Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

İn Vitro Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64026
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

Summary

Bu yazıda, F-aktin sitoiskeletini dev unilamellar lipid veziküllerine (lipozomlar olarak da adlandırılır) kapsüllemek için deneysel teknikleri ve lipozom zarının iç broşüründe korteks-biyomimik yapan bir F-aktin tabakası oluşturma yöntemini göstereceğiz.

Abstract

Hücredeki başlıca mekanik mekanizma olan aktin sitoiskeleti, hücre deformasyonu, bölünme, göç ve yapışma dahil olmak üzere çok sayıda temel fiziksel hücresel aktiviteye aracılık eder. Bununla birlikte, aktin ağının dinamiklerini ve yapısını in vivo olarak incelemek , canlı hücrelerdeki biyokimyasal ve genetik düzenleme ile karmaşıktır. Hücre içi biyokimyasal düzenlemeden yoksun minimal bir model oluşturmak için, aktin dev unilamellar veziküllerin (lipozomlar olarak da adlandırılan GUV'lar) içinde kapsüllenir. Biyomimetik lipozomlar hücre büyüklüğündedir ve sitoiskelet ağının mekanik ve dinamik özelliklerine nicel bir bakış açısı kazandırarak aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji için uygun bir yol açar. Kapsülleme için lipozomlar üretmek için, çeşitli hücre taklit sistemleri hazırlamak için karmaşık çözeltileri lipozomlara kapsüllemek için en başarılı tekniklerden biri olan ters emülsiyon yöntemi (emülsiyon transfer yöntemi olarak da adlandırılır) kullanılır. Bu yöntemle, daha sonra tek katmanlı lipit damlacıkları oluşturmak için fosfolipit içeren bir mineral yağ çözeltisinde emülsifiye edilen iç tampona ilgili proteinlerin bir karışımı eklenir. İstenilen lipozomlar, lipit/yağ-su arayüzünden geçen tek katmanlı lipit damlacıklarından üretilir. Bu yöntem, konsantre aktin polimerlerinin istenen lipit bileşenleri ile lipozomlara kapsüllenmesini sağlar ve biyomimikting bir sitoiskelet ağının in vitro olarak yeniden sulandırılmasının yolunu açar.

Introduction

Aktin sitoiskeleti, moleküler düzeyde kontraktiliteyi ve kuvvet üretimi 1,2,3'ü koordine ederek hücrenin hücre içi mimarisinin oluşturulmasında temel bir rol oynar. Sonuç olarak, hücre deformasyonu4,5, bölüm6, göç 7,8 ve yapışma9 dahil olmak üzere çok sayıda temel hücresel aktiviteye aracılık eder. Aktin ağlarının in vitro yeniden yapılanması son yıllarda10,11,12,13,14,15,16,17 gibi büyük ilgi görmüştür. Yeniden yapılanmanın amacı, canlı hücrelerde var olan karmaşık biyokimyasal düzenlemeden yoksun minimal bir hücre modeli oluşturmaktır. Bu, spesifik hücre içi aktiviteleri araştırmak için kontrol edilebilir bir ortam sunar ve aktin sitoiskeletinin farklı bileşenlerinin tanımlanmasını ve analizini kolaylaştırır18,19. Ayrıca, fosfolipid dev unilamellar veziküller (GUV'ler, lipozomlar) içindeki in vitro aktin ağlarının kapsüllenmesi, yarı geçirgen bir sınıra sahip sınırlı fakat deforme edilebilir bir alan sağlar. 9,20,21,22 hücresi içindeki aktin makinesinin fizyolojik ve mekanik mikro çevresini taklit eder.

Lipozomları hazırlamak için çeşitli yöntemler arasında, lipit filmi hidrasyon yöntemi (şişme yöntemi olarak da bilinir) en eski tekniklerden biridir23. Kuru lipit filmi, tamponların eklenmesiyle hidratlanır ve sonunda vezikül haline gelen membranöz kabarcıklar oluşturur24. Daha yüksek verime sahip daha büyük veziküller üretmek için, elektroformasyon yöntemi25 olarak bilinen film hidrasyon yönteminden ilerleyen geliştirilmiş bir yöntem, hidrasyon işlemini verimli bir şekilde teşvik etmek için bir AC elektrik alanı uygular26. Aktin kapsülleme için bu hidrasyon bazlı yöntemlerin başlıca sınırlamaları, yüksek konsantrasyonlu proteinlerin düşük kapsülleme verimliliğine sahip olması ve sadece spesifik lipit bileşimleri ile uyumlu olmasıdır24. Tersine çevrilmiş emülsiyon tekniği, karşılaştırıldığında, lipit bileşenleri ve protein konsantrasyonları20,27,28,29 için daha az sınırlamaya sahiptir. Bu yöntemde, kapsülleme için bir protein karışımı, daha sonra lipit içeren bir mineral yağ çözeltisinde emülsifiye edilen ve lipit-tek katmanlı damlacıklar oluşturan iç sulu tampona eklenir. Tek katmanlı lipit damlacıkları daha sonra iki katmanlı lipit vezikülleri (lipozomlar) oluşturmak için santrifüjleme yoluyla başka bir lipit / yağ-su arayüzünden geçer. Bu tekniğin aktin kapsülleme24,30 için en başarılı stratejilerden biri olduğu kanıtlanmıştır. Ayrı olarak, darbeli püskürtme31,32, geçici membran ejeksiyonu 33 ve cDICE yöntemi34 dahil olmak üzere bazı mikroakışkan cihaz yöntemleri vardır. Ters emülsiyon yöntemi ile mikroakışkan yöntem arasındaki benzerlikler, kullanılan lipit çözücü (yağ) ve lipozomların dış broşürünün oluşumu için lipit/yağ-su arayüzünün kullanılmasıdır. Buna karşılık, mikroakışkan yöntemle lipozomların üretilmesi, mikroakışkan cihazların kurulmasını gerektirir ve iki katmanın iki yaprağı arasında sıkışmış yağ eşlik eder, bu da yağın çıkarılması için ekstra bir adım gerektirir35.

Bu yazıda, daha önce kullanıldığı gibi polimerize bir F-aktin ağını kapsülleyen lipozomları hazırlamak için ters emülsiyon tekniğini kullandık22. Kapsülleme için protein karışımı ilk önce aktinin küresel (G) formunda kalması için polimerize olmayan koşullara sahip bir tampona yerleştirildi. Tüm işlem, daha sonra numunenin oda sıcaklığına ısınmasına izin verilerek tetiklenen erken aktin polimerizasyonunu önlemek için 4 ° C'de gerçekleştirildi. Oda sıcaklığına ulaştığında, aktin filamentli (F) formuna polimerize olur. Protein işlevlerini ve özelliklerini incelemek için iç sulu tampon çözeltisine çeşitli aktin bağlayıcı proteinler eklenebilir, böylece aktin ağı ve membran yüzeyi ile etkileşimi hakkında daha fazla bilgi sağlar. Bu yöntem aynı zamanda ilgilenilen çeşitli proteinlerin36 ve son lipozomların büyüklüğüne yakın büyük nesnelerin (mikropartiküller, kendinden tahrikli mikroyüzücüler, vb.)kapsüllenmesine de uygulanabilir 28,37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tamponların ve protein çözeltilerinin hazırlanması

  1. Sulu İç Polimerizasyon Olmayan (INP) Tamponunu, 0,1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM sakkaroz ve 0,2 mM ATP'yi karıştırarak toplam 5 mL hacimde hazırlayın.
  2. Aşağıdaki konsantrasyonlarda 4 ° C'de INP tamponuna proteinler ekleyerek Protein Karışımını (PM) hazırlayın: 11.2 μM floresan olmayan G-aktin, 2.8 μM floresan etiketli aktin ve 0.24 μM Arp2/3 (Malzeme Tablosu). Bir F-aktin tabakası oluşturmak için, PM'ye 100 nM gelsolin, 4 μM kofilin ve 2.2 μM VCA-His ekleyin. Bir kontrol deneyi olarak, PM'yi 100 μg / mL floresan boya ile değiştirin (Malzeme Tablosu).
  3. Sulu İç Polimerizasyon (IP) Tamponunu (sulu), 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco, 10 mM ATP ve 80 mM sakkarozu karıştırarak toplam 5 mL hacimde hazırlayın.
  4. İç sulu çözeltiyi lipozom içinde kapsüllenecek toplam 30 μL'lik bir hacimde elde etmek için INP tamponunu (PM içeren) ve IP tamponunu 1: 1 hacim oranında karıştırarak Son Tamponu (FB) hazırlayın.
  5. Sulu Dış Tamponu (OB) 10 mM HEPES (pH 7.5), 50 mM KCl, 2mM MgCl 2, 0.2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0.5 mM Dabco,212 mM glikoz ve 0.1 mg/mL β kazein karıştırarak toplam 150 μL hacimde hazırlayın.
    NOT: OB'nin ozmolaritesi, OB'nin ozmotik basıncının FB'ninkinden (20-60 mOsm) biraz daha büyük olmasını sağlamak için glikoz ile ayarlanabilir. FB'nin yoğunluğu OB'den biraz daha yüksek olmalıdır.

2. Ters emülsiyon tekniklerine dayalı lipozomların hazırlanması

  1. Lipid-yağ karışımını hazırlayın
    1. Bir cam şişeye 100 μL 25 mg / mL L-α-fosfatidilkolin (% 1 DHPE dahil olmak üzere EPC olarak da adlandırılan floresan olmayan Yumurta PC) ekleyin. Kloroformu argon gazı ile buharlaştırın, şişenin dibinde kuru bir katı lipit filmi (2.5 mg) bırakın.
      1. Bir F-aktin tabakası oluşturmak için, EPC'nin DOGS-NTA-Ni'ye 10: 1 oranında 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n (5-amino-1-carboxypentiyl) iminodiasetik asit] süksinil} nikel tuzu (DOGS-NTA-Ni) ekleyin ve kloroformun buharlaşmasından önce karıştırın.
    2. 2 mL mineral yağ ekleyin ve lipitleri yeniden askıya almak için 1 saat boyunca bir banyoda oda sıcaklığında lipit-yağ karışımını sonikleştirin.
      NOT: Sonikasyondan sonra lipit-yağ karışımı 4 ° C'de 1 hafta boyunca saklanabilir. Kullanımdan önce yeniden sonikasyon önerilir.
  2. İlgilenilen proteini içeren tek katmanlı lipit damlacıkları hazırlamak için yağ (FB / yağ) emülsiyonunda bir Son Tampon hazırlayın.
    1. Plastik bir tüp içinde alınan 100 μL lipit-yağ karışımına, 10 μL FB ekleyin. FB'nin bir damlacıkta olduğundan emin olun.
    2. Bir cam şırınga kullanarak, lipit-yağ-FB karışımını çekin ve emülsifiye etmek için birkaç kez yavaşça yukarı ve aşağı aspire edin; önce az miktarda lipit-yağ karışımı çekin ve daha sonra şırınganın ucunu damlacığın çevresine yerleştirerek FB damlacığını küçük damlacıklara ayırın. Beyazımsı ve bulutlu bir emülsiyon oluşana kadar yukarı ve aşağı aspirasyonu tekrarlayın.
  3. Ayrı bir plastik tüpe 30 μL OB koyun. OB'nin üzerine 30 μL lipit-yağ karışımı yerleştirin ve arayüzde bir lipit tek katmanı geliştirmek için ~ 10 dakika bekletin.
    NOT: Lipitler yüklenmişse veya protein dahil edilmişse, bu adımın süresi38 uzatılmalıdır.
  4. Lipozomları hazırlayın
    1. 50 μL FB/yağ emülsiyonunu (adım 2.2) 2.3. adımdan itibaren tüpün üst yağ fazına dikkatlice ekleyin.
    2. Plastik tüpü 4 °C'de 15 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj yapın. Lipozom oluşumunu optimize etmek için zamanı ve santrifüjleme hızını değiştirin.
      NOT: Santrifüjlemeden sonra, üst yağ fazı açık olmalı ve alt OB (lipozomlar içeren) hafif bulutlu olmalıdır.
    3. Yağ fazını pipetle dikkatlice çıkarın. Gerekirse ekstra hacim aspire edin. Lipozom fazının üstünde bir yağ menisküsü oluşturmamak için pipet ucunu tüpün yanına koymadığınızdan emin olun.
    4. Yeni bir pipetle, pipet ucunu yavaşça kalan alt faza yapıştırın ve lipozomları toplamak için sulu hacmi aspire edin.
      NOT: Hacmi kaybetmek, yağı dahil etmekten daha iyidir. Yağın dahil edilmesi lipozomların yırtılmasına neden olur ve iç bileşenler dış tampona salınır. Makası azaltmak için pipetin ucunu kesin.

3. Mikroskopi gözlemi

  1. Bir kuluçka odasının kuyucuğuna 100 μL OB dökün (12 mm yuvarlak kapaklar içeren 4 delikli plaka). Toplanan lipozomları (adım 2.4.4) yavaşça OB'ye yatırın ve ardından odanın üstüne başka bir örtü parçası yerleştirin.
    NOT: OB, cam yüzeyi pasifleştirmek ve lipozomlar20 arasındaki yapışmayı en aza indirmek için β kazein içerir.
  2. 63x yağ daldırma hedefi kullanarak lipozomları konfokal mikroskopla gözlemleyin. Floresan olarak etiketlenmiş lipit, kapsüllenmiş floresan boya ve kapsüllenmiş floresan etiketli aktini gözlemlemek için sırasıyla 488 nm, 647 nm ve 561 nm lazer çizgileri kullanın. İlgilendiğiniz kareleri yakalayın ve görüntüleri TIFF formatında kaydedin.
  3. ImageJ/Fiji39'da görüntüleri işleyin ve analiz edin. ImageJ/Fiji'nin yeni kullanıcıları için çevrimiçi bir öğretici mevcuttur (bkz.
    1. ImageJ/Fiji yazılımını kullanarak TIFF dosyasını açın.
    2. Git Görüntü > Parlaklığı / Kontrastı > Ayarla. Minimum ve Maksimum ayarlarını, Parlaklık ve Kontrast kaydırıcılarını ayarlayarak görüntünün parlaklığını ve karşıtlığını istediğiniz ölçeğe ayarlayın.
    3. Araç çubuğundaki Dikdörtgen seçim aracına tıklayın ve ilgilenilen bölgeyi (YG) seçin. YG'yi kırpmak için Görüntü > Kırpma'ya gidin.
    4. Ölçeği Analiz > Ayarla'ya gidin. Açılır pencerede, Piksel En Boy Oranı alanına 1.0 girin ve μm'yi Uzunluk Birimi olarak ayarlayın. Piksel Cinsinden Uzaklık alanına görüntü genişliğini piksel cinsinden girin. Bilinen Uzaklık alanına, gerçek görüntü genişliğini mikron cinsinden girin.
    5. Lipozomun boyutunu ölçmek için, araç çubuğundaki Oval seçim aracını kullanarak, lipozomun kenarı boyunca bir daire çizin. Lipozomun çapının hesaplanabileceği dairenin alanını ölçmek için Analiz > Ölçüm'e gidin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İnverted emülsiyon tekniğine dayalı lipozomların hazırlanması Şekil 1'de grafiksel ve şematik olarak gösterilmiştir.

İlk olarak, fosfolipid (EPC) ve floresan lipidden (DHPE) oluşan boş (çıplak) lipozomlar (~5-50 μm çapında) hazırlandı. Parlak, çok kırmızı bir floresan boya, bir kontrol deneyi olarak çıplak lipozomların içinde kapsüllendi. Damlacığın periferiğinde bir lipit tek katmanının başarılı bir şekilde oluşup oluşmadığı, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, emülsiyonda floresan boya içeren tek katmanlı lipit damlacıkları gözlemlenerek belirlenebilir. Başarılı lipozom üretimi, konfokal mikroskopi kullanılarak 488 nm lazer altında yeşil-floresan lipit çift katmanlı (DHPE ile lipitlerin konjugasyonu) olan ince dairesel halkanın görselleştirilmesiyle doğrulanabilir (Şekil 2A, en sağdaki panel). Floresan boyanın kapsüllenmesini doğrulamak için, lipozomların iç ortamı, uzak kırmızı floresan boya (Malzeme Tablosu) nedeniyle 647 nm lazer altında düzgün bir şekilde floresan olmalıdır (Şekil 2A; kaplama görüntüsü).

Tek katmanlı lipit damlacığı içindeki farklı kapsüllenmiş aktin formları Şekil 2B'de gösterilmiştir. Soldan sağa doğru görüntüler, küresel aktin (G-aktin), filamentli aktin (F-aktin), aktinin son tampona VCA-His ve membrana Nikel-lipid ilavesiyle ince bir F-aktin tabakası oluşturduğunu ve aktinin son tampona VCA-His, kofilin ve jelsolin ilavesiyle ince bir F-aktin tabakası oluşturduğunu ve membrana Nikel-lipid ilavesiyle aktini göstermektedir.

Daha sonra, saflaştırılmış G-aktin ve ilişkili F-aktin bağlayıcı proteinler lipozom içinde kapsüllendi. Yukarıdaki gibi aynı membran bileşenlerinden oluşan (DHPE ile karıştırılmış EPC), buradaki lipozomlar ~ 5-50 μm çapındaydı. Lipozomların oluşumu, Şekil 3A,B'de gösterilen ince yeşil dairesel halkalarla görselleştirilebilir. Aktin polimerizasyonu, numunenin oda sıcaklığına ısınmasına izin verilerek tetiklendi. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, lipozomların içindeki yeniden yapılandırılmış F-aktin ağları (% 20 floresan etiketli aktin ile) heterojendir ve aktin filamentlerinin dallanmış ağ yapıları olarak kendini gösterir. Dallanmış mimari, VCA-His 40,41,42,43,44,45 ile birlikte aktin filamentlerinin çekirdeklenmesini ve dallanmasını aynı anda kontrol eden Arp2/3 kompleksinin tanıtılmasıyla tetiklendi.

Son olarak, bir F-aktin korteks-biyomimikking sistemi oluşturuldu. Lipozomların çift katmanlı22'sinin iç broşüründe, floresan bir kabuk olarak görselleştirilebilen ince, ancak yoğun dallanmış bir F-aktin tabakası oluşturuldu (Şekil 3C). Bu durumda, ek olarak, VCA-His, kofilin ve jelsolin lipozomlara kapsüllendi. Lipid membranının bileşeninde nikel-lipidler gerekliydi. Bir WASP parçası olan VCA-His, lipit zarının Nikel-lipitleri ile etkileşime giren bir histidin etiketi taşır. Bu arada, Arp2/3 kompleksi 20,46,47,48'i işe alır. Sonuç olarak, Arp2/3 kompleksi tarafından çekirdeklendirilen aktin, kofilin ve jelsolin varlığında membranın iç tabakası boyunca kaplanmış bir F-aktin tabakası oluşturur.

Figure 1
Şekil 1: Ters emülsiyon tekniğine dayalı lipozomların hazırlanması. (A) Lipozom preparatı iki adımdan oluşur. Birinci adım: İlgilenilen proteinleri taşıyan 10 μL Son Tampon (FB) damlacığı, fosfolipit-yağ karışımının 100 μL'sine 1:10 oranında ilave edildi ve bir cam şırınga ile hafifçe yukarı ve aşağı aspire edilerek askıya alındı. Tek katmanlı lipit damlacıkları içeren çözeltiler, ileri geri aspirasyondan sonra beyazımsı hale geldi. İkinci adım: Ayrı bir plastik tüpte, lipit-yağ karışımının birkaç mikrolitresi aynı miktarda OB'nin üzerine yerleştirildi ve OB / yağ arayüzünde bir lipit tek katmanlı geliştirmek için ~ 10 dakika oturmasına izin verildi. Birinci adımdaki emülsiyon, ikinci adımdan itibaren yağ fazının üzerine döküldü ve 4 ° C'de santrifüj edildi (100 x g; 15 dakika). Santrifüjlemeden sonra, üst yağ çözeltisi berrak olmalı ve alt naklen yayın çözeltisi (lipozomlar içeren) hafif bulutlu olmalıdır. (B) Ters çevrilmiş bir emülsiyondan lipozom preparatının şemaları. Üstteki beyazımsı emülsiyon, içinde dallanmış bir aktin ağı içeren tek katmanlı lipit damlacıkları içeriyordu. Santrifüjleme sırasında, tek katmanlı lipit damlacıkları, plastik tüpün dibinde lipozomların oluşturulduğu ve biriktiği bir dış broşür oluşturmak için OB / yağ arayüzünden geçti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Tek katmanlı lipit damlacığının mikroskobik görüntüleri. (A) Emülsiyonda floresan boya içeren tek katmanlı lipit damlacığı. Soldan sağa doğru görüntüler, DIC kanalının altında tek katmanlı bir lipit damlacığı, floresan 640 nm kanal, DIC ve 640 nm kanalının bindirmesi ve floresan 488 nm kanalını göstermektedir. (B) Floresan 561 nm kanal altında tek katmanlı lipit damlacığı içindeki farklı kapsüllenmiş aktin formları. Soldan sağa doğru görüntüler, küresel aktin (G-aktin), filamentli aktin (F-aktin), aktinin Son Tampona VCA-His ve membrana Nikel-lipid ilavesiyle ince bir F-aktin tabakası oluşturduğunu ve aktinin Son Tampona VCA-His, kofilin ve jelsolin ve membrana Nikel-lipit ilavesiyle ince bir F-aktin tabakası oluşturduğunu göstermektedir. Ölçek çubukları 63x büyütmede 10 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Lipozomların içindeki aktin ağlarının kapsüllenmesinin mikroskobik görüntüleri. (A) Polimerize dallı (Arp 2/3 çekirdekli) F-aktin ağını kapsülleyen bir lipozom. Soldan sağa: floresan 488 nm kanal (solda), floresan 561 nm kanal (ortada), bindirme (sağda). (B) Polimerize dallanmış (Arp 2/3 çekirdekli) F-aktin ağlarını kapsülleyen lipozomların süspansiyonlarının temsili bir sonucu. Soldan sağa: floresan 488 nm kanal (solda), floresan 561 nm kanal (ortada) ve bindirme (sağda). (C) Bir lipozomun lipit zarının iç tabakası boyunca kaplanmış ince fakat yoğun bir F-aktin tabakasının oluşumunun ortaya çıkması. Yukarıdan aşağıya: floresan 488 nm kanal (üstte), floresan 561 nm kanal (ortada), bindirme (altta). Ölçek çubukları 63x büyütmede 10 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Birkaç önemli adım, hazırlık sürecinde yüksek miktarda lipozomun başarısını belirler. Lipit filmini yağda tamamen çözmek için, cam şişenin altındaki lipit filmi tamamen kaybolana kadar numune sonikleştirilmelidir. Sonikasyondan sonra, lipit-yağ karışımı, lipit moleküllerinin daha fazla dağılması için karanlık koşullar altında oda sıcaklığında gece boyunca saklanmalıdır29. Karışım 4 ° C'de bir haftaya kadar saklanabilir. İlgilenilen proteini içeren tek katmanlı lipit damlacıkları ile bir FB / yağ emülsiyonu hazırlarken, lipit-yağ-FB karışımı, hava kabarcıklarının ortaya çıkmasını önlemek için bir cam şırıngadan yavaşça ileri geri pompalanmalıdır. Bu işlem sırasında, cam şırınganın ucunda büyük bir damlacık, birkaç tekrardan sonra birçok küçük damlacığa (~ 5-100 μm çapında) kesilir. İşlem30'dan sonra karışım beyazımsı olmalıdır. Fosfolipitlerin kalitesini ve FB içeren damlacığın periferiğinde bir lipit tek katmanının başarılı bir şekilde oluşup oluşmadığını kontrol etmek için, Şekil 2A'da gösterildiği gibi emülsiyonda floresan boya içeren tek katmanlı lipit damlacıkları incelenmiştir. Santrifüjleme sırasında tek katmanlı lipit damlacıklarının OB / yağ arayüzünden geçişini sağlamak ve OB'de toplanan lipozomların cam yüzeye yerleşmesine izin vermek için, FB yoğunluğu OB'den biraz daha yüksek olmalıdır. Bu nedenle, sırasıyla iç (FB) ve dış (OB) sulu çözeltilerin ana bileşeni olarak sakkaroz ve glikoz seçildi. Önceki çalışmada, bu protokole dahil olmayan iç sulu çözelti20'nin yoğunluğunu ayarlamak için dextran kullanılmıştır. Dahası, OB'nin ozmolaritesi glikoz ile ayarlandı, böylece OB'nin ozmotik basıncı, önceki çalışmada 20,22'de bildirildiği gibi FB'ninkinden (20-60 mOsm) biraz daha büyüktü. Büyük ozmolarite farkı, lipozomların büzülmesine (OB'nin ozmolaritesi FB'ninkinden daha büyük olduğunda) veya rüptürüne (FB'nin ozmolaritesi OB'ninkinden daha büyük olduğunda) yol açmıştır. Tamponların ozmolaritelerini kontrol etmek için bir ozmometre kullanıldı. Protokolde, görüntüleme odasının hem plastik tüp yüzeylerini hem de cam yüzeylerini pasifleştirmek ve lipozomlar arasındaki yapışmayı en aza indirmek için OB'ye β-kazein eklendi20,49. Mineral yağ, yağ çözeltisi (yani, lipit çözücü) olarak kullanılmıştır. Dodekan 50, sıvı parafin30, skualen51 vb. dahil olmak üzere başka yerlerde farklı lipit çözücüler bildirilmiştir. Buna göre, viskozite farklılıkları ve lipozom yüzey gerilimi üzerinde getirdikleri etki nedeniyle çeşitli lipit çözücüler için farklı santrifüjleme hızları ve süreleri kullanılır. Yüklü lipitler için adım 2.3'ün süresinin uzatılması gerekir, çünkü tek katmanda, bu yüklü moleküller birbirlerini iter, böylece lipit / yağ karışımı ile OB38 arasındaki arayüzde iyi dağılmak ve organize olmak için daha fazla zaman gerektirir. İlgilenilen proteinlerle birleştirilmiş lipitler için, daha iyi tek katmanlı oluşum sağlamak için bu adımın bir uzantısı da önerilir52. Polimerize F-aktin ağını kapsülleyen lipozomların lipozom verimi için, görüş alanı başına lipozom sayısı (100 μm x 100 μm), ortalama çapı 20 μm olan 5-10 civarındadır. Tipik bir mikroskopi örneğinin uzaklaştırılmış bir görüntüsü Şekil 3B'de gösterilmiştir. Ters emülsiyon yöntemiyle üretilen lipozomların daha uzaklaştırılmış konfokal görüntüleri, çeşitli parametrelerin (yoğunluk farkı, santrifüjleme hızı / zamanı, lipit konsantrasyonu, pH, sıcaklık vb.) lipozomların yüksek verimli üretimi için optimize edildiği yakın tarihli bir çalışmada52'de bulunabilir.

F-aktin ağının sulandırılması için, adenozin trifosfat (ATP), ditiyotreitol (DTT), ilişkili tuzlar ve pH durumunun uygun bir konsantrasyonunu seçmek önemlidir. Yeniden yapılandırılmış F-aktin ağının bir ara kontrol noktası, içinde kapsüllenmiş aktin bulunan tek katmanlı lipit damlacıkları gözlemlenerek yapılabilir. Tek katmanlı lipit damlacığı içindeki farklı kapsüllenmiş aktin formları Şekil 2B'de gösterilmiştir. Aktin polimerizasyonu, daha önce53,54,55 olarak bildirildiği gibi, >20 mM K + tuzunda ve >0,2 mM Mg2 + tuzda pH 6,5 ila 8,5 arasında stabilize edilmiş olarak gerçekleşir. Lipozomların görüntülenmesinden önce, erken aktin polimerizasyonunu önlemek için tüm çözeltiler buz üzerinde tutuldu. Numuneler, aktin polimerizasyonunu tetiklemek için oda sıcaklığında görüntülendi. Yeniden yapılandırılmış F-aktin ağının mimarisi ağırlıklı olarak Arp2/3 kompleksinin aktivitesi ile düzenlenir. Arp 2/3 kompleksi, dendritik mimariler oluşturmak için mevcut bir ana filamentin yanından aktin filamentlerini çekirdeklendirir ve dallandırır56,57. Nikel-lipid (DOGS-NTA-Ni) ve VCA-His F-aktin tabakasının oluşumu için kritik öneme sahiptir. VCA-His22,58 membranındaki Nikel-lipitlere bağlı olan çekirdeklenmeyi teşvik eden bir faktör olarak hizmet eder. Dallanmış bir F-aktin ağı daha sonra Arp2/3 kompleksini kolaylaştıran VCA-O'ndan çekirdeklenir ve sonuç olarak, lipit zarının iç broşüründe yoğun bir F-aktin kabuğu oluşur. Lipozom içindeki VCA-His konsantrasyonu, F-aktin tabakasının kalınlığını belirler. Aktin düzenleyici proteinlerin (cofilin ve gelsolin) eklenmesi de F-aktin tabakasının oluşumunu teşvik eder. Kofilin, filament uçlarının sayısını artırmak için aktin filamentlerini keserken, jelsolin, büyümelerini sınırlamak için aktin filamentlerinin dikenli uçlarına bağlanır. Böylece, kofilin ve jelsolin varlığında, daha fazla sayıda filament Arp2/3 tarafından çekirdeklendirilebilir ve daha sonra F-aktin tabakasını oluşturmak için VCA-His tarafından işe alınabilir.

Protein kapsüllemesi için emülsiyon transfer yöntemine dayanan benzer makaleler son yıllarda yayınlanmıştır 28,30,34. Buradaki protokol ile bu makalelerdeki protokoller arasındaki en büyük fark, lipozomlar için birincil lipid seçimidir. Bu çalışmada, lipozom zarının ana bileşeni olarak L-α-fosfatidilkolin (EPC, yaklaşık% 60 POPC59 içeren farklı fosfatidilkolin türlerinin bir karışımı) kullanıyoruz. Bir F-aktin tabakası oluşturmak için, EPC ve Nikel-lipid (DOGS-NTA-Ni) karışımı 10: 1 oranında kullanılmıştır. Önceki bir çalışmada, lipozomlar polihistidin kaplı cam üzerine yayıldı ve EPC, kolesterol ve Nikel-lipid 53:37:1020 oranında karıştırıldı. Buna karşılık, Natsume ve ark. ve Bashirzadeh ve ark., sırasıyla mikrosferleri28 ve fassin-aktin demetleri34'ü kapsüllemek için diyoleoyl-fosfokolini (DOPC, tek bir fosfolipid tipi) seçerken, Fujii ve ark. lipozomlara dayalı bir membran protein sentez teknolojisi oluşturmak için birincil lipit olarak 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, saf sentetik fosfolipid) önermiştir30 . Primer lipitlerin seçimi lipozomların fiziksel özelliklerini etkiler. Örneğin, açil zincirinin doymamışlık derecesi arttıkça (yani, POPC< EPC< DOPC60), çift katmanlı çeşitli moleküllerin geçirgenlik özellikleri61 azalır. Seçim aynı zamanda ilgilenilen lipitlerin karıştırılmasına da bağlıdır. Örneğin, kolesterolün eklenmesi EPC lipozomlarını daha kararlı hale getirirken, DOPC / DOPE karışımının çift katmanlı yapısını dengesizleştirir61.

Bu çalışma ile Bashirzadeh ve ark.34'ün yakın tarihli bir yayını arasındaki benzerlikler aynı aktin kapsülleme konusuna düşmektedir. Bu arada, açık ayrımlar var. Bashirzadeh ve ark., 3D baskılı bir döner oda kullanan modifiye edilmiş bir cDICE yaklaşımı bildirmiştir. Burada, bir şırınga ve bir santrifüj makinesi kullanarak basit, geleneksel ters emülsiyon transfer yöntemini benimsiyoruz. Bu iki yöntemin her ikisi de yüksek miktarda lipozom üretir ve büyük biyomoleküller için yüksek kapsülleme verimliliğine sahiptir24. Yukarıda belirtildiği gibi lipit bileşenlerindeki farkın yanı sıra, kapsüllenmiş aktin ağının mimarileri de değişmektedir. Bashirzadeh ve ark. lipozom içindeki büyüleyici-aktin demetlerini kapsüllerken, bu çalışmada Arp2/3 kompleksi tarafından tetiklenen dallanmış bir ağı kapsülledik. Ek olarak, VCA-His varlığında bir korteks-biyomimikking sistemi oluşturmak için bir F-aktin tabakasının oluşumu burada detaylandırılmıştır.

Burada bildirilen yöntemin iki sınırlaması vardır. Birincisi, in vitro yeniden yapılandırılmış aktin ağlarını içeren lipozomların boyutunun tam olarak manipüle edilememesi (çapı 5 ila 50 μm arasında değişmektedir) ve verimin elektroformasyon yöntemine kıyasla düşük olmasıdır. Su-yağ bazlı bir yöntemin diğer sınırlaması, eser miktarda yağın çift katmanlı broşürler24 arasında sıkışıp kalmasıdır. Bu biyo-taklit edici lipozomların membran kalınlığını veya biyouyumluluğunu önemli ölçüde etkilemese de 24,35,62,63, yağ yerleştirilen lipozomların membran dinamikleri değişebilir 62. Bu yöntemde aktin nükleatörü Arp2/3 dahil edilir. Gelecekteki çalışmalar arasında diğer sitoiskelet proteinleri 64,65,66,67, formin 68 gibi nükleatörler veya miyozin II 69 gibi moleküler motorlar bulunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

ARO MURI W911NF-14-1-0403'ün M.P.M.'ye, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 1R01GM126256'dan M.P.M.'ye, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, Michigan Üniversitesi / Genentech, SUBK00016255 ve İnsan Sınırları Bilim Programı (HFSP) hibe numarası RGY0073/2018'den M.P.M.'ye fon sağladığını kabul ediyoruz. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu, sonuç veya öneri yazar(lar)a aittir ve mutlaka ARO, NIH veya HFSP'nin görüşlerini yansıtmaz. S.C., V. Yadav, C. Muresan ve S. Amiri ile verimli tartışmalar yaptığını kabul eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)  Avanti Polar Lipids Inc. 231615773 Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802-25G DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AKL99-D non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AR05 fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383-10G ATP
Alexa Fluor 647 dye ThermoFisher fluorescent dye
Andor iQ3 Andor Technologies control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain Cytoskeleton, Inc RP01P-A Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate Sigma 10035048 CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) Quorum Technologies incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant Cytoskeleton, Inc CF01-C cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) Andor Technologies LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA Sigma G7528 glucose
Dithiothreitol DOT Scientific  DSD11000-10 DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant Cytoskeleton, Inc HPG6 gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip Cole-Parmer UX-07940-53 glass syringe
HEPES AmericanBio 7365-45-9
ImageJ/Fiji https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids Inc. 97281442 EPC
Magnesium chloride Sigma 7786303 MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil Sigma 8042475 mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) Thermo Fisher O12650 DHPE
Potassium chloride Sigma 7447407 KCl
Sucrose Sigma 57-50-1 sucrose
β-Casein from bovine milk Sigma C6905-250MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
  2. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  3. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  4. Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103 (2022).
  5. Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
  6. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  7. Bray, D., White, J. Cortical flow in animal cells. Science. 239 (4842), 883-888 (1988).
  8. Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
  9. Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
  10. Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
  11. Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  12. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  13. McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
  14. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nature Materials. 10 (6), 462-468 (2011).
  15. Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
  16. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  17. Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745 (2021).
  18. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  19. Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
  20. Murrell, M., et al. Spreading dynamics of biomimetic actin cortices. Biophysical Journal. 100 (6), 1400-1409 (2011).
  21. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nature Physics. 4 (10), 789-793 (2008).
  22. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  23. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  24. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
  25. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  26. Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103 (2002).
  27. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  28. Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282 (2017).
  29. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
  30. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  31. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  32. Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
  33. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  34. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  35. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  36. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  37. Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
  38. Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. Methods in Cell Biology. 128, Elsevier. 271-285 (2015).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
  41. Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
  42. Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
  43. Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
  44. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
  45. Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
  46. Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
  47. Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
  48. Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245 (2020).
  49. Schäfer, E., Kliesch, T. -T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
  50. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  51. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  52. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  53. Vale, R. Reconstituting the Cytoskeleton. , Academic Press. (2014).
  54. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Mechanism of K+-induced actin assembly. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 648-654 (1982).
  55. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 27 (20), 7766-7772 (1988).
  56. Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
  57. Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
  58. Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
  59. Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
  60. Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
  61. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
  62. Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  63. Deng, N. -N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. Monodisperse uni-and multicompartment liposomes. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  64. Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
  65. Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
  66. Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
  67. Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
  68. Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243 (2019).
  69. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Methods in Enzymology. 540, Elsevier. 265-282 (2014).

Tags

Biyomühendislik Sayı 186
<em>İn Vitro</em> Aktin Hücre İskeletinin Dev Unilameller Veziküller İçinde Yeniden Sulandırılması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. … More

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (186), e64026, doi:10.3791/64026 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter