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Bioengineering

In vitro Ricostituzione del citoscheletro di actina all'interno di vescicole unilamellari giganti

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64026
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

Summary

In questo manoscritto, dimostriamo le tecniche sperimentali per incapsulare il citoscheletro F-actina in vescicole lipidiche unilamellari giganti (chiamate anche liposomi) e il metodo per formare uno strato di F-actina che imita la corteccia nel foglietto interno della membrana liposomiale.

Abstract

Il citoscheletro di actina, il principale macchinario meccanico nella cellula, media numerose attività fisiche cellulari essenziali, tra cui la deformazione, la divisione, la migrazione e l'adesione cellulare. Tuttavia, lo studio della dinamica e della struttura della rete di actina in vivo è complicato dalla regolazione biochimica e genetica all'interno delle cellule vive. Per costruire un modello minimale privo di regolazione biochimica intracellulare, l'actina viene incapsulata all'interno di vescicole unilamellari giganti (GUV, chiamate anche liposomi). I liposomi biomimetici sono di dimensioni cellulari e facilitano una comprensione quantitativa delle proprietà meccaniche e dinamiche della rete del citoscheletro, aprendo una strada praticabile per la biologia sintetica bottom-up. Per generare liposomi per l'incapsulamento, viene utilizzato il metodo dell'emulsione invertita (noto anche come metodo di trasferimento dell'emulsione), che è una delle tecniche di maggior successo per incapsulare soluzioni complesse in liposomi per preparare vari sistemi di imitazione cellulare. Con questo metodo, una miscela di proteine di interesse viene aggiunta al tampone interno, che viene successivamente emulsionato in una soluzione di olio minerale contenente fosfolipidi per formare goccioline lipidiche monostrato. I liposomi desiderati sono generati da goccioline lipidiche monostrato che attraversano un'interfaccia lipide/olio-acqua. Questo metodo consente l'incapsulamento di polimeri di actina concentrati nei liposomi con i componenti lipidici desiderati, aprendo la strada alla ricostituzione in vitro di una rete di citoscheletri biomima.

Introduction

Il citoscheletro di actina svolge un ruolo fondamentale nella costruzione dell'architettura intracellulare della cellula coordinando la contrattilità a livello molecolare e la generazione di forza 1,2,3. Di conseguenza, media numerose attività cellulari essenziali, tra cui la deformazione cellulare4,5, la divisione6, la migrazione 7,8 e l'adesione9. La ricostituzione in vitro delle reti di actina ha guadagnato enorme attenzione negli ultimi anni 10,11,12,13,14,15,16,17. L'obiettivo della ricostituzione è quello di costruire un modello minimo della cellula privo della complessa regolazione biochimica che esiste all'interno delle cellule vive. Ciò offre un ambiente controllabile per sondare specifiche attività intracellulari e facilita l'identificazione e l'analisi di diversi componenti del citoscheletro di actina18,19. Inoltre, l'incapsulamento di reti di actina in vitro all'interno di vescicole unilamellari giganti fosfolipidi (GUV, liposomi) fornisce uno spazio confinato ma deformabile con un confine semipermeabile. Imita il microambiente fisiologico e meccanico del macchinario dell'actina all'interno della cellula 9,20,21,22.

Tra i vari metodi per preparare i liposomi, il metodo di idratazione del film lipidico (noto anche come metodo del gonfiore) è una delle prime tecniche23. Il film lipidico secco idrata con l'aggiunta di tamponi, formando bolle membranose che alla fine diventano vescicole24. Per produrre vescicole più grandi con una resa più elevata, un metodo migliorato che avanza dal metodo di idratazione del film, noto come metodo di elettroformazione25, applica un campo elettrico CA per promuovere in modo efficiente il processo di idratazione26. I principali limiti di questi metodi basati sull'idratazione per l'incapsulamento di actina sono che ha una bassa efficienza di incapsulamento di proteine altamente concentrate ed è compatibile solo con specifiche composizioni lipidiche24. La tecnica dell'emulsione invertita, in confronto, ha meno limitazioni per i componenti lipidici e le concentrazioni proteiche20,27,28,29. In questo metodo, una miscela di proteine per l'incapsulamento viene aggiunta al tampone acquoso interno, che viene successivamente emulsionato in una soluzione di olio minerale contenente lipidi, formando goccioline monostrato lipidiche. Le goccioline lipidiche monostrato attraversano quindi un'altra interfaccia lipide/olio-acqua attraverso la centrifugazione per formare vescicole lipidiche a doppio strato (liposomi). Questa tecnica ha dimostrato di essere una delle strategie di maggior successo per l'incapsulamento di actina24,30. Separatamente, ci sono alcuni metodi di dispositivi microfluidici, tra cui il getto pulsato 31,32, l'espulsione transitoria della membrana33 e il metodo cDICE34. Le somiglianze tra il metodo dell'emulsione invertita e il metodo microfluidico sono il solvente lipidico (olio) utilizzato e l'introduzione dell'interfaccia lipide/olio-acqua per la formazione del foglietto esterno dei liposomi. Al contrario, la generazione di liposomi con il metodo microfluidico richiede una messa a punto di dispositivi microfluidici ed è accompagnata da olio intrappolato tra i due lembi del doppio strato, che richiede un passaggio supplementare per la rimozione dell'olio35.

In questo manoscritto, abbiamo usato la tecnica dell'emulsione invertita per preparare liposomi che incapsulano una rete polimerizzata F-actina come usato in precedenza22. La miscela proteica per l'incapsulamento è stata prima posta in un tampone con condizioni non polimerizzanti per mantenere l'actina nella sua forma globulare (G). L'intero processo è stato eseguito a 4 °C per prevenire la polimerizzazione precoce dell'actina, che è stata successivamente innescata consentendo al campione di riscaldarsi a temperatura ambiente. Una volta a temperatura ambiente, l'actina polimerizza nella sua forma filamentosa (F). Una varietà di proteine leganti l'actina può essere aggiunta alla soluzione tampone acquosa interna per studiare le funzionalità e le proprietà delle proteine, fornendo così ulteriori informazioni sulla sua interazione con la rete di actina e la superficie della membrana. Questo metodo può essere applicato anche all'incapsulamento di varie proteine di interesse36 e oggetti di grandi dimensioni (microparticelle, micronuotatori semoventi, ecc.) vicini alla dimensione dei liposomi finali 28,37.

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Protocol

1. Preparazione di tamponi e soluzioni proteiche

  1. Preparare il tampone acquoso interno di non polimerizzazione (INP) in un volume totale di 5 mL miscelando 0,1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM saccarosio e0,2 mM ATP.
  2. Preparare il mix proteico (PM) aggiungendo proteine al tampone INP a 4 °C con le seguenti concentrazioni: 11,2 μM di G-actina non fluorescente, 2,8 μM di actina marcata con fluorescenza e 0,24 μM di Arp2/3 (Tabella dei materiali). Per formare uno strato di F-actina, aggiungere 100 nM gelsolina, 4 μM cofilina e 2,2 μM VCA-His al PM. Come esperimento di controllo, sostituire il PM con un colorante fluorescente da 100 μg/mL (Tabella dei materiali).
  3. Preparare il tampone acquoso di polimerizzazione interna (IP) (acquoso) in un volume totale di 5 mL miscelando 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP e 80 mM saccarosio.
  4. Preparare il tampone finale (FB) mescolando tampone INP (contenente PM) e tampone IP con un rapporto di volume di 1:1 per ottenere la soluzione acquosa interna in un volume totale di 30 μL che sarà incapsulato all'interno del liposoma.
  5. Preparare il tampone esterno acquoso (OB) in un volume totale di 150 μL miscelando 10 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KCl, 2mM MgCl 2, 0,2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM glucosio e 0,1 mg/ml β-caseina.
    NOTA: L'osmolarità dell'OB può essere regolata con glucosio per garantire che la pressione osmotica dell'OB sia leggermente maggiore di quella dell'FB (20-60 mOsm). La densità dell'FB dovrebbe essere leggermente superiore all'OB.

2. Preparazione di liposomi basati sulle tecniche di emulsione invertita

  1. Preparare la miscela di lipidi e oli
    1. Aggiungere 100 μL di 25 mg/mL di L-α-fosfatidilcolina (PC uovo non fluorescente, chiamato anche EPC, incluso l'1% di DHPE) in un flaconcino di vetro. Far evaporare il cloroformio con gas argon, lasciando un film lipidico solido secco (2,5 mg) sul fondo del flaconcino.
      1. Per formare uno strato di F-actina, aggiungere 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-{[n(5-ammino-1-carbossipentil) acido iminodiacetico] succinil} sale di nichel} (DOGS-NTA-Ni) in un rapporto 10:1 di EPC e DOGS-NTA-Ni e mescolare prima dell'evaporazione del cloroformio.
    2. Aggiungere 2 ml di olio minerale e sonicare la miscela di olio lipidico a temperatura ambiente in un bagno per 1 ora per risospendere i lipidi.
      NOTA: La miscela di olio lipidico dopo sonicazione può essere conservata per 1 settimana a 4 °C. La resonicazione è consigliata prima dell'uso.
  2. Preparare un'emulsione Final Buffer in olio (FB/olio) per la preparazione di goccioline lipidiche monostrato contenenti la proteina di interesse.
    1. A 100 μL di miscela di lipidi-olio presa in un tubo di plastica, aggiungere 10 μL di FB. Assicurati che FB sia in una goccia.
    2. Utilizzando una siringa di vetro, aspirare la miscela lipidi-olio-FB e aspirare delicatamente su e giù più volte per emulsionarla; aspirare prima una piccola quantità di miscela di olio lipidico e poi la goccia FB posizionando la punta della siringa alla periferia della goccia per scomporla in minuscole goccioline. Ripetere l'aspirazione su e giù fino a formare un'emulsione biancastra e torbida.
  3. Mettere 30 μL di OB in un tubo di plastica separato. Posizionare 30 μL della miscela di olio lipidico sopra OB e lasciarlo riposare per ~ 10 minuti per sviluppare un monostrato lipidico all'interfaccia.
    NOTA: Se i lipidi sono carichi o la proteina è incorporata, la durata di questo passaggio deve essere estesa38.
  4. Preparare i liposomi
    1. Aggiungere con cautela 50 μL di emulsione FB/olio (punto 2.2) alla fase superiore dell'olio del tubo dal punto 2.3.
    2. Centrifugare il tubo di plastica a 100 x g per 15 minuti a 4 °C. Variare il tempo e la velocità di centrifugazione per ottimizzare la formazione dei liposomi.
      NOTA: Dopo la centrifugazione, la fase superiore dell'olio dovrebbe essere chiara e l'OB inferiore (contenente liposomi) dovrebbe essere leggermente torbido.
    3. Rimuovere con cautela la fase dell'olio con la pipetta. Aspirare un volume extra se necessario. Assicurarsi di non mettere la punta della pipetta sul lato del tubo per evitare di creare un menisco di olio sopra la fase liposomica.
    4. Con una nuova pipetta, inserire lentamente la punta della pipetta nella fase inferiore rimanente e aspirare il volume acquoso per raccogliere i liposomi.
      NOTA: È meglio perdere volume che incorporare l'olio. L'inclusione di olio causerà la rottura dei liposomi e i componenti interni verranno rilasciati nel tampone esterno. Tagliare la punta di una pipetta per ridurre il taglio.

3. Osservazione al microscopio

  1. Versare 100 μL di OB nel pozzetto di una camera di incubazione (piastra a 4 pozzetti contenente vetrini rotondi da 12 mm). Depositare delicatamente i liposomi raccolti (punto 2.4.4) in OB, quindi posizionare un altro vetrino di copertura sulla parte superiore della camera.
    NOTA: L'OB contiene la β-caseina per passivare la superficie del vetro e ridurre al minimo l'attaccamento tra i liposomi20.
  2. Osservare i liposomi con un microscopio confocale utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 63x. Utilizzare linee laser a 488 nm, 647 nm e 561 nm per osservare rispettivamente lipidi marcati con fluorescenza, coloranti fluorescenti incapsulati e actina marcata fluorescentmente incapsulata. Cattura i fotogrammi di interesse e salva le immagini in formato TIFF.
  3. Elaborare e analizzare le immagini in ImageJ/Fiji39. Per i nuovi utenti di ImageJ/Fiji, è disponibile un tutorial online (vedi Tabella dei materiali).
    1. Aprire il file TIFF utilizzando il software ImageJ/Fiji.
    2. Vai a Immagine > regola > luminosità/contrasto. Regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine sulla scala desiderata regolando le impostazioni Minimo e Massimo e i cursori Luminosità e Contrasto .
    3. Fare clic sullo strumento di selezione del rettangolo nella barra degli strumenti e selezionare la regione di interesse (ROI). Vai a Immagine > Ritaglia per ritagliare il ROI.
    4. Vai ad Analizzare > impostare la scala. Nella finestra pop-up, inserisci 1.0 nel campo Proporzioni pixel e imposta μm come unità di lunghezza. Nel campo Distanza in pixel, immettere la larghezza dell'immagine in pixel . Nel campo Distanza nota , inserisci la larghezza reale dell'immagine in micron.
    5. Per misurare la dimensione del liposoma, utilizzando lo strumento di selezione ovale nella barra degli strumenti, disegnare un cerchio lungo il bordo del liposoma. Vai su Analizza > misura per misurare l'area del cerchio, da cui è possibile calcolare il diametro del liposoma.

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Representative Results

La preparazione dei liposomi basata sulla tecnica dell'emulsione invertita è illustrata graficamente e schematicamente nella Figura 1.

In primo luogo, sono stati preparati liposomi vuoti (~ 5-50 μm di diametro) composti da fosfolipidi (EPC) e lipidi fluorescenti (DHPE). Un colorante fluorescente brillante e rosso lontano è stato incapsulato all'interno di liposomi nudi come esperimento di controllo. Se un monostrato lipidico si è formato con successo nella periferica della goccia potrebbe essere determinato osservando goccioline lipidiche monostrato che incorporano colorante fluorescente nell'emulsione, come mostrato nella Figura 2A. Il successo della generazione di liposomi potrebbe essere verificato attraverso la visualizzazione del sottile anello circolare, che è il doppio strato lipidico verde-fluorescente (coniugazione dei lipidi con DHPE), sotto laser a 488 nm utilizzando la microscopia confocale (Figura 2A, pannello più a destra). Per confermare l'incapsulamento del colorante fluorescente, l'ambiente interno dei liposomi dovrebbe essere uniformemente fluorescente sotto un laser a 647 nm (Figura 2A; immagine sovrapposta) a causa del colorante fluorescente rosso lontano (Tabella dei materiali).

Diverse forme di actina incapsulata all'interno della goccia lipidica monostrato sono mostrate nella Figura 2B. Le immagini da sinistra a destra mostrano actina globulare (G-actina), actina filamentosa (F-actina), actina che forma un sottile strato di F-actina con l'aggiunta di VCA-His al tampone finale e nichel-lipide alla membrana, e actina che forma un sottile strato di F-actina con l'aggiunta di VCA-His, cofilina e gelsolina al tampone finale e Nichel-lipide alla membrana.

Successivamente, la G-actina purificata e le proteine leganti la F-actina associate sono state incapsulate all'interno del liposoma. Composto dagli stessi componenti della membrana di cui sopra (EPC mescolato con DHPE), i liposomi qui avevano ~ 5-50 μm di diametro. La formazione di liposomi potrebbe essere visualizzata dai sottili anelli circolari verdi mostrati in Figura 3A,B. La polimerizzazione dell'actina è stata innescata consentendo al campione di riscaldarsi a temperatura ambiente. Come mostrato nella Figura 3A, le reti F-actina ricostituite (con il 20% di actina marcata con fluorescenza) all'interno dei liposomi sono eterogenee, manifestandosi come strutture di rete ramificate di filamenti di actina. L'architettura ramificata è stata innescata dall'introduzione del complesso Arp2/3, che controlla simultaneamente la nucleazione e la ramificazione dei filamenti di actina, insieme a VCA-His 40,41,42,43,44,45.

Infine, è stato creato un sistema di bioimitazione della corteccia F-actina. Uno strato di F-actina sottile, ma densamente ramificato, è stato creato nel foglietto interno del doppio strato di liposomi22, che potrebbe essere visualizzato come un guscio fluorescente (Figura 3C). In questo caso, inoltre, VCA-His, cofilina e gelsolina sono stati incapsulati in liposomi. I lipidi di nichel erano richiesti nel componente della membrana lipidica. VCA-His, un frammento WASP, trasporta un tag istidina in interazione con i lipidi di nichel della membrana lipidica. Nel frattempo, recluta il complesso Arp2/3 20,46,47,48. Di conseguenza, l'actina nucleata dal complesso Arp2/3 genera uno strato di F-actina rivestito lungo lo strato interno della membrana in presenza di cofilina e gelsolina.

Figure 1
Figura 1: Preparazione di liposomi basata sulla tecnica dell'emulsione invertita. (A) La preparazione del liposoma consiste in due fasi. Fase uno: una goccia di 10 μL di tampone finale (FB) contenente proteine di interesse è stata aggiunta a 100 μL della miscela fosfolipidi-olio in un rapporto di 1:10 e sospesa aspirando delicatamente su e giù con una siringa di vetro. Le soluzioni contenenti goccioline lipidiche monostrato sono diventate biancastre dopo l'aspirazione avanti e indietro. Fase due: In un tubo di plastica separato, alcuni microlitri della miscela di olio lipidico sono stati posti sopra la stessa quantità di OB e lasciati riposare per ~ 10 minuti per sviluppare un monostrato lipidico all'interfaccia OB / olio. L'emulsione della fase uno è stata versata sopra la fase oleosa dalla fase due ed è stata centrifugata (100 x g; 15 minuti) a 4 °C. Dopo la centrifugazione, la soluzione di olio superiore deve essere limpida e la soluzione OB inferiore (contenente liposomi) deve essere leggermente torbida. (B) Schemi della preparazione liposomica da un'emulsione invertita. L'emulsione biancastra sulla parte superiore conteneva goccioline lipidiche monostrato che incorporavano una rete di actina ramificata all'interno. Durante la centrifugazione, le goccioline lipidiche monostrato passavano attraverso l'interfaccia OB/olio per formare un foglietto esterno in modo tale che i liposomi fossero creati e accumulati sul fondo del tubo di plastica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagini microscopiche della goccia lipidica monostrato. (A) La goccia lipidica monostrato che incorpora colorante fluorescente nell'emulsione. Le immagini da sinistra a destra mostrano una goccia lipidica monostrato sotto il canale DIC, un canale fluorescente a 640 nm, una sovrapposizione del canale DIC e 640 nm e un canale fluorescente a 488 nm, rispettivamente. (B) Diverse forme di actina incapsulata all'interno della goccia lipidica monostrato sotto un canale fluorescente a 561 nm. Le immagini da sinistra a destra mostrano actina globulare (G-actina), actina filamentosa (F-actina), actina che forma un sottile strato di F-actina con l'aggiunta di VCA-His al tampone finale e nichel-lipide alla membrana, e actina che forma un sottile strato di F-actina con l'aggiunta di VCA-His, cofilina e gelsolina al tampone finale e nichel-lipide alla membrana. Le barre della scala sono 10 μm con un ingrandimento di 63x. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Immagini microscopiche dell'incapsulamento di reti di actina all'interno di liposomi. (A) Una rete di F-actina ramificata polimerizzata polimerizzata incapsulante liposomica (Arp 2/3 nucleata). Da sinistra a destra: canale fluorescente 488 nm (sinistra), canale fluorescente 561 nm (centro), sovrapposizione (destra). (B) Un risultato rappresentativo di sospensioni di liposomi che incapsulano reti di F-actina ramificate polimerizzate (Arp 2/3 nucleate). Da sinistra a destra: canale fluorescente a 488 nm (sinistra), canale fluorescente a 561 nm (al centro) e sovrapposizione (destra). (C) La comparsa della formazione di uno strato sottile ma denso di F-actina rivestito lungo lo strato interno della membrana lipidica di un liposoma. Dall'alto verso il basso: canale fluorescente 488 nm (in alto), canale fluorescente 561 nm (al centro), sovrapposizione (in basso). Le barre della scala sono 10 μm con un ingrandimento di 63x. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Diversi passaggi chiave determinano il successo di un'alta resa di liposomi durante il processo di preparazione. Per sciogliere completamente il film lipidico nell'olio, il campione deve essere sonicato fino a quando il film lipidico sul fondo della fiala di vetro scompare completamente. Dopo la sonicazione, la miscela di olio lipidico deve essere conservata durante la notte a temperatura ambiente in condizioni di oscurità affinché le molecole lipidiche si disperdano ulteriormente29. La miscela può essere conservata a 4 °C per un massimo di una settimana. Quando si prepara un'emulsione FB/olio con goccioline lipidiche monostrato contenenti proteine di interesse, la miscela lipidi-olio-FB deve essere delicatamente pompata avanti e indietro attraverso una siringa di vetro per evitare l'introduzione di bolle d'aria. Durante questo processo, una grande goccia viene tagliata sulla punta della siringa di vetro in molte goccioline più piccole (~ 5-100 μm di diametro) dopo diverse ripetizioni. La miscela deve essere biancastra dopo il processo30. Per verificare la qualità dei fosfolipidi e se un monostrato lipidico si fosse formato con successo nella periferica della gocciolina contenente FB, nell'emulsione sono state esaminate goccioline lipidiche monostrato contenenti colorante fluorescente, come mostrato nella Figura 2A. Per garantire il passaggio delle goccioline lipidiche monostrato attraverso l'interfaccia OB/olio durante la centrifugazione e consentire ai liposomi raccolti in OB di depositarsi sulla superficie del vetro, la densità di FB dovrebbe essere leggermente superiore all'OB. Pertanto, il saccarosio e il glucosio sono stati scelti come componente principale delle soluzioni acquose interne (FB) ed esterne (OB), rispettivamente. Nel lavoro precedente, il destrano è stato utilizzato per regolare la densità della soluzione acquosa interna20, che non è inclusa in questo protocollo. Inoltre, l'osmolarità dell'OB è stata regolata con glucosio in modo tale che la pressione osmotica dell'OB sia leggermente maggiore di quella di FB (20-60 mOsm) come riportato nel precedente lavoro20,22. La grande differenza di osmolarità ha portato al restringimento (quando l'osmolarità dell'OB è maggiore di quella di FB) o alla rottura (quando l'osmolarità della FB è maggiore di quella dell'OB) dei liposomi. Un osmometro è stato utilizzato per controllare le osmolarità dei tamponi. Nel protocollo, la β-caseina è stata aggiunta nell'OB per passivare sia le superfici dei tubi di plastica che le superfici vetrate della camera di imaging e ridurre al minimo l'attaccamento tra i liposomi20,49. L'olio minerale è stato usato come soluzione oleosa (cioè il solvente lipidico). Diversi solventi lipidici sono stati segnalati altrove, tra cui dodecano 50, paraffina liquida30, squalano51, ecc. Di conseguenza, vengono utilizzate diverse velocità e durate di centrifugazione per vari solventi lipidici a causa delle loro differenze di viscosità e dell'influenza che portano sulla tensione superficiale dei liposomi. La durata della fase 2.3 deve essere estesa per i lipidi carichi perché, nel monostrato, queste molecole cariche si respingono a vicenda, richiedendo quindi più tempo per diffondersi e organizzarsi bene all'interfaccia tra la miscela lipidi/olio e OB38. Per i lipidi incorporati con proteine di interesse, si raccomanda anche un'estensione di questo passaggio per garantire una migliore formazione monostrato52. Per la resa liposomiale di liposomi che incapsulano la rete F-actina polimerizzata, il numero di liposomi per campo visivo (100 μm x 100 μm) è di circa 5-10 con un diametro medio di 20 μm. Un'immagine ridotta di un tipico campione di microscopia è mostrata nella Figura 3B. Immagini confocali più ingrandite dei liposomi prodotti attraverso il metodo dell'emulsione invertita possono essere trovate in un recente studio52 in cui vari parametri (differenza di densità, velocità / tempo di centrifugazione, concentrazione lipidica, pH, temperatura, ecc.) sono stati ottimizzati per la produzione ad alto rendimento di liposomi.

Per la ricostituzione della rete F-actina, è essenziale scegliere una concentrazione appropriata di adenosina trifosfato (ATP), ditiotreitolo (DTT), i sali associati e la condizione di pH. Un checkpoint intermedio della rete F-actina ricostituita può essere fatto osservando goccioline lipidiche monostrato con actina incapsulata all'interno. Diverse forme di actina incapsulata all'interno della goccia lipidica monostrato sono mostrate nella Figura 2B. La polimerizzazione dell'actina avviene a >20 mM di sale K+ e in sale >0,2 mM Mg2+ con pH stabilizzato tra 6,5 e 8,5, come riportato in precedenza53,54,55. Prima dell'imaging dei liposomi, tutte le soluzioni venivano mantenute sul ghiaccio per prevenire la polimerizzazione precoce dell'actina. I campioni sono stati ripresi a temperatura ambiente per innescare la polimerizzazione dell'actina. L'architettura della rete ricostituita F-actina è regolata prevalentemente dall'attività del complesso Arp2/3. Il complesso Arp 2/3 nuclea e ramifica filamenti di actina dal lato di un filamento madre esistente per generare architetture dendritiche56,57. Il nichel-lipide (DOGS-NTA-Ni) e il VCA-His sono fondamentali per la formazione dello strato di F-actina. VCA-His serve come fattore promotore della nucleazione, che è legato ai lipidi di nichel alla membrana22,58. Una rete di F-actina ramificata viene quindi nucleata da VCA-His facilitando il complesso Arp2/3 e, di conseguenza, si forma un denso guscio di F-actina nel foglietto interno della membrana lipidica. La concentrazione di VCA-His all'interno del liposoma determina lo spessore dello strato di F-actina. L'aggiunta delle proteine regolatrici dell'actina (cofilina e gelsolina) promuove anche la formazione dello strato F-actina. Il cofilin recide i filamenti di actina per aumentare il numero di estremità del filamento, mentre il gelsolin si lega alle estremità spinate dei filamenti di actina per limitarne la crescita. In tal modo, in presenza di cofilina e gelsolina, un numero maggiore di filamenti può essere nucleato da Arp2/3, e quindi reclutato da VCA-His per formare lo strato di F-actina.

Articoli simili basati sul metodo di trasferimento dell'emulsione per l'incapsulamento proteico sono stati pubblicati negli ultimi anni 28,30,34. Una grande differenza tra il protocollo qui e i protocolli in questi documenti è la scelta del lipide primario per i liposomi. In questo lavoro, utilizziamo la L-α-fosfatidilcolina (EPC, una miscela di diverse specie di fosfatidilcolina contenente circa il 60% di POPC59) come componente principale della membrana liposomiale. Per formare uno strato di F-actina, è stata utilizzata una miscela di EPC e nichel-lipide (DOGS-NTA-Ni) con un rapporto di 10:1. In un lavoro precedente, i liposomi sono stati sparsi su vetro rivestito di poliistidina e EPC, colesterolo e nichel-lipidi sono stati miscelati con un rapporto di 53: 37: 1020. In confronto, Natsume et al. e Bashirzadeh et al. hanno scelto la dioleoil-fosfocolina (DOPC, un singolo tipo di fosfolipide) per incapsulare rispettivamente le microsfere28 e i fascin-actina34, mentre Fujii et al. hanno raccomandato 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC, un fosfolipide sintetico puro) come lipide primario per stabilire una tecnologia di sintesi proteica di membrana basata sui liposomi30 . La scelta dei lipidi primari influisce sulle proprietà fisiche dei liposomi. Ad esempio, all'aumentare del grado di insaturazione della catena acilica (cioè POPC< EPC< DOPC60), le proprietà di permeabilità di varie molecole attraverso il doppio strato diminuiscono61. La scelta dipende anche dai lipidi di interesse che vengono miscelati. Ad esempio, l'aggiunta del colesterolo rende i liposomi EPC più stabili, mentre destabilizza la struttura a doppio strato della miscela DOPC/DOPE61.

Le somiglianze tra questo lavoro e una recente pubblicazione di Bashirzadeh et al.34 rientrano nello stesso argomento dell'incapsulamento di actina. Nel frattempo, ci sono chiare distinzioni. Bashirzadeh et al. hanno riportato un approccio cDICE modificato utilizzando una camera rotante stampata in 3D. Qui adottiamo il semplice e tradizionale metodo di trasferimento dell'emulsione invertita utilizzando una siringa e una centrifuga. Entrambi questi due metodi generano un'alta resa di liposomi e hanno elevate efficienze di incapsulamento per biomolecole di grandi dimensioni24. Oltre alla differenza nei componenti lipidici come menzionato sopra, anche le architetture della rete di actina incapsulata si alterano. Bashirzadeh et al. hanno incapsulato fascina-actina all'interno del liposoma, mentre in questo lavoro, abbiamo incapsulato una rete ramificata innescata dal complesso Arp2/3. Inoltre, la formazione di uno strato di F-actina per creare un sistema di bioimitazione della corteccia in presenza di VCA-His è stata elaborata qui.

Il metodo qui riportato ha due limitazioni. Uno è che la dimensione dei liposomi che incorporano reti di actina ricostituite in vitro non può essere manipolata con precisione (variando da 5 a 50 μm di diametro) e la resa è bassa rispetto al metodo di elettroformazione. L'altra limitazione di un metodo a base acqua-olio è che tracce di olio sono intrappolate tra i foglietti a doppio strato24. Sebbene non influenzi significativamente lo spessore della membrana o la biocompatibilità di questi liposomi bio-imitanti 24,35,62,63, la dinamica della membrana dei liposomi inseriti in olio può essere alterata 62. In questo metodo viene incorporato il nucleatore di actina Arp2/3. Studi futuri potrebbero includere altre proteine del citoscheletro 64,65,66,67, nucleatori, come la formina68, o motori molecolari come la miosina II 69.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Riconosciamo il finanziamento di ARO MURI W911NF-14-1-0403 a M.P.M., il National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 a M.P.M., il National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 e Human Frontiers Science Program (HFSP) numero di sovvenzione RGY0073/2018 a M.P.M. Qualsiasi opinione, risultato, conclusione o raccomandazione espressa in questo materiale è quella degli autori e non riflette necessariamente le opinioni di ARO, NIH o HFSP. S.C. riconosce le fruttuose discussioni con V. Yadav, C. Muresan e S. Amiri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)  Avanti Polar Lipids Inc. 231615773 Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802-25G DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AKL99-D non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AR05 fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383-10G ATP
Alexa Fluor 647 dye ThermoFisher fluorescent dye
Andor iQ3 Andor Technologies control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain Cytoskeleton, Inc RP01P-A Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate Sigma 10035048 CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) Quorum Technologies incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant Cytoskeleton, Inc CF01-C cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) Andor Technologies LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA Sigma G7528 glucose
Dithiothreitol DOT Scientific  DSD11000-10 DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant Cytoskeleton, Inc HPG6 gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip Cole-Parmer UX-07940-53 glass syringe
HEPES AmericanBio 7365-45-9
ImageJ/Fiji https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids Inc. 97281442 EPC
Magnesium chloride Sigma 7786303 MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil Sigma 8042475 mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) Thermo Fisher O12650 DHPE
Potassium chloride Sigma 7447407 KCl
Sucrose Sigma 57-50-1 sucrose
β-Casein from bovine milk Sigma C6905-250MG

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References

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Bioingegneria Numero 186
<em>In vitro</em> Ricostituzione del citoscheletro di actina all'interno di vescicole unilamellari giganti
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Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. … More

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (186), e64026, doi:10.3791/64026 (2022).

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