Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

体外 重组巨型单层囊泡内的肌动蛋白细胞骨架

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64026
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

Summary

在这份手稿中，我们展示了将F-肌动蛋白细胞骨架封装到巨大的单层脂质囊泡（也称为脂质体）中的实验技术，以及在脂质体膜的内小叶处形成皮质仿生F-肌动蛋白层的方法。

Abstract

肌动蛋白细胞骨架是细胞中的主要机械机制，介导许多必需的物理细胞活动，包括细胞变形，分裂，迁移和粘附。然而，研究 体内 肌动蛋白网络的动力学和结构由于活细胞内的生化和遗传调控而变得复杂。为了建立一个缺乏细胞内生化调节的最小模型，肌动蛋白被封装在巨大的单层囊泡（GUV，也称为脂质体）中。仿生脂质体是细胞大小的，有助于定量了解细胞骨架网络的机械和动力学特性，为自下而上的合成生物学开辟了一条可行的途径。为了生成用于包封的脂质体，利用倒置乳化法（也称为乳化液转移法），这是将复杂溶液包封到脂质体中以制备各种细胞模拟系统的最成功的技术之一。使用这种方法，将目标蛋白质的混合物添加到内部缓冲液中，然后将其在含磷脂的矿物油溶液中乳化以形成单层脂质液滴。所需的脂质体是由穿过脂质/油水界面的单层脂质液滴产生的。该方法能够将浓缩的肌动蛋白聚合物包封到具有所需脂质组分的脂质体中，为仿生细胞骨架网络的 体外 重建铺平了道路。

Introduction

肌动蛋白细胞骨架通过协调分子水平的收缩性和力产生1，2，3在构建细胞的细胞内结构中起着重要作用。因此，它介导了许多基本的细胞活动，包括细胞变形4，5，分裂6，迁移7，8和粘附9。肌动蛋白网络的体外重建近年来获得了极大的关注10，11，12，13，14，15，16，17。重建的目标是建立一个细胞的最小模型，没有活细胞中存在的复杂生化调节。这为探测特定的细胞内活动提供了可控的环境，并有助于识别和分析肌动蛋白细胞骨架18，19的不同组分。此外，体外肌动蛋白网络在磷脂巨型单层囊泡（GUV，脂质体）内的包封提供了具有半渗透边界的受限但可变形的空间。它模仿细胞内肌动蛋白机制的生理和机械微环境9，20，21，22。

在制备脂质体的各种方法中，脂膜水合法（又称溶胀法）是最早的技术之一，23.干燥的脂质膜通过添加缓冲液进行水合，形成膜状气泡，最终变成囊泡24。为了产生具有较高产量的较大囊泡，从薄膜水合法推进的改进方法，称为电铸法25，施加交流电场以有效地促进水化过程26。这些基于水合的肌动蛋白包封方法的主要局限性在于它对高浓度蛋白质的包封效率低，并且仅与特定的脂质组合物24相容。相比之下，倒置乳液技术对脂质组分的限制较少，蛋白质浓度为20，27，28，29。在该方法中，将用于包封的蛋白质混合物加入到内部水缓冲液中，该缓冲液随后在含脂矿物油溶液中乳化，形成脂质单层液滴。然后，单层脂质液滴通过离心穿过另一个脂质/油水界面，形成双层脂质囊泡（脂质体）。该技术已被证明是肌动蛋白包封24，30的最成功的策略之一。另外，还有一些微流体装置方法，包括脉冲喷射31、32、瞬态膜喷射33和cDICE方法34。倒乳剂法与微流体法之间的相似之处在于所使用的脂质溶剂（油）和脂质/油 - 水界面的引入以形成脂质体的外小叶。相比之下，通过微流体方法产生脂质体需要设置微流体装置，并且伴随着在双层的两个小叶之间捕获的油，这需要额外的步骤来除油35。

在这份手稿中，我们使用倒置乳液技术制备包封聚合的F-肌动蛋白网络的脂质体，如之前22所示。首先将用于包封的蛋白质混合物置于具有非聚合条件的缓冲液中，以维持其球状（G）形式的肌动蛋白。整个过程在4°C下进行，以防止早期肌动蛋白聚合，随后通过允许样品升温至室温而触发。一旦在室温下，肌动蛋白聚合成其丝状（F）形式。可以将各种肌动蛋白结合蛋白添加到内部水缓冲液中以研究蛋白质的功能和性质，从而进一步深入了解其与肌动蛋白网络和膜表面的相互作用。该方法还可应用于包封感兴趣的各种蛋白质36和接近最终脂质体28，37大小的大型物体（微粒、自走式微游泳器等）。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 缓冲液和蛋白质溶液的制备

  1. 通过混合0.1 mM氯化钙2，10 mM HEPES（pH 7.5），1mM DTT，0.5mM达布科，320mM蔗糖和0.2mM ATP，制备总体积为5mL的水性内部非聚合（INP）缓冲液。
  2. 通过在4°C下向INP缓冲液中加入蛋白质来制备蛋白质混合物（PM），浓度如下：11.2μM非荧光G-肌动蛋白，2.8μM荧光标记肌动蛋白和0.24μM Arp2/3（材料表）。为了形成F-肌动蛋白层，向PM中加入100 nM明胶，4μM共纤蛋白和2.2μM VCA-His。作为对照实验，用100μg/mL荧光染料代替PM（材料表）。
  3. 通过混合100 mM氯化物，4mM氯化镁2，10mMHEPES（pH 7.5），1mM DTT，0.5mM Dabco，10 mM ATP和80 mM蔗糖，制备总体积为5mL的水性内部聚合（IP）缓冲液（水溶液）。
  4. 通过将INP缓冲液（含PM）和IP缓冲液以1：1的体积比混合来制备最终缓冲液（FB），以产生总体积为30μL的内部水溶液，该溶液将被封装在脂质体中。
  5. 通过混合10mM HEPES（pH 7.5），50mM氯化物，2mM氯化物2，0.2mM钙氯化物2，2mM ATP，1mM DTT，0.5mM达布科，212mM葡萄糖和0.1mg / mL β酪蛋白，制备总体积为150μL的水性外部缓冲液（OB）。
    注意：OB的渗透压可以用葡萄糖调节，以确保OB的渗透压略大于FB的渗透压（20-60 mOsm）。FB的密度应略高于OB。

2. 基于倒置乳液技术的脂质体的制备

  1. 准备脂质油混合物
    1. 将100微升25毫克/毫升L-α-磷脂酰胆碱（非荧光蛋PC，也称为EPC，包括1%DHPE）加入玻璃小瓶中。用氩气蒸发氯仿，在小瓶底部留下干燥的固体脂质膜（2.5mg）。
      1. 为了形成F-肌动蛋白层，以EPC与DOG-NTA-Ni的10：1比例加入1，2-二油酰基-sn-甘油-3-[n（5-氨基-1-羧戊基）亚氨基二乙酸]琥珀酰}镍盐（DOGS-NTA-Ni）。
    2. 加入2mL矿物油，并在室温下在浴中超声处理脂质油混合物1小时以重新悬浮脂质。
      注意：超声处理后的脂质油混合物可以在4°C下保存1周。 建议在使用前重新超声处理。
  2. 在油（FB / 油）乳液中制备最终缓冲液，用于制备含有目标蛋白质的单层脂质液滴。
    1. 在塑料管中取100μL脂质油混合物，加入10μLFB。确保FB位于一个液滴中。
    2. 使用玻璃注射器，吸取脂质 - 油 - FB混合物，轻轻地上下多次吸出以乳化它;首先抽取少量的脂油混合物，然后将FB液滴的尖端放在液滴的外围，将其分解成微小的液滴。重复上下抽吸，直到形成白色和浑浊的乳液。
  3. 将30μLOB放入单独的塑料管中。将30μL脂质油混合物放在OB的顶部，静置约10分钟以在界面处形成脂质单层。
    注意：如果脂质被充电或蛋白质被掺入，则此步骤的持续时间应延长38。
  4. 准备脂质体
    1. 小心地将50μLFB /油乳液（步骤2.2）添加到步骤2.3开始的管顶部油相中。
    2. 在4°C下以100× g 离心塑料管15分钟。 改变时间和离心速度，以优化脂质体的形成。
      注意：离心后，顶部油相应为透明，底部OB（含脂质体）应略带浑浊。
    3. 用移液管小心地去除油相。如果需要，抽吸额外的容量。确保不要将移液器吸头放在管子的侧面，以避免在脂质体相的顶部产生油的弯月板。
    4. 使用新的移液器，将移液器尖端缓慢地插入剩余的底相，并吸出水体积以收集脂质体。
      注意：减量比加入机油更好。油的夹杂物会导致脂质体破裂，内部成分将被释放到外部缓冲液中。切割移液器的尖端以减少剪切力。

3. 显微镜观察

  1. 将100μLOB倒入培养室（含有12mm圆形盖玻片的4孔板）的孔中。轻轻地将收集的脂质体（步骤2.4.4）沉积到OB中，然后将另一个盖玻片放在腔室的顶部。
    注意：OB含有β酪蛋白，用于钝化玻璃表面并最大限度地减少脂质体之间的粘附20。
  2. 使用63x油浸物镜用共聚焦显微镜观察脂质体。使用488nm，647nm和561nm激光线分别观察荧光标记的脂质，封装的荧光染料和封装的荧光标记的肌动蛋白。捕获感兴趣的帧并以TIFF格式保存图像。
  3. 处理和分析图像J/斐济39 中的图像。对于ImageJ /斐济的新用户，可以使用在线教程（请参阅 材料表）。
    1. 使用图像J /斐济软件打开TIFF文件。
    2. 转到 图像>调整>亮度/对比度。通过调整“ 最小” 和 “最大值 ”设置以及“ 亮度”和“对比度”滑块，将图像的亮度和 对比度 调整到所需的比例。
    3. 单击工具栏中的 矩形 选择工具，然后选择感兴趣区域 （ROI）。转到 图像>裁剪 以裁剪 ROI。
    4. 转到分析>设置比例。在弹出窗口中，在“像素长宽比”字段中输入 1.0，并将 μm 设置为长度单位。在“距离（像素）”字段中，输入图像宽度（以像素为单位）。在已知距离字段中，输入以微米为单位的实际图像宽度。
    5. 要测量脂质体的大小，请使用工具栏中的 椭圆形 选择工具，沿脂质体边缘绘制一个圆圈。转到 分析>测量 以测量圆的面积，从中可以计算出脂质体的直径。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

基于倒置乳液技术的脂质体的制备在 图1中以图形和示意性方式说明。

首先，制备由磷脂（EPC）和荧光脂质（DHPE）组成的空（裸）脂质体（直径约5-50μm）。作为对照实验，一种明亮的远红色荧光染料被封装在裸脂质体中。脂质单层是否在液滴的外周成功形成，可以通过观察在乳液中掺入荧光染料的单层脂质液滴来确定，如图2A所示。成功的脂质体生成可以通过使用共聚焦显微镜在488nm激光下观察薄圆环的可视化来验证，该圆环是绿色荧光脂质双层（脂质与DHPE的偶联）（图2A，最右边的面板）。为了确认荧光染料的封装，由于远红色荧光染料（材料表），脂质体的内部环境应在647nm激光下均匀荧光（图2A;覆盖图像）。

不同形式的包封在单层脂质液滴内的肌动蛋白如图 2B所示。从左到右的图像显示球状肌动蛋白（G-肌动蛋白），丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白），肌动蛋白形成一个薄的F-肌动蛋白层，将VCA-His添加到最终缓冲液中，镍脂添加到膜上，肌动蛋白形成一个薄的F-肌动蛋白层，并将VCA-His，cofilin和明胶添加到最终缓冲液中，镍脂质添加到膜中。

接下来，纯化的G-肌动蛋白和相关的F-肌动蛋白结合蛋白被包封在脂质体中。由与上述相同的膜组分（EPC与DHPE混合）组成，这里的脂质体直径约为5-50μm。脂质体的形成可以通过 图3A，B所示的薄绿色圆环来观察。肌动蛋白聚合通过允许样品升温至室温而触发。如图 3A所示，脂质体内重构的F-肌动蛋白网络（具有20%荧光标记的肌动蛋白）是异质的，表现为肌动蛋白丝的分支网络结构。分支架构是由引入Arp2 / 3复合物触发的，该复合物同时控制肌动蛋白丝的成核和分支，以及VCA-His40，41，42，43，44，45。

最后，创建了一个F-肌动蛋白皮层仿生系统。在脂质体22双层的内小叶中产生了一个薄而密集的F-肌动蛋白层，其可以可视化为荧光壳（图3C）。在这种情况下，此外，VCA-His，科菲林和明胶素被封装到脂质体中。脂质膜的组分中需要镍脂质。VCA-His是一种WASP片段，携带组氨酸标签与脂质膜的镍脂质相互作用。与此同时，它招募了Arp2 /3复合体20，46，47，48。结果，由Arp2 / 3复合物成核的肌动蛋白在cofilin和明胶存在下产生沿膜内层涂覆的F-肌动蛋白层。

Figure 1
图1：基于倒置乳液技术的脂质体的制备。 （A）脂质体制备包括两个步骤。第一步：将携带目标蛋白质的10μL最终缓冲液（FB）液滴以1：10的比例加入到100μL磷脂 - 油混合物中，并通过用玻璃注射器轻轻地上下吸出悬浮。含有单层脂质液滴的溶液在来回抽吸后变白。第二步：在单独的塑料管中，将几微升的脂质油混合物置于相同量的OB的顶部，并静置约10分钟以在OB /油界面处形成脂质单层。将步骤一中的乳液倒在步骤二的油相顶部，并在4°C下离心（100× g; 15分钟）。 离心后，顶部油溶液应清澈，底部OB溶液（含脂质体）应略带浑浊。（B）从倒置乳液制备脂质体的示意图。顶部的白色乳液包含单层脂质液滴，其内部包含分支的肌动蛋白网络。在离心过程中，单层脂质液滴通过OB /油界面形成外部小叶，使得脂质体产生并积聚在塑料管的底部。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图2：单层脂质液滴的微观图像 （A）在乳液中掺入荧光染料的单层脂质液滴。从左到右的图像分别显示了DIC通道，荧光640 nm通道，DIC和640 nm通道以及荧光488 nm通道下的单层脂质液滴。（B）不同形式的包封的肌动蛋白在荧光561nm通道下的单层脂质液滴内。从左到右的图像显示球状肌动蛋白（G-肌动蛋白），丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白），肌动蛋白在最终缓冲液中加入VCA-His并将镍脂质添加到膜中形成薄的F-肌动蛋白层，并且肌动蛋白在最终缓冲液中添加VCA-His，cofilin和明胶以及向膜中添加镍脂脂形成薄的F-肌动蛋白层。比例尺在63倍放大镜下为10μm。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3：脂质体内肌动蛋白网络包封的微观图像 （A）包封聚合支链（Arp 2/3有核）F-肌动蛋白网络的脂质体。从左到右：荧光灯488 nm通道（左），荧光561 nm通道（中），叠加（右）。（B）脂质体悬浮液包封聚合支链（Arp 2/3有核）F-肌动蛋白网络的代表性结果。从左到右：荧光灯488 nm通道（左），荧光561 nm通道（中）和叠加（右）。（C）沿着脂质体的脂质膜内层涂覆的薄而致密的F-肌动蛋白层的外观。从上到下：荧光灯488 nm通道（顶部），荧光灯561 nm通道（中心），叠加（底部）。比例尺在63倍放大镜下为10μm。 请点击此处查看此图的大图。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

几个关键步骤决定了在制备过程中高产量脂质体的成功。为了将脂质膜完全溶解在油中，必须对样品进行超声处理，直到玻璃瓶底部的脂质膜完全消失。超声处理后，脂质油混合物必须在室温下在黑暗条件下储存过夜，以使脂质分子进一步分散29。混合物可以在4°C下储存长达一周。当使用含有目标蛋白质的单层脂质液滴制备FB / 油乳液时，必须通过玻璃注射器轻轻地来回泵送脂质 - 油 - FB混合物以避免引入气泡。在此过程中，一个大液滴在玻璃注射器的尖端被剪切成许多较小的液滴（直径约5-100μm），经过几次重复。该混合物在处理30后必须是白色的。为了检查磷脂的质量，以及脂质单层是否在含有液滴的FB的外围成功形成，在乳液中检查了含有荧光染料的单层脂质液滴，如图 2A所示。为了确保单层脂质液滴在离心过程中通过OB /油界面，并允许OB中收集的脂质体沉降在玻璃表面上，FB的密度应略高于OB。因此，分别选择蔗糖和葡萄糖作为内（FB）和外（OB）水溶液的主要成分。在先前的工作中，葡聚糖用于调节内部水溶液20的密度，其不包括在本方案中。此外，用葡萄糖调节OB的渗透压，使得OB的渗透压略大于FB的渗透压（20-60 mOsm），如上一项工作20，22所报道的那样。大的渗透压差异导致脂质体的收缩（当OB的渗透压大于FB的渗透压时）或破裂（当FB的渗透压大于OB的渗透压时）。使用渗透压计检查缓冲液的渗透压。在实验方案中，在OB中加入β酪蛋白以钝化成像室的塑料管表面和玻璃表面，并最大限度地减少脂质体之间的粘附20，49。矿物油用作油溶液（即脂质溶剂）。其他地方已经报道了不同的脂质溶剂，包括十二烷50，液体石蜡30，角鲨烷51等。因此，不同的离心速度和持续时间用于各种脂质溶剂，因为它们的粘度差异以及它们对脂质体表面张力的影响。对于带电脂质，步骤2.3的持续时间需要延长，因为在单层中，这些带电分子相互排斥，因此需要更多的时间在脂质/油混合物和OB38之间的界面处弥散和组织良好。对于掺入目标蛋白质的脂质，还建议扩展此步骤以确保更好的单层形成52。对于包覆聚合的F-肌动蛋白网络的脂质体的脂质体产量，每个视场（100μm x 100μm）的脂质体数量约为5-10，平均直径为20μm。典型显微镜样品的缩小图像如图 3B所示。在最近的一项研究52中可以找到通过倒置乳液方法产生的脂质体的更多缩小共聚焦图像，其中各种参数（密度差，离心速度/时间，脂质浓度，pH，温度等）已针对脂质体的高产量生产进行了优化。

为了重建F-肌动蛋白网络，必须选择适当浓度的三磷酸腺苷（ATP），二硫代肌醇（DTT），相关盐和pH条件。重构的F-肌动蛋白网络的中间检查点可以通过观察内部包封的肌动蛋白的单层脂质液滴来完成。不同形式的包封在单层脂质液滴内的肌动蛋白如图 2B所示。肌动蛋白聚合发生在>20 mM K + 盐和>0.2 mM Mg2+ 盐中，pH稳定在6.5和8.5之间，如前所述53，54，55。在脂质体成像之前，所有溶液都保存在冰上以防止早期肌动蛋白聚合。在室温下对样品进行成像以触发肌动蛋白聚合。重构的F-肌动蛋白网络的架构主要由Arp2/3复合物的活性调节。Arp 2/3复合核和分支肌动蛋白丝从现有母丝的一侧产生树突结构56，57。镍脂（狗-NTA-Ni）和VCA-His对于F-肌动蛋白层的形成至关重要。VCA-His作为成核促进因子，其与膜22，58处的镍脂质有关。然后，从VCA-His中成核的分支F-肌动蛋白网络促进Arp2 / 3复合物，结果，在脂质膜的内小叶处形成致密的F-肌动蛋白壳。脂质体中VCA-His的浓度决定了F-肌动蛋白层的厚度。肌动蛋白调节蛋白（cofilin和凝胶素）的添加也促进了F-肌动蛋白层的形成。cofilin切断肌动蛋白丝以增加丝末端的数量，而凝胶素与肌动蛋白丝的倒钩末端结合以限制其生长。因此，在cofilin和明胶素的存在下，更多的细丝可以被Arp2 / 3成核，然后被VCA-His招募以形成F-肌动蛋白层。

基于乳液转运法进行蛋白质包封的类似论文近年来已于28、30、34发表。这里的方案与这些论文中的方案之间的一个主要区别是脂质体的主要脂质的选择。在这项工作中，我们使用L-α-磷脂酰胆碱（EPC，含有约60%POPC59的不同磷脂酰胆碱物种的混合物）作为脂质体膜的主要成分。为了形成F-肌动蛋白层，以10：1的比例使用EPC和镍脂（DOGS-NTA-Ni）的混合物。在之前的一项研究中，将脂质体铺展在多组氨酸包被的玻璃上，EPC、胆固醇和镍脂以53：37：10的比例混合20。相比之下，Natsume等人和Bashirzadeh等人分别选择了二油酰基磷胆碱（DOPC，一种单一类型的磷脂）来封装微球28和筋素-肌动蛋白束34，而藤井等人推荐1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷胆碱（POPC，一种纯合成磷脂）作为初级脂质，以建立基于脂质体的膜蛋白合成技术30.初级脂质的选择会影响脂质体的物理性质。例如，随着酰基链的不饱和度增加（即，POPC60），通过双层的各种分子的渗透性降低61。选择还取决于混合感兴趣的脂质。例如，胆固醇的添加使EPC脂质体更稳定，同时破坏DOPC / DOPE混合物61的双层结构。

这项工作与Bashirzadeh等人最近的出版物34之间的相似之处落在肌动蛋白包封的同一主题上。同时，也有明显的区别。巴希尔扎德等人报告了一种利用3D打印旋转室的改良cDICE方法。在这里，我们采用简单，传统的倒置乳液转移方法，使用注射器和离心机。这两种方法都能产生高产量的脂质体，并且对于大型生物分子24具有高包封效率。除了如上所述的脂质组分的差异外，封装的肌动蛋白网络的结构也会改变。Bashirzadeh等人将嗜酸 -肌动蛋白束封装在脂质体中，而在这项工作中，我们封装了由Arp2 /3复合物触发的分支网络。此外，这里已经详细阐述了F-肌动蛋白层的形成，以在VCA-His存在下创建皮层仿生系统。

此处报告的方法有两个限制。一个是结合 体外 重构肌动蛋白网络的脂质体的大小不能精确操纵（直径从5到50μm不等），并且与电合成方法相比，产率较低。水油基方法的另一个局限性是微量的油被困在双层传单24之间。尽管不显著影响这些生物模拟脂质体的膜厚度或生物相容性24、35、62、63，但油插入的脂质体的膜动力学可以被改变62。在这种方法中，加入肌动蛋白核因子Arp2/3。未来的研究可能包括其他细胞骨架蛋白64，65，66，67，核细胞，如formin68，或分子马达如肌球蛋白II69。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者声明没有利益冲突。

Acknowledgments

我们感谢向美国国立卫生研究院（NIH）提供 ARO MURI W911NF-1-0403 至 M.P.M.、美国国立卫生研究院 （NIH） R01 1R01GM126256、美国国立卫生研究院 （NIH） U54 CA209992、NIH RO1 GM126256、NIH U54 CA209992、密歇根大学/基因工程学院、SUBK00016255 和人类前沿科学计划 （HFSP） 拨款编号 RGY0073/2018 至 M.P.M.本材料中表达的任何意见，发现，结论或建议均为作者的观点，并不一定反映ARO，NIH或HFSP的观点。S.C.承认与V.亚达夫，C.穆雷桑和S.阿米里进行了富有成效的讨论。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)  Avanti Polar Lipids Inc. 231615773 Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802-25G DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AKL99-D non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AR05 fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383-10G ATP
Alexa Fluor 647 dye ThermoFisher fluorescent dye
Andor iQ3 Andor Technologies control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain Cytoskeleton, Inc RP01P-A Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate Sigma 10035048 CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) Quorum Technologies incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant Cytoskeleton, Inc CF01-C cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) Andor Technologies LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA Sigma G7528 glucose
Dithiothreitol DOT Scientific  DSD11000-10 DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant Cytoskeleton, Inc HPG6 gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip Cole-Parmer UX-07940-53 glass syringe
HEPES AmericanBio 7365-45-9
ImageJ/Fiji https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids Inc. 97281442 EPC
Magnesium chloride Sigma 7786303 MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil Sigma 8042475 mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) Thermo Fisher O12650 DHPE
Potassium chloride Sigma 7447407 KCl
Sucrose Sigma 57-50-1 sucrose
β-Casein from bovine milk Sigma C6905-250MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
  2. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  3. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  4. Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103 (2022).
  5. Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
  6. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  7. Bray, D., White, J. Cortical flow in animal cells. Science. 239 (4842), 883-888 (1988).
  8. Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
  9. Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
  10. Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
  11. Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  12. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  13. McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
  14. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nature Materials. 10 (6), 462-468 (2011).
  15. Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
  16. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  17. Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745 (2021).
  18. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  19. Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
  20. Murrell, M., et al. Spreading dynamics of biomimetic actin cortices. Biophysical Journal. 100 (6), 1400-1409 (2011).
  21. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nature Physics. 4 (10), 789-793 (2008).
  22. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  23. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  24. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
  25. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  26. Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103 (2002).
  27. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  28. Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282 (2017).
  29. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
  30. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  31. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  32. Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
  33. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  34. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  35. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  36. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  37. Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
  38. Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. Methods in Cell Biology. 128, Elsevier. 271-285 (2015).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
  41. Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
  42. Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
  43. Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
  44. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
  45. Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
  46. Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
  47. Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
  48. Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245 (2020).
  49. Schäfer, E., Kliesch, T. -T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
  50. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  51. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  52. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  53. Vale, R. Reconstituting the Cytoskeleton. , Academic Press. (2014).
  54. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Mechanism of K+-induced actin assembly. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 648-654 (1982).
  55. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 27 (20), 7766-7772 (1988).
  56. Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
  57. Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
  58. Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
  59. Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
  60. Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
  61. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
  62. Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  63. Deng, N. -N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. Monodisperse uni-and multicompartment liposomes. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  64. Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
  65. Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
  66. Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
  67. Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
  68. Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243 (2019).
  69. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Methods in Enzymology. 540, Elsevier. 265-282 (2014).

Tags

生物工程，第186期，
<em>体外</em> 重组巨型单层囊泡内的肌动蛋白细胞骨架
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. … More

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (186), e64026, doi:10.3791/64026 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter