho), el registro de contracción se visualizará en hasta tres ventanas designadas (dos visibles en la figura). Cada cámara de cultivo se muestra como un gráfico de contracción. En la ventana de configuración, los parámetros de estimulación se pueden alterar y adaptar a la situación experimental deseada. Esta ventana también permite iniciar o detener el protocolo/programa de estimulación que se selecciona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Lectura de la contracción de cinco rebanadas de miocardio durante un protocolo de estimulación típico. En todos los paneles, cada rebanada individual se muestra en el mismo color. (A) La potenciación posterior a la pausa evalúa la primera contracción después de una breve pausa de estimulación de 3, 12, 50 y 120 segundos respectivamente. (B) Determinación del umbral de estimulación aumentando la corriente de estimulación en pasos de 3 mA cada 10 s de 8 mA a 80 mA. (C) La relación fuerza-frecuencia de cada rebanada se evalúa mediante aumentos graduales de la frecuencia de estimulación de 12 BPM a 240 BPM. La duración de los períodos de estimulación se acorta a frecuencias más altas para mantener constante el número de latidos en cada frecuencia. (D) Para evaluar el período refractario, las rebanadas se exponen a estimulaciones prematuras (S2) a intervalos decrecientes al estímulo precedente (S1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de la fuerza de contracción antes y después del tratamiento con agentes que afectan al canal Ca2+ tipo L. Todos los datos (n = 1) se normalizaron a la contractilidad basal (media de cinco latidos separados antes del tratamiento [0]). Los antagonistas del canal Ca2+ de tipo L nifedipino (125 nM), calciseptina (70,8 nM) y el agonista del canal Ca2+ de tipo L Bay-K8644 (417 nM) se añadieron a la contracción de las rebanadas de miocardio del VI humano. La rebanada de control no recibió tratamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Potenciación posterior a la pausa de los cortes tratados y de control. Se observaron diferencias en la potenciación post-pausa (basal vs post-tratamiento; n = 1). Aquí, la amplitud de la primera contracción después de una pausa se normalizó a la amplitud de contracción promedio antes de la pausa respectiva. La línea de base se estableció como 100% y se asemeja a la fuerza de contracción promedio de los últimos cinco ciclos antes de que comience la primera pausa. El eje Y muestra la primera contracción normalizada después de una pausa de varias duraciones. El eje X muestra las longitudes de línea base y pausa. (A) Control de la rebanada sin tratamiento. (B) Tratamiento con calciseptina. (C) Tratamiento Bay-K8644. (D) Tratamiento con nifedipino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Análisis de la relación de frecuencia de fuerza. Los datos de contracción (n = 1) se normalizaron a la fuerza de contracción a 30 BPM dentro del protocolo respectivo (= 100%). A) La rebanada de control no fue tratada con ninguna sustancia; sin embargo, todos los demás aspectos del cultivo eran los mismos que los de las rebanadas tratadas. (B) Tratamiento con calciseptina de una rebanada de miocardio del VI. (C) Tratamiento Bay-K8644. (D) Tratamiento con nifedipino. Se omitieron los datos sobre la fuerza de contracción de esta rebanada durante las frecuencias de estimulación por encima de 80 BPM, ya que la contracción no siguió la frecuencia de estimulación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Composición del tampón de corte utilizado para el transporte y durante el procedimiento de corte. Para la preparación de agarosa, se omite la glucosa. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Composición del gel de agarosa al 4%. Este gel de agarosa de baja fusión libre de glucosa se utiliza para incrustar las muestras de tejido. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 3: Preparación del medio para el cultivo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 4: Detalles del protocolo de estimulación. El protocolo de estimulación consta de cuatro partes, que pueden ser alteradas para adaptarse a las necesidades del proyecto. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
En el pasado, la investigación cardiovascular ha hecho grandes avances en el cultivo de cardiomiocitos. Sin embargo, el cultivo 3D de cardiomiocitos con geometría intacta aún no está bien establecido. En comparación con los protocolos anteriores aplicados para el cultivo ex vivo de tejido miocárdico, el protocolo que describimos aquí se asemeja más al entorno in vivo del tejido. Además, la aplicación de pre y postcarga permite un entorno más biomimético. Somos capaces de analizar y comprender completamente el registro continuo de los datos de contracción y los parámetros de contracción del tejido.
El número de técnicas de cultivo de tejido cardiovascular ex vivo que utilizan configuraciones similares es limitadoa 11,21,22. Una técnica similar para el cultivo de rebanadas de miocardio que se ha publicado utiliza una placa de 6 pocillos para el cultivo de rodajas de miocardio10. Sin embargo, una limitación importante de esta configuración en particular es que las rodajas no están expuestas a la precarga y la poscarga, ni es capaz de producir una vista detallada de la contracción a lo largo del tiempo sin la necesidad de manipular el tejido. El método que describimos aquí reduce el riesgo de daño o infección tisular. Además, ofrece una visión completa de los posibles cambios en la fuerza contráctil cada vez que se agrega una sustancia de interés al cultivo. Además del análisis de la fuerza de contracción normal de cada rebanada, la configuración actual permite ejecutar regularmente protocolos predefinidos. Esto permite la recopilación de datos de diferentes parámetros relevantes del tejido cultivado.
Pasos críticos dentro del protocolo
Se debe evitar el daño tisular, y esto ya puede ocurrir durante la cirugía de explante. Si el tejido no se transfiere inmediatamente a la solución de almacenamiento en frío después de la escisión, esto puede resultar en muestras de tejido dañadas. El protocolo descrito contiene varios pasos que son críticos para obtener resultados confiables y reproducibles. El compuesto de incrustación de tejido de agarosa debe prepararse utilizando el tampón de corte sin glucosa, para evitar una posible caramelización de la glucosa durante el proceso de fusión antes del inicio del protocolo. Es importante evitar daños debidos a la hipertermia causada por el uso de agarosa directamente del baño de agua de 80 ° C, en lugar de incubar la agarosa en una jeringa a 37 ° C. La temperatura debe ser de 4 ° C durante el almacenamiento y el corte para reducir el metabolismo y minimizar la isquemia. Además, el tejido debe manejarse con cuidado, agarrando la agarosa en lugar del tejido en sí, al moverlo entre la bandeja de corte y la placa de Petri para unir los triángulos de plástico. Es de suma importancia que estos triángulos se unan en la dirección adecuada con respecto a la dirección de las fibras miocárdicas. La desalineación de los triángulos resultará en daño tisular.
En general, el umbral de estimulación de las rodajas recién cortadas está entre 10-20 mA, y la corriente debe aumentarse cuidadosamente. La sobreestimulación del tejido por una corriente demasiado alta también puede provocar daños irreversibles en la muestra. Una vez que la estimulación ha comenzado, la agitación del tejido mediante el balanceo de las cámaras de cultivo es necesaria, y nunca debe detenerse por más de 5 minutos para garantizar la disponibilidad adecuada de oxígeno y nutrientes para el tejido.
Solución de problemas y modificaciones
Hipercontractura
La hipercontractura de la muestra de tejido miocárdico es uno de los principales criterios de exclusión para el protocolo discutido. Esto puede ocurrir antes y después de la preparación de las rodajas de miocardio. En los casos en que, antes de la preparación, el tejido se sentía rígido a la palpación, se observó hipercontracción en al menos el 70% de las preparaciones. La hipercontractura de la muestra de tejido también puede ocurrir al insertarse en el balancín, lo que probablemente depende de la calidad del tejido o del estado de enfermedad del paciente. La hipercontractura puede verse como un aumento del tono diastólico durante la estimulación del tejido, correspondiente al acortamiento tónico de los cardiomiocitos dañados en la isquemia cardíaca. La hipercontractura durante la estimulación puede ser progresiva, por lo que la contracción excede el límite de detección de 12 mN. Sin embargo, la hipercontractura también puede revertirse espontáneamente dentro de los 30-60 minutos, lo que sugiere que el tejido puede recuperarse. Para mejorar la recuperación del tejido, los ajustes de precarga deben reajustarse (es decir, repetir el paso 8.3) después de 1 h de incubación, así como en los días 2, 4 y 6 después de la preparación. La hipercontractura puede estar presente con y sin la contracción estimulada de las muestras. Sin embargo, si no se observa contracción dentro de 1 h, no se debe usar la muestra. En este caso, el tejido se ha hipercontraído a un grado del que no puede recuperarse o ha sido dañado de otra manera. En general, el cultivo de rodajas de miocardio humano según el protocolo presentado, ha demostrado tener una tasa de éxito del 90%.
Cambios esperados en la fuerza de contracción
Dependiendo de una multitud de factores (por ejemplo, paciente, preparación, daño tisular), es posible que las mióslices que mostraron una contracción aceptable inicialmente, sufran una disminución progresiva de las amplitudes contráctiles durante las primeras 24 h. De hecho, este comportamiento incluso puede considerarse normal para las rebanadas obtenidas de corazones humanos que fallan en la etapa final. Se ha encontrado que reajustar la precarga de las rodajas cada día durante los siguientes 3 días alivia este problema y mejora la contracción. Sin embargo, después de 24 a 48 h, la contractilidad debería comenzar a aumentar nuevamente. Tenga en cuenta que la contracción no volverá a su nivel observado inicialmente dentro de los primeros días de cultivo.
Poco después del intercambio medio, cuando las muestras se devuelven a la incubadora, la contracción generalmente muestra amplitudes marcadamente aumentadas. La apertura y el cierre de la incubadora contribuyen a este aumento, ya que hace que el nivel de CO2 disminuya. Esto aumenta el pH dentro del medio de cultivo tamponado con bicarbonato, lo que provoca una respuesta inotrópica positiva de las rodajas. Después del intercambio medio, la fuerza contráctil de las rodajas a menudo disminuye durante varias horas hasta que alcanza o supera su valor inicial. Para evitar que los protocolos de estimulación se vean afectados por el intercambio medio, los protocolos de estimulación no deben ejecutarse hasta al menos 1 h después del intercambio medio.
Limitaciones del método
Una ventaja de la técnica actual en comparación con los métodos de cultivo anteriores para el tejido miocárdico humano, es la posibilidad de aplicar (y modular) pre y poscarga al tejido que se contrae. Sin embargo, es difícil cuantificar la carga aplicada en términos de tensión de pared, aunque esta carga podría estimarse a partir de la constante de resorte y las dimensiones de la rebanada. Se supone que existe una relación positiva entre la viabilidad del tejido miocárdico y la amplitud de contracción de la muestra de tejido. Sin embargo, actualmente no existe un método que permita probar la viabilidad de cada rebanada individual antes de montarla en las cámaras. Se puede realizar una tinción colorimétrica de MTT en rodajas cortadas que no se utilizan para el cultivo, para determinar la viabilidad de las células miocárdicas. En las células que son viables, NADPH reducirá la sal amarilla MTT en los cristales de formazano púrpura. Otra limitación es que actualmente, los nutrientes en el medio de cultivo se limitan a ingredientes básicos. Por lo tanto, los nutrientes y los factores circulantes son diferentes del entorno in vivo del que se obtuvo el tejido. Sin embargo, el medio se puede complementar o modificar según sea necesario.
Aplicaciones potenciales del método
Hay varias aplicaciones potenciales del método tanto en términos de cardiotoxicidad y pruebas de drogas, como en la comprensión de la fisiopatología de la enfermedad cardíaca. En primer lugar, el sistema utilizado en el protocolo discutido se puede utilizar para exámenes de detección de medicamentos y cardiotoxicidad. Con la ayuda de los protocolos de estimulación programable, se pueden analizar los cambios fisiológicos en respuesta a la administración de fármacos. En cuanto a la interpretación del período refractario, debe considerarse que se trata de un parámetro funcional, que no refleja estrictamente el efecto de los fármacos sobre la duración potencial de la acción. En segundo lugar, las cámaras de cultivo se pueden utilizar para varios experimentos de cultivo conjunto de miocardio en combinación con células inmunes. Mediante el uso de este cocultivo, se pueden evaluar los efectos directos de los factores secretados por las células inmunes en la contracción miocárdica. Finalmente, también se pueden cultivar muestras de miocardiopatía no trasplantada, aunque estas muestras de tejido no trasplantadas son generalmente más pequeñas y, por lo tanto, más difíciles de procesar. Sin embargo, esto puede abrir posibilidades para la identificación de nuevas dianas terapéuticas y el desarrollo de medicamentos dirigidos. También es concebible utilizar la técnica para la caracterización de tejidos específicos del paciente, acercándonos un paso más a la medicina personalizada. Además, el método presentado se puede utilizar para el tejido miocárdico no humano, ejemplos de los cuales son el cerdo y el conejo. Hay que tener en cuenta que no se puede obtener la alta frecuencia cardíaca fisiológica de los pequeños mamíferos (ratón/rata), ya que el requisito posterior de O2 más alto no se puede satisfacer en las condiciones de cultivo de miocardio utilizando la configuración discutida. Por lo tanto, un entorno casi fisiológico es difícil de imitar en estos casos.
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Disclosures
JH, PS, DM y KL no tienen nada que revelar. AD y TS son accionistas de InVitroSys GmbH, que proporciona el sistema de cultivo Myodish.
Acknowledgments
La investigación fue financiada por las subvenciones DZHK 81Z0600207 (JH, PS y DM) y 81X2600253 (AD y TS).
Los autores desean agradecer a Claudia Fahney, Mei-Ping Wu y Matthias Semisch por su apoyo en la preparación de las configuraciones, así como por el mantenimiento regular del cultivo de tejidos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose Low melting point | Roth | 6351.2 | |
| Bay-K8644 | Cayman Chemical | 19988 | |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) | Sigma | B0753-1kg | |
| CaCl2*H2O | Merck | 2382.1 | |
| Calciseptine | Alomone Labs | SPC-500 | |
| Glucose*H2O | AppliChem | A3730.0500 | |
| H2O | BBraun | 3703452 | |
| HEPES | AppliChem | A1069.0500 | |
| Histoacryl | BBraun | 1050052 | |
| Isopropanol 100% | SAV LP GmbH | UN1219 | |
| ITS-X-supplement | Gibco | 5150056 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| MgCl2*6H2O | AppliChem | A1036.0500 | |
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| NaH2PO4*H2O | Merck | 1.06346.0500 | |
| Nifedipine | Sigma | N7634-1G | |
| Penicillin / streptomycin x100 | Sigma | P0781-100ML | |
| β-Mercaptoethanol | AppliChem | A1108.0100 | |
| Laboratory equipment | |||
| Flow cabinet | Thermo Scientific | KS15 | |
| Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM | BBraun | In-house made combination of cooling and heating solution. | |
| Incubator | Binder | CB240 | |
| MyoDish culture system | InVitroSys GmbH | MyoDish 1 | Myodish cultute system |
| Vibratome | Leica | VT1200s | |
| Water bath 37 degrees | Haake | SWB25 | |
| Water bath 80 degrees | Daglef Patz KG | 7070 | |
| Materials | |||
| 100 mL plastic single-use beaker | Sarstedt | 75.562.105 | |
| Filtration unit, Steritop Quick Release | Millipore | S2GPT05RE | |
| Needles 0.9 x 70 mm 20G | BBraun | 4665791 | |
| Plastic triangles | In-house made | ||
| Razor Derby premium | Derby Tokai | B072HJCFK6 | |
| Razor Gillette Silver Blue | Gillette | 7393560010170 | |
| Scalpel disposable | Feather | 02.001.30.020 | |
| Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit | BBraun | 309110 | |
| Tissue Culture Dish 10 cm | Falcon | 353003 | |
| Tissue Culture Dish 3.5 cm | Falcon | 353001 | |
| Tubes 50 mL | Falcon | 352070 |
References
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