Summary
本稿では、F-アクチン細胞骨格を巨大な単層脂質小胞(リポソームとも呼ばれる)に封入する実験技術と、リポソーム膜の内小葉に皮質生物模倣型F-アクチン層を形成する方法を示す。
Abstract
細胞内の主要な機械的機構であるアクチン細胞骨格は、細胞の変形、分裂、遊走、および接着を含む多数の重要な物理的細胞活動を媒介する。しかし、 インビボ でのアクチンネットワークのダイナミクスと構造の研究は、生細胞内の生化学的および遺伝的調節によって複雑になる。細胞内生化学的調節を欠いた最小モデルを構築するために、アクチンは巨大な単層小胞(GUV、リポソームとも呼ばれる)の内部に封入される。生体模倣リポソームは細胞サイズであり、細胞骨格ネットワークの機械的および動的特性に対する定量的洞察を容易にし、ボトムアップ合成生物学のための実行可能なルートを開く。封入用のリポソームを生成するために、反転エマルジョン法(エマルジョン移動法とも呼ばれる)が利用され、これは複雑な溶液をリポソームに封入して様々な細胞模倣系を調製するための最も成功した技術の1つである。この方法では、目的のタンパク質の混合物を内部緩衝液に添加し、これを後でリン脂質含有鉱物油溶液に乳化させて単層脂肪滴を形成する。所望のリポソームは、脂質/油水界面を横切る単層脂肪滴から生成される。この方法は、所望の脂質成分を含むリポソームへの濃縮アクチンポリマーのカプセル化を可能にし、生体模倣細胞骨格ネットワークの in vitro 再構成への道を開く。
Introduction
アクチン細胞骨格は、分子レベルの収縮性と力発生1,2,3を調整することによって、細胞の細胞内構造を構築する上で基本的な役割を果たす。その結果、細胞変形4、5、分裂6、遊走7、8、および接着9を含む多数の重要な細胞活動を媒介する。アクチンネットワークのインビトロ再構成は、近年10、11、12、13、14、15、16、17で大きな注目を集めている。再構成の目標は、生細胞内に存在する複雑な生化学的調節を欠いている細胞の最小モデルを構築することである。これは、特定の細胞内活動をプローブするための制御可能な環境を提供し、アクチン細胞骨格18、19の異なる成分の同定および分析を容易にする。さらに、リン脂質巨大単層小胞(GUV、リポソーム)内のインビトロアクチンネットワークのカプセル化は、半透過性の境界を有する閉じ込められたが変形可能な空間を提供する。細胞9、20、21、22内のアクチン機構の生理学的および機械的微小環境を模倣する。
リポソームを調製するための様々な方法の中で、脂質膜水和法(膨潤法としても知られる)は、最も初期の技術の1つである23。乾燥脂質膜は、緩衝液を添加して水和し、膜状の気泡を形成し、最終的に小胞24となる。より大きな小胞をより高い収率で製造するために、電形成法25として知られる膜水和法から進歩する改良された方法は、交流電界を印加して水和プロセス26を効率的に促進する。アクチン封入のためのこれらの水和ベースの方法の主な制限は、高濃度タンパク質のカプセル化効率が低く、かつ特定の脂質組成物とのみ適合性があることである24。この反転エマルジョン技術は、比較して、脂質成分およびタンパク質濃度に対する制限が少ない20、27、28、29である。この方法では、カプセル化のためのタンパク質の混合物が内部水性緩衝液に添加され、これは後で脂質含有鉱物油溶液中で乳化され、脂質単層液滴を形成する。次いで、単層脂肪滴は、遠心分離を介して別の脂質/油水界面を通過し、二重層脂質小胞(リポソーム)を形成する。この技術は、アクチンカプセル化のための最も成功した戦略の1つであることが証明されています24,30。これとは別に、パルス噴出31、32、過渡膜噴出33、およびcDICE法34を含むいくつかのマイクロ流体デバイス法がある。逆乳化法とマイクロ流体法の類似点は、利用される脂質溶媒(油)と、リポソームの外側小葉の形成のための脂質/油水界面の導入である。対照的に、マイクロ流体法によるリポソームの生成は、マイクロ流体デバイスのセットアップを必要とし、二重層の2つの小葉の間に閉じ込められた油を伴い、これは、油除去のための余分なステップを必要とする35。
この原稿では、以前に使用したように、逆エマルジョン技術を使用して、重合F-アクチンネットワークを封入したリポソームを調製した22。封入用のタンパク質混合物を、まず、アクチンをその球状(G)形態に維持するために、非重合条件を有する緩衝液に入れた。初期のアクチン重合を防ぐために、全プロセスを4°Cで実施し、後にサンプルを室温まで昇温させることによって引き起こされた。室温で一旦、アクチンは重合して糸状(F)形態になる。様々なアクチン結合タンパク質を内部水性緩衝液に添加して、タンパク質の機能性および特性を研究することができ、したがって、アクチンネットワークおよび膜表面との相互作用に関する洞察をさらに提供する。この方法は、最終リポソーム28、37のサイズに近い目的の様々なタンパク質36および大きな物体(微粒子、自走式マイクロスイマーなど)の封入にも適用することができる。
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Protocol
1. 緩衝液およびタンパク質溶液の調製
- 0.1 mM CaCl 2、10 mM HEPES (pH 7.5)、1 mM DTT、0.5 mM Dabco、320 mM スクロース、および 0.2 mM ATP を混合して、全容量 5 mL の水性内部非重合 (INP) バッファーを調製します。
- タンパク質ミックス(PM)を調製するには、11.2 μM 非蛍光 G-アクチン、2.8 μM 蛍光標識アクチン、および 0.24 μM Arp2/3 (材料表) の濃度で INP バッファーにタンパク質を添加します。F-アクチン層を形成するには、100 nM ゲルソリン、4 μM コフィリン、および 2.2 μM VCA-His を PM に加えます。対照実験として、PMを100μg/mLの蛍光色素で置き換えます(材料表)。
- 100 mM KCl、4 mM MgCl2、10 mM HEPES (pH 7.5)、1 mM DTT、0.5 mM Dabco、10 mM ATP、および 80 mM スクロースを混合して、全容量 5 mL の水性内部重合(IP)バッファー (水性) を調製します。
- INPバッファー(PMを含む)とIPバッファーを1:1の容量比で混合して最終バッファー(FB)を調製し、リポソーム内に内包される全容量30μLの内水溶液を得た。
- 10 mM HEPES (pH 7.5)、50 mM KCl、2mM MgCl 2、0.2 mM CaCl 2、2mM ATP、1 mM DTT、0.5 mM Dabco、212 mM グルコース、および 0.1 mg/mL β-カゼインを混合して、全容量 150 μL の水性アウトサイドバッファー (OB) を調製します。
注:OBの浸透圧は、OBの浸透圧がFB(20-60mOsm)の浸透圧よりもわずかに大きいことを保証するためにグルコースで調整することができます。FBの密度はOBよりわずかに高くなければなりません。
反転エマルジョン技術に基づくリポソームの調製
- 脂質-油混合物を調製する
- 100 μL の 25 mg/mL L-α-ホスファチジルコリン (非蛍光エッグPC、EPC とも呼ばれ、1% DHPE を含む) をガラスバイアルに入れます。クロロホルムをアルゴンガスで蒸発させ、バイアルの底に乾燥固体脂質膜(2.5mg)を残す。
- F-アクチン層を形成するには、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-{[n(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル}ニッケル塩(DOGS-NTA-Ni)をEPCとDOGS-NTA-Niの比率で10:1の比率で加え、クロロホルムの蒸発前に混合する。
- 2mLの鉱油を加え、脂質 - 油混合物を室温で1時間浴中で超音波処理して脂質を再懸濁させる。
注:超音波処理後の脂質 - 油混合物は、4°Cで1週間保持することができます。 使用前に再超音波処理が推奨されます。
- 100 μL の 25 mg/mL L-α-ホスファチジルコリン (非蛍光エッグPC、EPC とも呼ばれ、1% DHPE を含む) をガラスバイアルに入れます。クロロホルムをアルゴンガスで蒸発させ、バイアルの底に乾燥固体脂質膜(2.5mg)を残す。
- 目的のタンパク質を含む単層脂肪滴を調製するための最終緩衝液(FB /オイル)エマルジョンを調製する。
- プラスチックチューブに取り込んだ脂質-油混合物100 μLに、FBを10 μL加える。FB が 1 つの液滴に入っていることを確認します。
- ガラスシリンジを使用して、脂質 - 油 - FB混合物を引き出し、それを乳化するために複数回静かに上下に吸引する。最初に少量の脂質 - 油混合物を引き出し、次にシリンジの先端を液滴の周囲に配置してFB液滴を小さな液滴に分解する。白っぽくて濁ったエマルジョンが形成されるまで、上下の吸引を繰り返します。
- 30 μLのOBを別のプラスチックチューブに入れます。30μLの脂質-油混合物をOBの上に置き、それを約10分間放置して界面に脂質単層を発達させる。
注:脂質が荷電している場合、またはタンパク質が組み込まれている場合、このステップの持続時間は延長されるべきである38。 - リポソームを調製する
- 50 μLのFB/オイルエマルジョン(ステップ2.2)をステップ2.3のチューブの上部油相に慎重に加えます。
- プラスチックチューブを100 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 リポソーム形成のために最適化するために時間と遠心分離速度を変化させる。
注:遠心分離後、上部の油相は透明であるべきであり、下部OB(リポソームを含む)はわずかに濁っているべきである。 - 油相をピペットで慎重に取り除きます。必要に応じて余分なボリュームを吸引します。リポソーム相の上にオイルのメニスカスを作らないように、ピペットチップをチューブの側面に置かないようにしてください。
- 新しいピペットで、ピペットチップを残りの底相にゆっくりと突き刺し、水性ボリュームを吸引してリポソームを回収する。
注:オイルを組み込むよりも、ボリュームを失う方が良いです。油分を含めるとリポソームが破裂し、内部成分が外部バッファーに放出されます。せん断を減らすためにピペットの先端を切断します。
3. 顕微鏡観察
- 100 μL の OB をインキュベーションチャンバー (12 mm の丸いカバーグラスを含む 4 ウェルプレート) のウェルに注ぎます。回収したリポソームをOBに静かに沈着させ(ステップ2.4.4)、チャンバーの上に別のカバースリップを置きます。
注:OBは、ガラス表面を不動態化し、リポソーム20間の固着を最小限に抑えるために、β-カゼインを含有する。 - 63倍の油浸対物レンズを用いて共焦点顕微鏡でリポソームを観察します。488 nm、647 nm、および 561 nm のレーザーラインを使用して、蛍光標識脂質、封入蛍光色素、および封入蛍光標識アクチンをそれぞれ観察します。目的のフレームをキャプチャし、TIFF形式で画像を保存します。
- ImageJ/Fiji39で画像を処理および分析します。ImageJ/Fijiの新規ユーザー向けには、オンラインチュートリアルをご用意しています( 資料表を参照)。
- ImageJ/Fijiソフトウェアを使用してTIFFファイルを開きます。
- 画像に移動し>明るさ/コントラスト>調整します。画像の明るさとコントラストを目的のスケールに調整するには、「最小」と「最大」の設定、および「明るさ」スライダと「コントラスト」スライダを調整します。
- ツールバーの 長方形 選択ツールをクリックし、関心領域(ROI)を選択します。 [画像>トリミング] に移動してROIをトリミングします。
- [分析] > [スケールの設定] に移動します。ポップアップウィンドウで、「ピクセル縦横比」フィールドに「1.0」と入力し、「長さの単位」として μm を設定します。「ピクセル単位の距離」フィールドに、画像の幅をピクセル単位で入力します。[既知の距離] フィールドに、実際の画像幅をミクロン単位で入力します。
- リポソームのサイズを測定するには、ツールバーの 楕円形 選択ツールを使用して、リポソームの端に沿って円を描きます。 [分析>測定] に移動して、リポソームの直径を計算できる円の面積を測定します。
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Representative Results
反転エマルジョン技術に基づくリポソームの調製を、 図1にグラフィカルかつ概略的に例示する。
まず、リン脂質(EPC)および蛍光脂質(DHPE)で構成された空(ベア)リポソーム(直径約5〜50μm)を調製した。対照実験として、明るい遠赤色蛍光色素を裸のリポソーム内に封入した。液滴の周囲に脂質単層が首尾よく形成されたかどうかは、図2Aに示すように、エマルジョン中に蛍光色素を組み込んだ単層脂肪滴を観察することによって決定することができた。リポソームの生成の成功は、共焦点顕微鏡を用いた488nmレーザー下で、緑色蛍光脂質二重層(DHPEと脂質の結合)である薄い円形環の可視化によって確認することができた(図2A、右端のパネル)。蛍光色素の封入を確認するには、リポソームの内部環境を、遠赤色蛍光色素(材料表)のために、647nmレーザー下で均一に蛍光化する必要があります(図2A;オーバーレイ画像)。
単層脂肪滴の内部に封入されたアクチンの異なる形態が 図2Bに示されている。左から右への画像は、球状アクチン(G-アクチン)、糸状アクチン(F-アクチン)、最終緩衝液にVCA-His、膜にニッケル脂質を添加して薄いF-アクチン層を形成するアクチン、最終緩衝液にVCA-His、コフィリン、ゲルソリンを添加して薄いF-アクチン層を形成し、膜にニッケル脂質を示す。
次に、精製されたGアクチンおよび関連するFアクチン結合タンパク質をリポソーム内に封入した。上記と同じ膜成分(DHPEと混合されたEPC)から構成され、ここでのリポソームは直径が〜5〜50μmであった。リポソームの形成は、図3A、Bに示す薄い緑色の円形リングによって視覚化することができた。アクチン重合は、試料を室温まで昇温させることによって誘発された。図3Aに示すように、リポソーム内部の再構成されたF-アクチンネットワーク(20%蛍光標識アクチンを有する)は不均一であり、アクチンフィラメントの分岐ネットワーク構造として現れる。分岐構造は、VCA-His 40,41,42,43,44,45とともに、アクチンフィラメントの核生成と分岐を同時に制御するArp2/3複合体の導入によって引き起こされた。
最後に、F-アクチン皮質生物模倣システムが作成されました。リポソーム22の二重層の内側小葉に、薄いが緻密に分岐したF-アクチン層が作成され、蛍光シェルとして可視化することができた(図3C)。この場合、さらに、VCA−His、コフィリン、およびゲルソリンをリポソームに封入した。ニッケル脂質は脂質膜の成分に必要であった。WASP断片であるVCA-Hisは、脂質膜のニッケル脂質との相互作用においてヒスチジンタグを担持する。その間、Arp2/3複合体20,46,47,48を募集している。その結果、Arp2/3複合体によって核形成されたアクチンは、コフィリンおよびゲルソリンの存在下で膜の内層に沿って被覆されたF-アクチン層を生成する。
図1:反転エマルジョン技術に基づくリポソームの調製。 (a)リポソーム調製物は、2つの工程からなる。ステップ1:目的のタンパク質を含む最終緩衝液(FB)の10 μLの液滴を、100 μLのリン脂質 - 油混合物に1:10の比率で添加し、ガラスシリンジで上下に穏やかに吸引することによって懸濁した。単層脂肪滴を含む溶液は、前後の吸引後に白っぽくなった。ステップ2:別のプラスチックチューブに、数マイクロリットルの脂質-油混合物を同量のOBの上に置き、約10分間座らせて、OB/油界面に脂質単層を発達させた。工程1からのエマルジョンを工程2からの油相の上に注ぎ、4°Cで遠心分離(100 x g; 15分)した。 遠心分離後、上部の油溶液は透明であるべきであり、下部のOB溶液(リポソームを含む)はわずかに濁っているべきである。(b)反転エマルジョンからのリポソーム調製物の概略図。上部の白っぽいエマルジョンには、内部に分岐したアクチンネットワークを組み込んだ単層脂肪滴が含まれていました。遠心分離中、単層脂肪滴はOB/オイル界面を通過して外側の小葉を形成し、リポソームが作成され、プラスチックチューブの底に蓄積された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:単層脂肪滴の顕微鏡像(A)エマルジョン中に蛍光色素を組み込んだ単層脂肪滴。左から右への画像は、DICチャネル、蛍光640nmチャネル、DICおよび640nmチャネルのオーバーレイ、および蛍光488nmチャネルの下の単層脂肪滴をそれぞれ示す。(b)蛍光561nmチャネル下の単層脂肪滴の内部に異なる形態の封入アクチン。左から右への画像は、球状アクチン(G-アクチン)、糸状アクチン(F-アクチン)、最終バッファーにVCA-Hisおよびニッケル脂質を膜に添加して薄いF-アクチン層を形成するアクチン、および最終バッファーにVCA-His、コフィリン、ゲルソリンを添加して薄いF-アクチン層を形成するアクチン、および膜にニッケル脂質を示す。スケールバーは、倍率63倍で10μmである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:リポソーム内部におけるアクチンネットワークの封入の顕微鏡像 (A)重合分岐(Arp 2/3有核)F-アクチンネットワークを内包するリポソーム。左から右へ:蛍光488nmチャンネル(左)、蛍光561nmチャンネル(中央)、オーバーレイ(右)。(b)重合分枝状(Arp2/3有核)F−アクチンネットワークを封入するリポソームの懸濁液の代表的な結果。左から右へ:蛍光488 nmチャンネル(左)、蛍光561 nmチャンネル(中央)、オーバーレイ(右)。(c)リポソームの脂質膜の内層に沿って被覆された薄いが緻密なF-アクチン層の形成の外観。上から下へ:蛍光488nmチャネル(上)、蛍光561nmチャネル(中央)、オーバーレイ(下)。スケールバーは、倍率63倍で10μmである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
いくつかの重要なステップは、調製プロセス中の高収率のリポソームの成功を決定する。油中の脂質膜を完全に溶解するには、ガラスバイアルの底部の脂質膜が完全に消失するまでサンプルを超音波処理しなければならない。超音波処理の後、脂質 - 油混合物は、脂質分子がさらに分散するために暗条件下で室温で一晩保存されなければならない29。混合物は、4°Cで最大1週間保存することができる。目的のタンパク質を含む単層脂肪滴を含むFB /オイルエマルジョンを調製する場合、気泡を導入しないように、脂質 - オイル - FB混合物をガラスシリンジを通して穏やかに前後にポンピングする必要があります。このプロセスの間、1つの大きな液滴は、数回の繰り返しの後、ガラスシリンジの先端で剪断され、多数の小さな液滴(直径約5〜100μm)に切り取られる。混合物は、プロセス30の後に白っぽくなければならない。リン脂質の品質を確認するために、FB含有液滴の周囲に脂質単層が首尾よく形成されたか否かと、図2Aに示すように蛍光色素を組み込んだ単層脂肪滴をエマルジョン中で調べた。遠心分離中に単層脂肪滴がOB/油界面を通過することを確実にし、OB中の収集されたリポソームがガラス表面に沈降できるようにするには、FBの密度をOBよりわずかに高くすべきである。そこで、スクロース及びグルコースを、それぞれ内(FB)及び外(OB)水溶液の主成分として選択した。前回の作業では、デキストランを使用して内水溶液20の密度を調整したが、これはこのプロトコールには含まれない。さらに、OBの浸透圧は、以前の研究20,22で報告されたように、OBの浸透圧がFB(20〜60mOsm)の浸透圧よりもわずかに大きくなるようにグルコースで調整した。大きな浸透圧差は、リポソームの収縮(OBの浸透圧がFBの浸透圧よりも大きい場合)または破裂(FBの浸透圧がOBの浸透圧よりも大きい場合)につながった。浸透圧計を使用して、バッファーの浸透圧をチェックしました。プロトコールでは、画像化チャンバのプラスチックチューブ表面およびガラス表面の両方を不動態化し、リポソーム間の固着を最小限に抑えるために、OB中にβ-カゼインを添加した20、49。油液(すなわち、脂質溶媒)として鉱油を用いた。ドデカン50、流動パラフィン30、スクワラン51などを含む異なる脂質溶媒が他の場所で報告されている。したがって、粘度の違いおよびそれらがリポソーム表面張力にもたらす影響のために、様々な脂質溶媒に対して異なる遠心分離速度および持続時間が使用される。単分子層では、これらの荷電分子が互いに反発し、脂質/油混合物とOB38との間の界面で拡散し、良好に組織化するためにより多くの時間を必要とするため、荷電脂質についてはステップ2.3の持続時間を延長する必要がある。目的のタンパク質と共に組み込まれた脂質の場合、より良好な単分子層形成52を確実にするために、このステップの延長も推奨される。重合F-アクチンネットワークを内包するリポソームのリポソーム収率に関しては、視野(100 μm x 100 μm)あたりのリポソーム数は、平均直径20 μmで約5〜10個である。典型的な顕微鏡サンプルの縮小画像を図3Bに示す。反転エマルジョン法によって生成されたリポソームのよりズームアウトされた共焦点画像は、様々なパラメータ(濃度差、遠心分離速度/時間、脂質濃度、pH、温度など)がリポソームの高収率生産のために最適化された最近の研究52で見出すことができる。
F-アクチンネットワークの再構成のためには、アデノシン三リン酸(ATP)、ジチオスレイトール(DTT)、関連する塩、およびpH条件の適切な濃度を選択することが不可欠である。再構成されたF-アクチンネットワークの中間チェックポイントは、内部にアクチンが封入された単層脂肪滴を観察することによって行うことができる。単層脂肪滴の内部に封入されたアクチンの異なる形態が図2Bに示されている。アクチン重合は、以前に報告されたように、>20 mM K+塩および>0.2 mM Mg2+塩で起こり、pHは6.5〜8.5の間で安定化される。リポソームのイメージングの前に、早期アクチン重合を防ぐために、すべての溶液を氷上に保持した。試料を室温で画像化し、アクチン重合を誘発した。再構成されたF-アクチンネットワークのアーキテクチャは、主にArp2/3複合体の活性によって調節される。Arp 2/3複合体は、既存のマザーフィラメントの側面からアクチンフィラメントを核形成および分岐させ、樹枝状構造を生成する56,57。ニッケル脂質(DOGS-NTA-Ni)およびVCA-Hisは、F-アクチン層の形成に重要である。VCA-Hisは核生成促進因子として働き、これは膜22,58でニッケル脂質と連結されている。次いで、分岐したF-アクチンネットワークがVCA-Hisから有核化されてArp2/3複合体を促進し、その結果、脂質膜の内側小葉に緻密なF-アクチンシェルが形成される。リポソーム内のVCA-Hisの濃度は、F-アクチン層の厚さを決定する。アクチン調節タンパク質(コフィリンおよびゲルソリン)の添加はまた、F-アクチン層の形成を促進する。コフィリンはアクチンフィラメントを切断してフィラメント末端の数を増やし、ゲルソリンはアクチンフィラメントの有刺鉄線末端に結合して成長を制限します。これにより、コフィリンおよびゲルソリンの存在下で、より多くのフィラメントをArp2/3によって核形成し、次いでVCA-HisによってリクルートしてF-アクチン層を形成することができる。
タンパク質封入のためのエマルジョン移動法に基づく同様の論文が近年28、30、34で公開されている。ここでのプロトコルとこれらの論文のプロトコルとの大きな違いの1つは、リポソーム用の一次脂質の選択です。本研究では、L-α-ホスファチジルコリン(EPC、POPC59を約60%含有する異なるホスファチジルコリン種の混合物)をリポソーム膜の主成分として用いている。F-アクチン層を形成するために、EPCとニッケル脂質(DOGS-NTA-Ni)の混合物を10:1の比率で使用した。以前の研究では、リポソームをポリヒスチジンコーティングガラス上に広げ、EPC、コレステロール、およびニッケル脂質を53:37:1020の比率で混合した。これに対して、夏目らとBashirzadehらは、ミクロスフェア28とファスチン-アクチンバンドル34をそれぞれ封入するためにジオレオイルホスホコリン(DOPC、単一種類のリン脂質)を選択し、藤井らは、リポソームベースの膜タンパク質合成技術を確立するために、一次脂質として1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC、純粋な合成リン脂質)を推奨した30。.一次脂質の選択は、リポソームの物理的特性に影響を及ぼす。例えば、アシル鎖の不飽和度が増加するにつれて(すなわち、POPC
この研究とBashirzadeh et al.34の最近の出版物との類似点は、アクチンカプセル化の同じトピックに該当します。一方、明確な違いがあります。Bashirzadehらは、3Dプリントされた回転チャンバを利用した修正されたcDICEアプローチを報告した。ここでは、シリンジと遠心分離機を用いたシンプルで伝統的な逆エマルジョン転写法を採用しています。これら2つの方法の両方は、リポソームの高収率を生成し、大きな生体分子24に対して高い封入効率を有する。上記のような脂質成分の違いに加えて、カプセル化されたアクチンネットワークのアーキテクチャも同様に変化する。Bashirzadehらは、リポソーム内にファスチン-アクチン束を封入し、この研究では、Arp2/3複合体によって誘発される分岐ネットワークを封入した。さらに、VCA-Hisの存在下で皮質生物模倣系を作り出すためのF-アクチン層の形成がここで詳述されている。
ここで報告される方法には、2 つの制限があります。一つは、in vitroで再構成されたアクチンネットワークを組み込んだリポソームのサイズを正確に操作することができず(直径5〜50μmまで変化)、電気形成法と比較して収率が低いことである。水油ベースの方法のもう一つの制限は、微量の油が二重層小葉24の間に閉じ込められることである。これらの生体模倣リポソーム24、35、62、63の膜厚または生体適合性に有意に影響しないが、油挿入リポソームの膜動態は変化させてもよい62。この方法では、アクチン核剤Arp2/3が組み込まれている。将来の研究は、他の細胞骨格タンパク質64、65、66、67、ホルミン68などの核剤、またはミオシンII69などの分子モーターを含み得る。
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Disclosures
著者は利益相反がないと宣言しています。
Acknowledgments
我々は、ARO MURI W911NF-14-1-0403 to M.P.M.、米国国立衛生研究所(NIH)R01 1R01GM126256からM.P.M.、米国国立衛生研究所(NIH)U54 CA209992、NIH RO1 GM126256、NIH U54 CA209992、ミシガン大学/ジェネンテック、SUBK00016255及びヒューマン・フロンティア・サイエンス・プログラム(HFSP)の助成金番号RGY0073/2018からM.P.M.への資金提供を認める。この資料に記載されている意見、所見、結論、または推奨事項は著者のものであり、必ずしもARO、NIH、またはHFSPの見解を反映するものではありません。S.C.は、V.ヤダヴ、C.ムレサン、S.アミリとの実りある議論を認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni) | Avanti Polar Lipids Inc. | 231615773 | Nickel Lipid |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane | Sigma | D27802-25G | DABCO |
| Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton, Inc | AKL99-D | non-fluorescent G-actin |
| Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton, Inc | AR05 | fluorescently labeled actin |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383-10G | ATP |
| Alexa Fluor 647 dye | ThermoFisher | fluorescent dye | |
| Andor iQ3 | Andor Technologies | control and acquisition software for confocal microscope | |
| Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain | Cytoskeleton, Inc | RP01P-A | Arp 2/3 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 10035048 | CaCl2 |
| Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) | Quorum Technologies | incubation chamber | |
| Cofilin protein: human recombinant | Cytoskeleton, Inc | CF01-C | cofilin |
| Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) | Andor Technologies | LEICA DMi8 | |
| D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA | Sigma | G7528 | glucose |
| Dithiothreitol | DOT Scientific | DSD11000-10 | DTT |
| Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant | Cytoskeleton, Inc | HPG6 | gelsolin |
| Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip | Cole-Parmer | UX-07940-53 | glass syringe |
| HEPES | AmericanBio | 7365-45-9 | |
| ImageJ/Fiji | https://imagej.net/tutorials/ | ||
| L-alpha-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids Inc. | 97281442 | EPC |
| Magnesium chloride | Sigma | 7786303 | MgCl2 |
| Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | Sigma | 8042475 | mineral oil |
| N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) | VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests | ||
| Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) | Thermo Fisher | O12650 | DHPE |
| Potassium chloride | Sigma | 7447407 | KCl |
| Sucrose | Sigma | 57-50-1 | sucrose |
| β-Casein from bovine milk | Sigma | C6905-250MG |
References
- Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
- Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L.
- Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
- Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103 (2022).
- Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
- Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
- Bray, D., White, J.
- Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
- Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
- Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
- Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
- Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
- McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
- Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R.
- Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
- Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
- Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745 (2021).
- Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
- Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
- Murrell, M., et al.
- Liu, A. P., et al.
- Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
- Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S.
- Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103 (2002).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282 (2017).
- Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
- Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
- Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
- Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
- Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
- Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
- Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
- Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
- Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. Methods in Cell Biology. 128, Elsevier. 271-285 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
- Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
- Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
- Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
- Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
- Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
- Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
- Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
- Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245 (2020).
- Schäfer, E., Kliesch, T. -T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
- Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
- Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
- Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
- Vale, R. Reconstituting the Cytoskeleton. , Academic Press. (2014).
- Pardee, J. D., Spudich, J. A.
- Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 27 (20), 7766-7772 (1988).
- Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
- Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
- Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
- Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
- Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
- Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
- Deng, N. -N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T.
- Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
- Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
- Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
- Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
- Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243 (2019).
- Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Methods in Enzymology. 540, Elsevier. 265-282 (2014).
