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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

In vitro Reconstituição do Actin Cytoskeleton Dentro de Vesículos Gigantes Unilamellar

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64026
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

Summary

Neste manuscrito, demonstramos as técnicas experimentais para encapsular o citoesqueleto F-actin em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (também chamadas lipossomos), e o método para formar uma camada de F-actin de córtex biomimicing no folheto interno da membrana lipossosome.

Abstract

O citoesqueleto de actina, o principal maquinário mecânico da célula, media inúmeras atividades celulares físicas essenciais, incluindo deformação celular, divisão, migração e adesão. No entanto, estudar a dinâmica e a estrutura da rede actin in vivo é complicado pela regulação bioquímica e genética dentro das células vivas. Para construir um modelo mínimo desprovido de regulação bioquímica intracelular, o actin é encapsulado dentro de vesículas unilamellar gigantes (GUVs, também chamados lipossomos). Os lipossomos biomiméticos são do tamanho de células e facilitam uma visão quantitativa das propriedades mecânicas e dinâmicas da rede de citoesqueleto, abrindo uma rota viável para a biologia sintética de baixo para cima. Para gerar lipossomos para encapsulamento, utiliza-se o método de emulsão invertida (também chamado de método de transferência de emulsão), que é uma das técnicas mais bem sucedidas para encapsular soluções complexas em lipossomos para preparar vários sistemas de imitação celular. Com este método, uma mistura de proteínas de interesse é adicionada ao tampão interno, que é posteriormente emulsionado em uma solução de óleo mineral contendo fosfolipídio para formar gotículas lipídicas monocamadas. Os lipossomos desejados são gerados a partir de gotículas lipídicas de monocamadas que cruzam uma interface lipídica/óleo-água. Este método permite o encapsulamento de polímeros concentrados de actina nos lipossomos com componentes lipídudos desejados, abrindo caminho para a reconstituição in vitro de uma rede de citoesqueleto biomimicing.

Introduction

O citoesqueleto de actina desempenha um papel fundamental na construção da arquitetura intracelular da célula, coordenando a contratude de nível molecular e a geraçãode força 1,2,3. Como resultado, media inúmeras atividades celulares essenciais, incluindo deformaçãocelular 4,5, divisão6, migração 7,8 e adesão9. A reconstituição in vitro das redes actin ganhou enorme atenção nos últimos anos 10,11,12,13,14,15,16,17. O objetivo da reconstituição é construir um modelo mínimo da célula desprovida da complexa regulação bioquímica que existe dentro das células vivas. Isso oferece um ambiente controlável para sondar atividades intracelulares específicas e facilita a identificação e análise de diferentes componentes do citoesqueleto de actina18,19. Além disso, o encapsulamento de redes in vitro actin dentro de vesículas unilamellar gigantes fosfolipídicas (GUVs, lipossomos) fornece um espaço confinado, mas deformável, com um limite semi-permeável. Imita o microambiente fisiológico e mecânico do maquinário de actina dentro da célula 9,20,21,22.

Entre vários métodos para preparar lipossomos, o método de hidratação de filme lipídeído (também conhecido como método de inchaço) é uma das primeiras técnicas23. O filme lipídigo seco hidrata-se com a adição de tampões, formando bolhas membranous que eventualmente se tornam vesículas24. Para produzir vesículas maiores com maior rendimento, um método melhorado avançando a partir do método de hidratação cinematográfica, conhecido como método de eletroformação25, aplica um campo elétrico CA para promover eficientemente o processo de hidratação26. As principais limitações desses métodos baseados em hidratação para encapsulamento de actina são que ele tem baixa eficiência de encapsulamento de proteínas altamente concentradas, e só é compatível com composições lipídicas específicas24. A técnica de emulsão invertida, em comparação, tem menos limitações para componentes lipídicos e concentrações proteicas 20,27,28,29. Neste método, uma mistura de proteínas para encapsulamento é adicionada ao tampão aquoso interno, que é posteriormente emulsionado em uma solução de óleo mineral contendo lipídios, formando gotículas lipídicas-monocamadas. As gotículas lipídicas monocamadas então atravessam outra interface lipídica/óleo-água através da centrifugação para formar vesículas lipídicas bicamadas (lipossomos). Esta técnica provou ser uma das estratégias mais bem sucedidas para encapsulamento de actin 24,30. Separadamente, existem alguns métodos de dispositivo microfluido, incluindo o lançamento pulsado31,32, ejeção transitória da membrana33 e o método cDICE34. As semelhanças entre o método de emulsão invertida e o método microfluido são o solvente lipídico (óleo) que é utilizado e a introdução de interface lipídica/óleo-água para a formação do folheto externo de lipossomos. Em contrapartida, a geração de lipossomos pelo método microfluido requer uma configuração de dispositivos microfluidos e é acompanhada de óleo preso entre os dois folhetos da bicamada, o que requer um passo extra para a remoção do óleo35.

Neste manuscrito, utilizamos a técnica de emulsão invertida para preparar lipossomos encapsulando uma rede polimerizada de F-actin como usado anteriormente22. A mistura de proteínas para encapsulamento foi primeiramente colocada em um tampão com condições não polimerizantes para manter a actina em sua forma globular (G). Todo o processo foi realizado a 4 °C para evitar a polimerização da actina precoce, que mais tarde foi acionada permitindo que a amostra aquecesse à temperatura ambiente. Uma vez à temperatura ambiente, o actin polimeriza em sua forma de fistoso (F). Uma variedade de proteínas de ligação de actina pode ser adicionada à solução tampão aquosa interna para estudar funcionalidades e propriedades proteicas, fornecendo assim insights sobre sua interação com a rede actina e superfície da membrana. Este método também pode ser aplicado ao encapsulamento de várias proteínas de interesse36 e objetos grandes (micropartículas, microswimmers autopropulsores, etc.) perto do tamanho dos lipossomos finais28,37.

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Protocol

1. Preparação de tampões e soluções proteicas

  1. Prepare o aquoso Tampão de Não Polimerização Interna (INP) em um volume total de 5 mL misturando 0,1 mM CaCl2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM de sacarose e 0,2 mM ATP.
  2. Prepare o Mix de Proteínas (PM) adicionando proteínas ao tampão INP a 4 °C com as seguintes concentrações: 11,2 μM de G-actina não fluorescente, 2,8 μM de actina fluorescente e 0,24 μM Arp2/3 (Tabela de Materiais). Para formar uma camada F-actin, adicione gelsolina de 100 nM, cofilina de 4 μM e 2,2 μM VCA-His ao PM. Como experimento de controle, substitua a PM por 100 μg/mL de corante fluorescente (Tabela de Materiais).
  3. Prepare o aquoso Tampão de Polimerização Interna (IP) (aquos) em um volume total de 5 mL misturando 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP e 80 mM de sacarose.
  4. Prepare o Buffer Final (FB) misturando buffer INP (contendo PM) e tampão IP a uma proporção de volume de 1:1 para produzir a solução aquosa interna em um volume total de 30 μL que será encapsulado dentro do lipossomo.
  5. Prepare o aquoso Buffer Externo (OB) em um volume total de 150 μL misturando HEPES de 10 mM (pH 7.5), 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, ATP de 2mM, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM de glicose e 0,1 mg/mL β-caseína.
    NOTA: A osmolaridade do OB pode ser ajustada com glicose para garantir que a pressão osmótica da OB seja ligeiramente maior que a do FB (20-60 mOsm). A densidade do FB deve ser ligeiramente maior que a OB.

2. Preparação de lipossomos baseados nas técnicas de emulsão invertidas

  1. Prepare a mistura lipídica-óleo
    1. Adicione 100 μL de 25 mg/mL L-α-fosphasphatidylcholina (PC de ovo não fluorescente, também chamado de EPC, incluindo 1% DHPE) em um frasco de vidro. Evaporar clorofórmio com gás argônio, deixando um filme lipídedo sólido seco (2,5 mg) na parte inferior do frasco.
      1. Para formar uma camada F-actin, adicione 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl) ácido iminodiacético] sal de níquel succinyl} (DOGS-NTA-Ni) a uma razão de 10:1 de EPC para DOGS-NTA-Ni e misture antes da evaporação de cloroform.
    2. Adicione 2 mL de óleo mineral e sonicar a mistura lipídica-óleo à temperatura ambiente em um banho por 1h para suspender os lipídios.
      NOTA: A mistura lipídida-óleo após a sônica pode ser mantida por 1 semana a 4 °C. A ressarção é sugerida antes do uso.
  2. Prepare uma emulsão final de buffer em óleo (FB/óleo) para preparar gotículas lipídicas de monocamadas contendo a proteína de interesse.
    1. A 100 μL de mistura lipídica-óleo tomada em um tubo plástico, adicione 10 μL de FB. Certifique-se de que o FB está em uma gota.
    2. Usando uma seringa de vidro, desenhe a mistura lipídio-óleo-FB e aspire suavemente várias vezes para emulsificá-la; desenhe uma pequena quantidade de mistura lipídica-óleo primeiro, e depois a gota FB colocando a ponta da seringa na periferia da gotícula para quebrá-la em pequenas gotículas. Repita a aspiração para cima e para baixo até formar uma emulsão esbranquiçada e nebulosa.
  3. Coloque 30 μL de OB em um tubo plástico separado. Coloque 30 μL da mistura lipídica-óleo em cima de OB e deixe descansar por ~10 minutos para desenvolver uma monocameira lipídica na interface.
    NOTA: Se os lipídios estiverem carregados ou a proteína for incorporada, a duração desta etapa deve ser estendida38.
  4. Prepare os lipossomos
    1. Adicione cuidadosamente 50 μL da emulsão FB/óleo (etapa 2.2) à fase superior do óleo do tubo a partir da etapa 2.3.
    2. Centrifugar o tubo plástico a 100 x g por 15 minutos a 4 °C. Varie a velocidade de tempo e centrifugação para otimizar para a formação de lipossomos.
      NOTA: Após a centrifugação, a fase superior do óleo deve ser clara, e o OB inferior (contendo lipossomos) deve estar ligeiramente nublado.
    3. Remova cuidadosamente a fase do óleo por pipeta. Aspire volume extra, se necessário. Certifique-se de não colocar a ponta da pipeta na lateral do tubo para evitar criar um menisco de óleo em cima da fase liposesome.
    4. Com uma nova pipeta, coloque lentamente a ponta da pipeta na fase inferior restante e aspire o volume aquoso para coletar lipossomos.
      NOTA: É melhor perder volume do que incorporar o óleo. A inclusão do óleo causará a ruptura de lipossomos, e os componentes internos serão liberados no tampão externo. Corte a ponta de uma pipeta para reduzir a tesoura.

3. Observação da microscopia

  1. Despeje 100 μL de OB no poço de uma câmara de incubação (placa de 4 poços contendo tampas redondas de 12 mm). Deposite suavemente os lipossomos coletados (passo 2.4.4) em OB e, em seguida, coloque outra mancha de cobertura em cima da câmara.
    NOTA: O OB contém a β-caseína para passivar a superfície de vidro e minimizar a aderência entre os lipossomos20.
  2. Observe lipossomos com um microscópio confocal usando um objetivo de imersão de óleo de 63x. Use linhas laser de 488 nm, 647 nm e 561 nm para observar lipídios fluorescentes rotulados, corante fluorescente encapsulado e actina fluorescente encapsulada, respectivamente. Capture os quadros de interesse e salve as imagens no formato TIFF.
  3. Processe e analise imagens em ImageJ/Fiji39. Para novos usuários do ImageJ/Fiji, um tutorial online está disponível (ver Tabela de Materiais).
    1. Abra o arquivo TIFF usando o software ImageJ/Fiji.
    2. Vá para > de imagem Ajuste > brilho/contraste. Ajuste o brilho e o contraste da imagem na escala desejada ajustando as configurações Mínima e Máxima , e os controles deslizantes Brilho e Contraste .
    3. Clique na ferramenta de seleção Retângulo na barra de ferramentas e selecione a região de interesse (ROI). Vá para Image > Crop para cortar o ROI.
    4. Vá analisar > escala de conjunto. Na janela pop-up, digite 1.0 no campo Proporção de Pixel e coloque μm como a unidade de comprimento. No campo Distância no Pixels , digite a largura da imagem em pixels. No campo Distância Conhecida , digite a largura real da imagem em mícrons.
    5. Para medir o tamanho do lipossomo, Usando a ferramenta de seleção oval na barra de ferramentas, desenhe um círculo ao longo da borda do lipossomo. Vá analisar > Medida para medir a área do círculo, a partir da qual o diâmetro do lipossomo pode ser calculado.

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Representative Results

A preparação de lipossomos baseados na técnica de emulsão invertida é ilustrada graficamente e esquematicamente na Figura 1.

Primeiro, foram preparados lipossomos vazios (nus) (~5-50 μm de diâmetro) compostos de fosfolipídio (EPC) e lipídio fluorescente (DHPE). Um corante fluorescente vermelho brilhante foi encapsulado dentro de lipossomos nus como um experimento de controle. Se uma monocamada lipídica se formou com sucesso no periférico da gotícula poderia ser determinada observando gotículas lipídicas monocamadas incorporando corante fluorescente na emulsão, como mostrado na Figura 2A. A geração liposasome bem sucedida pôde ser verificada através da visualização do fino anel circular, que é a bicamada lipídica verde-fluorescente (conjugação de lipídios com DHPE), sob laser de 488 nm usando microscopia confocal (Figura 2A, painel mais à direita). Para confirmar o encapsulamento do corante fluorescente, o ambiente interno dos lipossomos deve ser uniformemente fluorescente sob um laser de 647 nm (Figura 2A; imagem de sobreposição) devido ao corante fluorescente vermelho distante (Tabela de Materiais).

Diferentes formas de actina encapsulada dentro da gota lipídica monocamada são mostradas na Figura 2B. Imagens da esquerda para a direita mostram actina globular (G-actin), fismópio actin (F-actin), actin formando uma fina camada de F-actin com a adição de VCA-His ao tampão final e níquel-lipídio à membrana, e atua formando uma fina camada de F-actin com a adição de VCA-His, cofilina e gelsolina ao tampão final e níquel-lipídio à membrana.

Em seguida, as proteínas purificadas de g-actin e associadas à ligação f-actin foram encapsuladas dentro do lipossomo. Composto dos mesmos componentes de membrana acima (EPC misturado com DHPE), os lipossomos aqui tinham ~5-50 μm de diâmetro. A formação de lipossomos poderia ser visualizada pelos finos anéis circulares verdes mostrados na Figura 3A,B. A polimerização de actina foi desencadeada permitindo que a amostra aquecesse à temperatura ambiente. Como mostrado na Figura 3A, as redes de F-actin reconstituídas (com actin 20% fluorescente) dentro de lipossomos são heterogêneas, manifestando-se como estruturas de rede ramificadas de filamentos actin. A arquitetura ramificada foi desencadeada pela introdução do complexo Arp2/3, que controla simultaneamente a nucleação e ramificação de filamentos de actina, juntamente com vca-his 40,41,42,43,44,45.

Finalmente, foi criado um sistema de córtex-biomimicking F-actin. Uma fina, mas densamente ramificada camada F-actin foi criada no folheto interno da bicamada de lipossomos22, que poderia ser visualizada como uma concha fluorescente (Figura 3C). Neste caso, além disso, VCA-His, cofilina e gelsolina foram encapsulados em lipossomos. Foram necessários lipídios de níquel no componente da membrana lipídica. VCA-His, um fragmento wasp, carrega uma tag histidina em interação com os lipídios de níquel da membrana lipídica. Enquanto isso, recruta o complexo Arp2/3 20,46,47,48. Como resultado, a actina nucleada pelo complexo Arp2/3 gera uma camada de ato de F revestida ao longo da camada interna da membrana na presença de cofilina e gelsolina.

Figure 1
Figura 1: Preparação de lipossomos baseados na técnica de emulsão invertida. (A) A preparação lipossocós é composta por dois passos. Primeiro passo: Uma gota de 10 μL de Buffer Final (FB) carregando proteínas de interesse foi adicionada a 100 μL da mistura de óleo fosfolipídico a uma proporção de 1:10 e suspensa por aspirar suavemente para cima e para baixo com uma seringa de vidro. As soluções contendo gotículas lipídicas de monocamadas tornaram-se esbranquiçadas após a aspiração de ida e volta. Passo dois: Em um tubo plástico separado, alguns microliters da mistura lipída-óleo foram colocados em cima da mesma quantidade de OB e autorizados a sentar-se por ~10 minutos para desenvolver uma monocamada lipídica na interface OB/óleo. A emulsão da primeira etapa foi derramada em cima da fase do óleo a partir do segundo passo e foi centrifuada (100 x g; 15 minutos) a 4 °C. Após a centrifugação, a solução de óleo superior deve ser clara, e a solução OB inferior (contendo lipossomos) deve ser ligeiramente nublada. (B) Esquemas da preparação lipossa a partir de uma emulsão invertida. A emulsão esbranquiçada na parte superior continha gotículas lipídicas de monocamadas que incorporavam uma rede de actin ramificada no interior. Durante a centrifugação, as gotículas lipídicas da monocamada passaram pela interface OB/óleo para formar um folheto externo de tal forma que os lipossomos foram criados e acumulados na parte inferior do tubo plástico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagens microscópicas da gotícula lipídica da monocamada. (A) A gotícula lipídica monocamada que incorpora corante fluorescente na emulsão. Imagens da esquerda para a direita mostram uma gotícula lipídica monocamada sob o canal DIC, canal fluorescente de 640 nm, sobreposição do canal DIC e 640 nm, e canal fluorescente de 488 nm, respectivamente. (B) Diferentes formas de actina encapsulada dentro da gotícula lipídica monocamada sob um canal fluorescente de 561 nm. Imagens da esquerda para a direita mostram actina globular (G-actin), fisordenada actina (F-actin), actin formando uma fina camada F-actin com a adição de VCA-His ao Buffer Final e Níquel-lipídio à membrana, e atua na formação de uma fina camada de F-actin com a adição de VCA-His, cofilina e gelsolina ao Buffer Final e Níquel-lipídio à membrana. As barras de escala são de 10 μm a 63x de ampliação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Imagens microscópicas do encapsulamento de redes de actina dentro de lipossomos. (A) Um lipossomo encapsulando rede polimerizada ramificada (Arp 2/3 nucleated) rede F-actin. Da esquerda para a direita: canal fluorescente de 488 nm (esquerda), canal fluorescente de 561 nm (centro), sobreposição (direita). (B) Resultado representativo de suspensões de lipossomos encapsulando redes ramificadas polimerizadas (Arp 2/3) F-actin. Da esquerda para a direita: canal fluorescente de 488 nm (esquerda), canal fluorescente de 561 nm (centro) e sobreposição (direita). (C) O aparecimento da formação de uma fina, mas densa camada de atoína revestida ao longo da camada interna da membrana lipídica de um liposom. Topo a parte inferior: canal fluorescente de 488 nm (superior), canal fluorescente de 561 nm (centro), sobreposição (inferior). As barras de escala são de 10 μm a 63x de ampliação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Várias etapas-chave determinam o sucesso de um alto rendimento de lipossomos durante o processo de preparação. Para dissolver completamente o filme lipíduo no óleo, a amostra deve ser sônica até que o filme lipídudo na parte inferior do frasco de vidro desapareça completamente. Após a sônica, a mistura lipídica-óleo deve ser armazenada durante a noite à temperatura ambiente em condições escuras para que as moléculas lipídicas se dispersem por mais29. A mistura pode ser armazenada a 4 °C por até uma semana. Ao preparar uma emulsão FB/óleo com gotículas lipídicas monocamadas contendo proteína de interesse, a mistura lipídico-óleo-FB deve ser suavemente bombeada para frente e para trás através de uma seringa de vidro para evitar a introdução de bolhas de ar. Durante este processo, uma grande gota é arrancada na ponta da seringa de vidro em muitas gotículas menores (~5-100 μm de diâmetro) após várias repetições. A mistura deve ser esbranquiçada após o processo30. Para verificar a qualidade dos fosfolipídios, e se uma monocamada lipídica havia se formado com sucesso no periférico da FB contendo gotículas, gotículas lipídicas monocamadas incorporando corante fluorescente foram examinadas na emulsão, como mostrado na Figura 2A. Para garantir a passagem das gotículas lipídicas da monocamada através da interface OB/óleo durante a centrifugação, e permitir que os lipossomos coletados em OB se instalem na superfície do vidro, a densidade de FB deve ser ligeiramente maior que a OB. Por isso, a sacarose e a glicose foram escolhidas como o principal componente das soluções aquosas internas (FB) e externas (OB), respectivamente. No trabalho anterior, o Dextran foi utilizado para ajustar a densidade da solução interna aquosa20, que não está incluída neste protocolo. Além disso, a osmolaridade da OB foi ajustada com glicose de tal forma que a pressão osmótica da OB seja ligeiramente maior que a de FB (20-60 mOsm), conforme relatado no trabalho anterior20,22. Grande diferença de osmolaridade levou ao encolhimento (quando a osmolaridade da OB é maior que a da FB) ou ruptura (quando a osmolaridade da FB é maior que a de OB) dos lipossomos. Um osmômetro foi usado para verificar as osmolaridades dos buffers. No protocolo, β-caseína foi adicionada na OB para passivar tanto superfícies de tubos plásticos quanto superfícies de vidro da câmara de imagem e minimizar a aderência entre os lipossomos20,49. O óleo mineral foi utilizado como solução de óleo (ou seja, o solvente lipídeído). Diferentes solventes lipídicos foram relatados em outros lugares, incluindo dodecano50, parafina líquida30, squalane51, etc. Assim, diferentes velocidades e durações de centrifugação são usadas para vários solventes lipídides devido às suas diferenças de viscosidade e à influência que eles trazem sobre a tensão superficial lipossosome. A duração da etapa 2.3 precisa ser estendida para lipídios carregados porque, na monocamide, essas moléculas carregadas se repelirem, exigindo assim mais tempo para difundir e organizar bem na interface entre a mistura lipídica/óleo e OB38. Para lipídios incorporados com proteínas de interesse, também é recomendada uma extensão desta etapa para garantir uma melhor formação de monocamadas52. Para o rendimento lipossomo de lipossomos encapsulando a rede polimerizada F-actin, o número de lipossomos por campo de visão (100 μm x 100 μm) é em torno de 5-10 com um diâmetro médio de 20 μm. Uma imagem ampliada de uma amostra típica de microscopia é mostrada na Figura 3B. Imagens confocal mais ampliadas dos lipossomos produzidos através do método de emulsão invertida podem ser encontradas em um estudo recente52 onde vários parâmetros (diferença de densidade, velocidade/tempo de centrifugação, concentração lipídica, pH, temperatura, etc.) foram otimizados para produção de lipossomos de alto rendimento.

Para a reconstituição da rede F-actin, é essencial escolher uma concentração adequada do triphosfato de adenosina (ATP), dithiothreitol (DTT), os sais associados e a condição de pH. Um ponto de verificação intermediário da rede F-actin reconstituída pode ser feito observando gotículas lipídicas monocamadas com actin encapsulado dentro. Diferentes formas de actina encapsulada dentro da gota lipídica monocamada são mostradas na Figura 2B. A polimerização de actina ocorre em sal K+ de >20 mM+ e em sal >0,2 mM Mg2+ com o pH estabilizado entre 6,5 e 8,5, conforme relatado anteriormente 53,54,55. Antes da imagem dos lipossomos, todas as soluções eram mantidas no gelo para evitar a polimerização precoce da actina. As amostras foram imagens à temperatura ambiente para desencadear a polimerização da actina. A arquitetura da rede F-actin reconstituída é predominantemente regulada pela atividade do complexo Arp2/3. Os núcleos complexos Arp 2/3 e ramos atuam em filamentos do lado de um filamento materno existente para gerar arquiteturas dendríticas56,57. O Níquel-lipídida (DOGS-NTA-Ni) e o VCA-His são críticos para a formação da camada F-actin. O VCA-His serve como um fator promotor de nucleação, que está ligado a lipídios de níquel na membrana22,58. Uma rede F-actin ramificada é então nucleada a partir de VCA-His facilitando o complexo Arp2/3, e como resultado, uma densa concha F-actin é formada no folheto interno da membrana lipídica. A concentração de VCA-His dentro do lipossomo determina a espessura da camada F-actin. A adição das proteínas regulatórias actina (cofilina e gelsolina) também promove a formação da camada F-actin. A cofilina corta filamentos de actin para aumentar o número de extremidades de filamento, enquanto a gelsolina se liga às extremidades farpadas de filamentos de actin para limitar seu crescimento. Assim, na presença de cofilina e gelsolina, um número maior de filamentos pode ser nucleado por Arp2/3, e então recrutado pela VCA-His para formar a camada F-actin.

Trabalhos semelhantes baseados no método de transferência de emulsão para encapsulamento de proteínas foram publicados nos últimos anos 28,30,34. Uma grande diferença entre o protocolo aqui e os protocolos nestes artigos é a escolha do lipídio primário para lipossomos. Neste trabalho, utilizamos a L-α-fosphatidylcholina (EPC, uma mistura de diferentes espécies fosfatitaslcolinas contendo aproximadamente 60% POPC59) como o principal componente da membrana lipossoma. Para formar uma camada F-actin, foi utilizada uma mistura do EPC e do Níquel-lipídio (DOGS-NTA-Ni) em uma razão de 10:1. Em um trabalho anterior, os lipossomos foram espalhados em vidro revestido de polihistidina, e EPC, colesterol e níquel-lipídio foram misturados a uma razão de 53:37:1020. Em comparação, Natsume et al. e Bashirzadeh et al. escolheram a dioleoyl-fosfocholina (DOPC, um único tipo de fosfolipídio) para encapsular microesferas28 e pacotes de fascin-actina34, respectivamente, enquanto Fujii et al. recomendaram 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholina (POPC, um fosfolipídio sintético puro) como lipídio primário para estabelecer uma tecnologia de síntese de proteína de membrana baseada em lipossomos30 . A escolha dos lipídios primários afeta as propriedades físicas dos lipossomos. Por exemplo, à medida que o grau de insaturação da cadeia aciítica aumenta (ou seja, POPC< EPC< DOPC60), as propriedades de permeabilidade de várias moléculas através da bicamada diminuem61. A escolha também depende dos lipídios de interesse serem misturados. Por exemplo, a adição do colesterol torna os lipossomos EPC mais estáveis, enquanto desestabiliza a estrutura bicamada da mistura DOPC/DOPE61.

As semelhanças entre este trabalho e uma recente publicação de Bashirzadeh et al.34 caem sobre o mesmo tema do encapsulamento actin. Enquanto isso, há claras distinções. Bashirzadeh et al. relataram uma abordagem cDICE modificada utilizando uma câmara giratória impressa em 3D. Aqui, adotamos o método de transferência de emulsão invertida simples e tradicional usando uma seringa e uma máquina de centrífugas. Ambos os dois métodos geram um alto rendimento de lipossomos e têm alta eficiência de encapsulamento para grandes biomoléculas24. Além da diferença nos componentes lipídudos como mencionado acima, as arquiteturas da rede actin encapsulada também alteram. Bashirzadeh et al. encapsularam feixes de fascin-actin dentro do lipossomo, enquanto neste trabalho, encapsulamos uma rede ramificada desencadeada pelo complexo Arp2/3. Além disso, a formação de uma camada F-actin para criar um sistema de biomimicing córtex na presença VCA-His foi elaborada aqui.

O método aqui relatado tem duas limitações. Uma delas é que o tamanho dos lipossomos que incorporam redes de actina reconstituídas in vitro não pode ser precisamente manipulado (variando de 5 a 50 μm de diâmetro), e o rendimento é baixo em comparação com o método de eletroformação. A outra limitação de um método à base de óleo de água é que as quantidades de vestígios de óleo estão presas entre os folhetos bicamadas24. Embora não afete significativamente a espessura da membrana ou a biocompatibilidade desses lipossomos bio-imitadores 24,35,62,63, a dinâmica da membrana dos lipossomos inseridos por óleo pode ser alterada 62. Neste método, o nucleador de actina Arp2/3 é incorporado. Estudos futuros podem incluir outras proteínas citoesqueletos 64,65,66,67, nucleadores, como formin 68, ou motores moleculares como a minocina II 69.

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Disclosures

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Acknowledgments

Reconhecemos o financiamento ARO MURI W911NF-14-1-0403 a M.P.M., os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01 1R01GM126256 a M.P.M., os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) U54 CA209992, NIH RO126256, NIH U54 CA209992, Universidade de Michigan / Genentech, SUBK00016255 e Human Frontiers Science Program (HFSP) concedem o número RGY0073/2018 a M.P.M. Qualquer opinião, achados, conclusões ou recomendações expressas neste material são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões do ARO, NIH ou HFSP. S.C. reconhece discussões frutíferas com V. Yadav, C. Muresan e S. Amiri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)  Avanti Polar Lipids Inc. 231615773 Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802-25G DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AKL99-D non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AR05 fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383-10G ATP
Alexa Fluor 647 dye ThermoFisher fluorescent dye
Andor iQ3 Andor Technologies control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain Cytoskeleton, Inc RP01P-A Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate Sigma 10035048 CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) Quorum Technologies incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant Cytoskeleton, Inc CF01-C cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) Andor Technologies LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA Sigma G7528 glucose
Dithiothreitol DOT Scientific  DSD11000-10 DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant Cytoskeleton, Inc HPG6 gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip Cole-Parmer UX-07940-53 glass syringe
HEPES AmericanBio 7365-45-9
ImageJ/Fiji https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids Inc. 97281442 EPC
Magnesium chloride Sigma 7786303 MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil Sigma 8042475 mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) Thermo Fisher O12650 DHPE
Potassium chloride Sigma 7447407 KCl
Sucrose Sigma 57-50-1 sucrose
β-Casein from bovine milk Sigma C6905-250MG

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References

  1. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
  2. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  3. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  4. Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103 (2022).
  5. Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
  6. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  7. Bray, D., White, J. Cortical flow in animal cells. Science. 239 (4842), 883-888 (1988).
  8. Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
  9. Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
  10. Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
  11. Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  12. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  13. McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
  14. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nature Materials. 10 (6), 462-468 (2011).
  15. Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
  16. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  17. Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745 (2021).
  18. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  19. Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
  20. Murrell, M., et al. Spreading dynamics of biomimetic actin cortices. Biophysical Journal. 100 (6), 1400-1409 (2011).
  21. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nature Physics. 4 (10), 789-793 (2008).
  22. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  23. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  24. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
  25. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  26. Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103 (2002).
  27. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  28. Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282 (2017).
  29. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
  30. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  31. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  32. Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
  33. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  34. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  35. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  36. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  37. Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
  38. Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. Methods in Cell Biology. 128, Elsevier. 271-285 (2015).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
  41. Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
  42. Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
  43. Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
  44. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
  45. Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
  46. Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
  47. Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
  48. Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245 (2020).
  49. Schäfer, E., Kliesch, T. -T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
  50. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  51. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  52. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  53. Vale, R. Reconstituting the Cytoskeleton. , Academic Press. (2014).
  54. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Mechanism of K+-induced actin assembly. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 648-654 (1982).
  55. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 27 (20), 7766-7772 (1988).
  56. Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
  57. Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
  58. Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
  59. Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
  60. Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
  61. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
  62. Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  63. Deng, N. -N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. Monodisperse uni-and multicompartment liposomes. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  64. Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
  65. Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
  66. Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
  67. Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
  68. Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243 (2019).
  69. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Methods in Enzymology. 540, Elsevier. 265-282 (2014).

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Bioengenharia Edição 186
<em>In vitro</em> Reconstituição do Actin Cytoskeleton Dentro de Vesículos Gigantes Unilamellar
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Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. … More

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (186), e64026, doi:10.3791/64026 (2022).

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