Summary
In diesem Manuskript demonstrieren wir die experimentellen Techniken zur Verkapselung des F-Aktin-Zytoskeletts in riesige unilamellare Lipidvesikel (auch Liposomen genannt) und die Methode zur Bildung einer Kortex-bioimitierenden F-Aktin-Schicht am inneren Blättchen der Liposomenmembran.
Abstract
Das Aktinzytoskelett, die wichtigste mechanische Maschinerie in der Zelle, vermittelt zahlreiche wesentliche physikalische zelluläre Aktivitäten, einschließlich Zellverformung, Teilung, Migration und Adhäsion. Die Untersuchung der Dynamik und Struktur des Aktinnetzwerks in vivo wird jedoch durch die biochemische und genetische Regulation innerhalb lebender Zellen erschwert. Um ein minimales Modell ohne intrazelluläre biochemische Regulation zu erstellen, wird Aktin in riesige unilamellare Vesikel (GUVs, auch Liposomen genannt) eingekapselt. Die biomimetischen Liposomen sind zellgroß und ermöglichen einen quantitativen Einblick in die mechanischen und dynamischen Eigenschaften des Zytoskelett-Netzwerks, was einen gangbaren Weg für die synthetische Bottom-up-Biologie eröffnet. Um Liposomen für die Verkapselung zu erzeugen, wird die invertierte Emulsionsmethode (auch als Emulsionstransfermethode bezeichnet) verwendet, eine der erfolgreichsten Techniken zur Verkapselung komplexer Lösungen in Liposomen, um verschiedene zellnachahmende Systeme herzustellen. Bei dieser Methode wird dem inneren Puffer eine Mischung interessanter Proteine zugegeben, die später in einer phospholipidhaltigen Mineralöllösung zu einschichtigen Lipidtröpfchen emulgiert wird. Die gewünschten Liposomen werden aus einschichtigen Lipidtröpfchen erzeugt, die eine Lipid/Öl-Wasser-Grenzfläche kreuzen. Diese Methode ermöglicht die Verkapselung konzentrierter Aktinpolymere in die Liposomen mit gewünschten Lipidkomponenten und ebnet den Weg für die in vitro Rekonstitution eines bioimitierenden Zytoskelett-Netzwerks.
Introduction
Das Aktinzytoskelett spielt eine grundlegende Rolle beim Aufbau der intrazellulären Architektur der Zelle, indem es die Kontraktilität auf molekularer Ebene und die Krafterzeugung koordiniert 1,2,3. Infolgedessen vermittelt es zahlreiche essentielle zelluläre Aktivitäten, einschließlich Zelldeformation4,5, Division6, Migration 7,8 und Adhäsion9. Die in vitro Rekonstitution von Aktinnetzwerken hat in den letzten Jahren enorme Aufmerksamkeit erlangt 10,11,12,13,14,15,16,17. Das Ziel der Rekonstitution ist es, ein Minimalmodell der Zelle ohne die komplexe biochemische Regulation zu erstellen, die in lebenden Zellen existiert. Dies bietet eine kontrollierbare Umgebung zur Untersuchung spezifischer intrazellulärer Aktivitäten und erleichtert die Identifizierung und Analyse verschiedener Komponenten des Aktinzytoskeletts18,19. Darüber hinaus bietet die Verkapselung von in vitro Aktinnetzwerken in Phospholipid-Riesen-Unilamellenvesikeln (GUVs, Liposomen) einen begrenzten, aber deformierbaren Raum mit einer semipermeablen Grenze. Es ahmt die physiologische und mechanische Mikroumgebung der Aktinmaschinerie innerhalb der Zelle 9,20,21,22 nach.
Unter verschiedenen Methoden zur Herstellung von Liposomen ist die Lipidfilmhydratationsmethode (auch bekannt als Quellmethode) eine der frühesten Techniken23. Der trockene Lipidfilm hydratisiert unter Zugabe von Puffern und bildet membranöse Blasen, die schließlich zu Vesikeln werden24. Um größere Vesikel mit einer höheren Ausbeute zu erzeugen, wendet ein verbessertes Verfahren, das von der Filmhydratationsmethode fortschreitet, bekannt als Elektrobildungsmethode25, ein elektrisches Wechselstromfeld an, um den Hydratationsprozess26 effizient zu fördern. Die Haupteinschränkungen dieser hydratationsbasierten Methoden zur Aktinverkapselung bestehen darin, dass sie eine geringe Verkapselungseffizienz von hochkonzentrierten Proteinen aufweist und nur mit spezifischen Lipidzusammensetzungen kompatibel ist24. Die invertierte Emulsionstechnik hat im Vergleich dazu weniger Einschränkungen für Lipidkomponenten und Proteinkonzentrationen20,27,28,29. Bei diesem Verfahren wird eine Mischung von Proteinen zur Verkapselung in den inneren wässrigen Puffer gegeben, der später in einer lipidhaltigen Mineralöllösung emulgiert wird, wobei Lipid-Monoschicht-Tröpfchen gebildet werden. Die einschichtigen Lipidtröpfchen durchqueren dann durch Zentrifugation eine weitere Lipid/Öl-Wasser-Grenzfläche, um zweischichtige Lipidvesikel (Liposomen) zu bilden. Diese Technik hat sich als eine der erfolgreichsten Strategien zur Aktinverkapselung24,30 erwiesen. Unabhängig davon gibt es einige mikrofluidische Gerätemethoden, einschließlich gepulstes Jetting31,32, transienten Membranauswurf 33 und das cDICE-Verfahren 34. Die Ähnlichkeiten zwischen der inversen Emulsionsmethode und der mikrofluidischen Methode sind das verwendete Lipidlösungsmittel (Öl) und die Einführung einer Lipid/Öl-Wasser-Grenzfläche für die Bildung des äußeren Blattes von Liposomen. Im Gegensatz dazu erfordert die Erzeugung von Liposomen durch das mikrofluidische Verfahren einen Aufbau mikrofluidischer Vorrichtungen und wird von Öl begleitet, das zwischen den beiden Blättchen der Doppelschicht eingeschlossen ist, was einen zusätzlichen Schritt zur Ölentfernung erfordert35.
In diesem Manuskript verwendeten wir die invertierte Emulsionstechnik, um Liposomen herzustellen, die ein polymerisiertes F-Aktin-Netzwerk einkapseln, wie zuvor verwendet22. Die Proteinmischung für die Verkapselung wurde zunächst in einen Puffer mit nichtpolymerisierenden Bedingungen gegeben, um Aktin in seiner globulären (G) Form zu erhalten. Der gesamte Prozess wurde bei 4 °C durchgeführt, um eine frühe Aktinpolymerisation zu verhindern, die später ausgelöst wurde, indem die Probe auf Raumtemperatur erwärmt wurde. Bei Raumtemperatur polymerisiert das Aktin in seine filamentöse (F) Form. Eine Vielzahl von Aktin-bindenden Proteinen kann der inneren wässrigen Pufferlösung hinzugefügt werden, um Proteinfunktionalitäten und -eigenschaften zu untersuchen und so weitere Einblicke in ihre Interaktion mit dem Aktinnetzwerk und der Membranoberfläche zu erhalten. Dieses Verfahren kann auch auf die Verkapselung verschiedener Proteine von Interesse36 und großer Objekte (Mikropartikel, selbstfahrende Mikroschwimmer usw.) nahe der Größe der endgültigen Liposomen 28,37 angewendet werden.
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Protocol
1. Herstellung von Puffern und Proteinlösungen
- Bereiten Sie den wässrigen inneren Nichtpolymerisationspuffer (INP) in einem Gesamtvolumen von 5 ml durch Mischen von 0,1 mM CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 320 mM Saccharose und0,2 mM ATP vor.
- Bereiten Sie den Proteinmix (PM) vor, indem Sie dem INP-Puffer bei 4 °C Proteine mit folgenden Konzentrationen hinzufügen: 11,2 μM nicht-fluoreszierendes G-Aktin, 2,8 μM fluoreszenzmarkiertes Aktin und 0,24 μM Arp2/3 (Materialtabelle). Um eine F-Aktin-Schicht zu bilden, fügen Sie dem PM 100 nM Gelsolin, 4 μM Cofilin und 2,2 μM VCA-His hinzu. Als Kontrollexperiment PM durch 100 μg/ml Fluoreszenzfarbstoff ersetzen (Table of Materials).
- Der wässrige innere Polymerisationspuffer (IP) (wässrig) wird in einem Gesamtvolumen von 5 mL durch Mischen von 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP und 80 mM Saccharose hergestellt.
- Bereiten Sie den Endpuffer (FB) vor, indem Sie INP-Puffer (mit PM) und IP-Puffer in einem Volumenverhältnis von 1: 1 mischen, um die innere wässrige Lösung in einem Gesamtvolumen von 30 μL zu erhalten, das im Liposom verkapselt wird.
- Bereiten Sie den wässrigen Außenpuffer (OB) in einem Gesamtvolumen von 150 μL durch Mischen von 10 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM Glucose und0,1 mg/ml β-Kasein vor.
HINWEIS: Die Osmolarität des OB kann mit Glukose eingestellt werden, um sicherzustellen, dass der osmotische Druck des OB etwas größer ist als der des FB (20-60 mOsm). Die Dichte des FB sollte etwas höher sein als der OB.
2. Herstellung von Liposomen auf Basis der inversen Emulsionstechnik
- Lipid-Öl-Mischung vorbereiten
- 100 μL 25 mg/ml L-α-Phosphatidylcholin (nicht fluoreszierendes Ei-PC, auch EPC genannt, einschließlich 1% DHPE) in eine Durchstechflasche aus Glas geben. Verdampfen Sie Chloroform mit Argongas, wobei ein trockener fester Lipidfilm (2,5 mg) am Boden der Durchstechflasche verbleibt.
- Um eine F-Aktinschicht zu bilden, wird 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiaessigsäure]succinyl}-nickelsalz (DOGS-NTA-Ni) im Verhältnis 10:1 von EPC zu DOGS-NTA-Ni gegeben und vor dem Verdampfen von Chloroform gemischt.
- Fügen Sie 2 ml Mineralöl hinzu und beschallen Sie das Lipid-Öl-Gemisch bei Raumtemperatur in einem Bad für 1 h, um die Lipide wieder zu suspendieren.
HINWEIS: Das Lipid-Öl-Gemisch nach der Beschallung kann 1 Woche bei 4 °C aufbewahrt werden. Eine Beschallung wird vor dem Gebrauch empfohlen.
- 100 μL 25 mg/ml L-α-Phosphatidylcholin (nicht fluoreszierendes Ei-PC, auch EPC genannt, einschließlich 1% DHPE) in eine Durchstechflasche aus Glas geben. Verdampfen Sie Chloroform mit Argongas, wobei ein trockener fester Lipidfilm (2,5 mg) am Boden der Durchstechflasche verbleibt.
- Bereiten Sie eine Final Buffer in Öl (FB / Öl) Emulsion zur Herstellung von Monolayer-Lipidtröpfchen vor, die das interessierende Protein enthalten.
- Zu 100 μL Lipid-Öl-Gemisch in einem Kunststoffröhrchen 10 μL FB hinzufügen. Stellen Sie sicher, dass sich FB in einem Tröpfchen befindet.
- Verwenden Sie eine Glasspritze, ziehen Sie die Lipid-Öl-FB-Mischung und saugen Sie sie mehrmals vorsichtig auf und ab, um sie zu emulgieren. Ziehen Sie zuerst eine kleine Menge Lipid-Öl-Gemisch und dann das FB-Tröpfchen, indem Sie die Spitze der Spritze an den Rand des Tröpfchens legen, um es in winzige Tröpfchen aufzubrechen. Wiederholen Sie die Auf- und Abaspiration, bis sich eine weißliche und trübe Emulsion gebildet hat.
- Geben Sie 30 μL OB in ein separates Kunststoffröhrchen. Geben Sie 30 μL der Lipid-Öl-Mischung auf OB und lassen Sie sie ~10 Minuten ruhen, um eine Lipidmonoschicht an der Grenzfläche zu entwickeln.
HINWEIS: Wenn die Lipide geladen sind oder das Protein eingebaut ist, sollte die Dauer dieses Schritts verlängert werden38. - Liposomen vorbereiten
- Geben Sie vorsichtig 50 μL der FB/Ölemulsion (Schritt 2.2) in die obere Ölphase des Röhrchens aus Schritt 2.3.
- Zentrifugieren Sie das Kunststoffröhrchen bei 100 x g für 15 Minuten bei 4 °C. Variieren Sie Zeit und Zentrifugationsgeschwindigkeit, um die Liposomenbildung zu optimieren.
HINWEIS: Nach der Zentrifugation sollte die obere Ölphase klar sein und der untere OB (mit Liposomen) sollte leicht trüb sein. - Entfernen Sie die Ölphase vorsichtig per Pipette. Bei Bedarf zusätzliches Volumen absaugen. Stellen Sie sicher, dass Sie die Pipettenspitze nicht an die Seite des Röhrchens legen, um zu vermeiden, dass ein Meniskus aus Öl auf der Liposomenphase entsteht.
- Mit einer neuen Pipette stecken Sie die Pipettenspitze langsam in die verbleibende untere Phase und saugen Sie das wässrige Volumen ab, um Liposomen zu sammeln.
HINWEIS: Es ist besser, Volumen zu verlieren, als das Öl einzuarbeiten. Der Einschluss von Öl führt dazu, dass Liposomen reißen und die internen Komponenten in den externen Puffer freigesetzt werden. Schneiden Sie die Spitze einer Pipette ab, um die Scherung zu reduzieren.
3. Mikroskopische Beobachtung
- Gießen Sie 100 μL OB in die Vertiefung einer Inkubationskammer (4-Well-Platte mit 12 mm runden Deckgläsern). Die gesammelten Liposomen (Schritt 2.4.4) werden vorsichtig in OB gegeben und dann ein weiteres Deckglas auf die Kammer gelegt.
HINWEIS: Der OB enthält das β-Kasein, um die Glasoberfläche zu passivieren und das Anhaften zwischen den Liposomen20 zu minimieren. - Beobachten Sie Liposomen mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 63-fachen Öl-Immersionsobjektiv. Verwenden Sie 488 nm, 647 nm und 561 nm Laserlinien, um fluoreszenzmarkiertes Lipid, verkapselten Fluoreszenzfarbstoff bzw. verkapseltes fluoreszierend markiertes Aktin zu beobachten. Erfassen Sie die gewünschten Frames und speichern Sie die Bilder im TIFF-Format.
- Verarbeiten und analysieren Sie Bilder in ImageJ/Fiji39. Für neue Benutzer von ImageJ/Fiji steht ein Online-Tutorial zur Verfügung (siehe Materialtabelle).
- Öffnen Sie die TIFF-Datei mit der ImageJ/Fiji-Software.
- Gehen Sie zu Bild > passen Sie > Helligkeit/Kontrast an. Passen Sie die Helligkeit und den Kontrast des Bildes auf den gewünschten Maßstab an, indem Sie die Einstellungen Minimum und Maximum sowie die Schieberegler Helligkeit und Kontrast anpassen.
- Klicken Sie in der Symbolleiste auf das Auswahlwerkzeug Rechteck und wählen Sie den gewünschten Bereich (ROI) aus. Gehen Sie zu Bild > Zuschneiden , um den ROI zu erhöhen.
- Wechseln Sie zu Analysieren > festgelegten Maßstab. Geben Sie im Popup-Fenster 1.0 in das Feld Pixel-Seitenverhältnis ein und legen Sie μm als Längeneinheit fest. Geben Sie im Feld Abstand in Pixel die Bildbreite in Pixel ein. Geben Sie im Feld Bekannte Entfernung die tatsächliche Bildbreite in Mikrometern ein.
- Um die Größe des Liposoms zu messen, zeichnen Sie mit dem Auswahlwerkzeug "Oval " in der Symbolleiste einen Kreis entlang der Kante des Liposoms. Gehen Sie zu Analysieren > Messen , um die Fläche des Kreises zu messen, aus der der Durchmesser des Liposoms berechnet werden kann.
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Representative Results
Die Herstellung von Liposomen auf Basis der inversen Emulsionstechnik ist in Abbildung 1 grafisch und schematisch dargestellt.
Zunächst wurden leere (nackte) Liposomen (~5-50 μm Durchmesser) hergestellt, die aus Phospholipid (EPC) und fluoreszierendem Lipid (DHPE) zusammengesetzt waren. Ein heller, tiefroter Fluoreszenzfarbstoff wurde als Kontrollexperiment in nackte Liposomen eingekapselt. Ob sich eine Lipidmonoschicht erfolgreich in der Peripherie des Tröpfchens gebildet hat, konnte durch Beobachtung von Monolayer-Lipidtröpfchen bestimmt werden, die fluoreszierenden Farbstoff in die Emulsion einbauen, wie in Abbildung 2A gezeigt. Die erfolgreiche Liposomenerzeugung konnte durch die Visualisierung des dünnen kreisförmigen Rings, der grün fluoreszierenden Lipiddoppelschicht (Konjugation von Lipiden mit DHPE), unter 488 nm-Laser mittels konfokaler Mikroskopie verifiziert werden (Abbildung 2A, ganz rechts). Um die Verkapselung des Fluoreszenzfarbstoffs zu bestätigen, sollte die innere Umgebung der Liposomen unter einem 647-nm-Laser (Abbildung 2A; Overlay-Bild) aufgrund des tiefroten Fluoreszenzfarbstoffs gleichmäßig fluoreszierend sein (Table of Materials).
Verschiedene Formen von eingekapseltem Aktin innerhalb des Monolayer-Lipidtröpfchens sind in Abbildung 2B dargestellt. Bilder von links nach rechts zeigen globuläres Aktin (G-Aktin), filamentöses Aktin (F-Aktin), Aktin, das eine dünne F-Aktinschicht mit dem Zusatz von VCA-His zum endgültigen Puffer und Nickel-Lipid zur Membran bildet, und Aktin, das eine dünne F-Aktinschicht mit dem Zusatz von VCA-His, Cofilin und Gelsolin zum endgültigen Puffer und Nickel-Lipid zur Membran bildet.
Als nächstes wurden gereinigtes G-Aktin und assoziierte F-Aktin-bindende Proteine innerhalb des Liposoms eingekapselt. Bestehend aus den gleichen Membrankomponenten wie oben (EPC gemischt mit DHPE), hatten die Liposomen hier einen Durchmesser von ~5-50 μm. Die Bildung von Liposomen konnte durch die dünnen grünen kreisförmigen Ringe in Abbildung 3A,B visualisiert werden. Die Aktinpolymerisation wurde ausgelöst, indem die Probe auf Raumtemperatur erwärmt wurde. Wie in Abbildung 3A gezeigt, sind die rekonstituierten F-Aktin-Netzwerke (mit 20% fluoreszenzmarkiertem Aktin) in Liposomen heterogen und manifestieren sich als verzweigte Netzwerkstrukturen von Aktinfilamenten. Die verzweigte Architektur wurde durch die Einführung des Arp2/3-Komplexes ausgelöst, der gleichzeitig die Keimbildung und Verzweigung von Aktinfilamenten steuert, zusammen mit VCA-His 40,41,42,43,44,45.
Schließlich wurde ein F-Aktin-Kortex-Biomimikierungssystem geschaffen. Am inneren Blättchen der Doppelschicht der Liposomen22 entstand eine dünne, aber dicht verzweigte F-Aktinschicht, die als fluoreszierende Hülle sichtbar gemacht werden konnte (Abbildung 3C). In diesem Fall wurden zusätzlich VCA-His, Cofilin und Gelsolin in Liposomen verkapselt. Nickel-Lipide wurden in der Komponente der Lipidmembran benötigt. VCA-His, ein WASP-Fragment, trägt einen Histidin-Tag in Wechselwirkung mit den Nickel-Lipiden der Lipidmembran. In der Zwischenzeit rekrutiert es den Arp2/3-Komplex 20,46,47,48. Infolgedessen erzeugt Aktin, das durch den Arp2/3-Komplex nukleiert wird, eine F-Aktinschicht, die in Gegenwart von Cofilin und Gelsolin entlang der inneren Schicht der Membran beschichtet ist.
Abbildung 1: Herstellung von Liposomen nach der inversen Emulsionstechnik. (A) Die Liposomenpräparation besteht aus zwei Schritten. Schritt eins: Ein Tröpfchen von 10 μL Final Buffer (FB) tragenden Proteinen von Interesse wurde zu 100 μL der Phospholipid-Öl-Mischung im Verhältnis 1:10 gegeben und durch sanftes Aufsaugen mit einer Glasspritze suspendiert. Lösungen, die einschichtige Lipidtröpfchen enthielten, wurden nach dem Hin- und Her-Aspiration weißlich. Schritt zwei: In einem separaten Kunststoffröhrchen wurden einige Mikroliter des Lipid-Öl-Gemischs auf die gleiche Menge OB gegeben und ~10 min ruhen gelassen, um eine Lipidmonoschicht an der OB / Öl-Grenzfläche zu entwickeln. Die Emulsion aus Schritt eins wurde auf die Ölphase aus Schritt zwei gegossen und zentrifugiert (100 x g; 15 Minuten) bei 4 °C. Nach der Zentrifugation sollte die obere Öllösung klar und die untere OB-Lösung (mit Liposomen) leicht trüb sein. (B) Schematische Darstellung der Liposomenzubereitung aus einer invertierten Emulsion. Die weißliche Emulsion auf der Oberseite enthielt einschichtige Lipidtröpfchen, die ein verzweigtes Aktinnetzwerk im Inneren enthielten. Während der Zentrifugation passierten einschichtige Lipidtröpfchen die OB / Öl-Grenzfläche, um ein äußeres Blättchen zu bilden, so dass Liposomen gebildet und am Boden des Kunststoffröhrchens akkumuliert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Mikroskopische Aufnahmen des einschichtigen Lipidtröpfchens. (A) Das einschichtige Lipidtröpfchen mit fluoreszierendem Farbstoff in der Emulsion. Bilder von links nach rechts zeigen ein einschichtiges Lipidtröpfchen unter dem DIC-Kanal, einen fluoreszierenden 640-nm-Kanal, eine Überlagerung des DIC- und 640-nm-Kanals bzw. einen fluoreszierenden 488-nm-Kanal. (B) Verschiedene Formen von eingekapseltem Aktin innerhalb des Monolayer-Lipidtröpfchens unter einem fluoreszierenden 561-nm-Kanal. Bilder von links nach rechts zeigen globuläres Aktin (G-Aktin), filamentöses Aktin (F-Aktin), Aktin, das eine dünne F-Aktinschicht mit dem Zusatz von VCA-His zum Endpuffer und Nickel-Lipid zur Membran bildet, und Aktin, das eine dünne F-Aktinschicht mit der Zugabe von VCA-His, Cofilin und Gelsolin zum Endpuffer und Nickel-Lipid zur Membran bildet. Maßstabsbalken sind 10 μm bei 63-facher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Mikroskopische Aufnahmen der Verkapselung von Aktinnetzwerken in Liposomen. (A) Ein liposomenverkapselndes polymerisiertes verzweigtes (Arp 2/3 kernhaltiges) F-Aktin-Netzwerk. Von links nach rechts: fluoreszierender 488-nm-Kanal (links), fluoreszierender 561-nm-Kanal (Mitte), Overlay (rechts). (B) Ein repräsentatives Ergebnis von Suspensionen von Liposomen, die polymerisierte verzweigte (Arp 2/3-kernige) F-Aktin-Netzwerke einkapseln. Von links nach rechts: fluoreszierender 488-nm-Kanal (links), fluoreszierender 561-nm-Kanal (Mitte) und Overlay (rechts). (C) Das Auftreten der Bildung einer dünnen, aber dichten F-Aktinschicht, die entlang der inneren Schicht der Lipidmembran eines Liposoms beschichtet ist. Von oben nach unten: fluoreszierender 488-nm-Kanal (oben), fluoreszierender 561-nm-Kanal (Mitte), Overlay (unten). Maßstabsbalken sind 10 μm bei 63-facher Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Mehrere wichtige Schritte bestimmen den Erfolg einer hohen Ausbeute an Liposomen während des Herstellungsprozesses. Um den Lipidfilm im Öl vollständig aufzulösen, muss die Probe beschallt werden, bis der Lipidfilm am Boden der Glasdurchstechflasche vollständig verschwindet. Nach der Beschallung muss das Lipid-Öl-Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur unter dunklen Bedingungen gelagert werden, damit sich die Lipidmoleküle weiter verteilenkönnen 29. Die Mischung kann bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden. Bei der Herstellung einer FB/Öl-Emulsion mit einschichtigen Lipidtröpfchen, die Protein von Interesse enthalten, muss die Lipid-Öl-FB-Mischung vorsichtig durch eine Glasspritze hin und her gepumpt werden, um das Einbringen von Luftblasen zu vermeiden. Dabei wird ein großer Tropfen an der Spitze der Glasspritze nach mehreren Wiederholungen in viele kleinere Tröpfchen (~5-100 μm Durchmesser) abgeschert. Die Mischung muss nach dem Vorgangweiß sein 30. Um die Qualität von Phospholipiden zu überprüfen und ob sich erfolgreich eine Lipidmonoschicht in der Peripherie des FB-haltigen Tröpfchens gebildet hatte, wurden Monolayer-Lipidtröpfchen mit fluoreszierendem Farbstoff in der Emulsion untersucht, wie in Abbildung 2A gezeigt. Um den Durchgang der einschichtigen Lipidtröpfchen durch die OB/Öl-Grenzfläche während der Zentrifugation sicherzustellen und die gesammelten Liposomen in OB auf der Glasoberfläche absetzen zu lassen, sollte die Dichte von FB etwas höher sein als die OB. Daher wurden Saccharose und Glucose als Hauptbestandteil der inneren (FB) bzw. äußeren (OB) wässrigen Lösungen gewählt. In der vorherigen Arbeit wurde Dextran verwendet, um die Dichte der inneren wässrigen Lösung20 einzustellen, die in diesem Protokoll nicht enthalten ist. Darüber hinaus wurde die Osmolarität des OB mit Glukose so eingestellt, dass der osmotische Druck des OB etwas größer ist als der von FB (20-60 mOsm), wie in der vorherigen Arbeitberichtet 20,22. Große Osmolaritätsdifferenz führte zur Schrumpfung (wenn die Osmolarität des OB größer ist als die von FB) oder zum Bruch (wenn die Osmolarität des FB größer ist als die von OB) der Liposomen. Ein Osmometer wurde verwendet, um die Osmolaritäten der Puffer zu überprüfen. Im Protokoll wurde β-Casein in den OB gegeben, um sowohl Kunststoffröhrenoberflächen als auch Glasoberflächen der Bildgebungskammer zu passivieren und das Anhaften zwischen den Liposomenzu minimieren 20,49. Als Öllösung (d.h. das Lipidlösungsmittel) wurde Mineralöl verwendet. Verschiedene Lipidlösungsmittel wurden an anderer Stelle beschrieben, einschließlich Dodecan 50, flüssiges Paraffin30, Squalan51 usw. Dementsprechend werden für verschiedene Lipidlösungsmittel aufgrund ihrer Viskositätsunterschiede und des Einflusses auf die Liposomenoberflächenspannung unterschiedliche Zentrifugationsgeschwindigkeiten und -dauern verwendet. Die Dauer von Schritt 2.3 muss für geladene Lipide verlängert werden, da sich diese geladenen Moleküle in der Monoschicht gegenseitig abstoßen und somit mehr Zeit benötigen, um an der Grenzfläche zwischen dem Lipid-Öl-Gemisch und OB38 gut zu diffundieren und sich gut zu organisieren. Für Lipide, die mit Proteinen von Interesse inkorporiert sind, wird auch eine Verlängerung dieses Schritts empfohlen, um eine bessere Monoschichtbildung zu gewährleisten52. Für die Liposomenausbeute von Liposomen, die polymerisiertes F-Aktin-Netzwerk einkapseln, beträgt die Anzahl der Liposomen pro Sichtfeld (100 μm x 100 μm) etwa 5-10 bei einem durchschnittlichen Durchmesser von 20 μm. Ein verkleinertes Bild einer typischen Mikroskopieprobe ist in Abbildung 3B dargestellt. Weitere herausgezoomte konfokale Bilder der Liposomen, die durch die invertierte Emulsionsmethode erzeugt werden, finden sich in einer kürzlich durchgeführten Studie52, in der verschiedene Parameter (Dichtedifferenz, Zentrifugationsgeschwindigkeit/-zeit, Lipidkonzentration, pH-Wert, Temperatur usw.) für die Produktion von Liposomen mit hoher Ausbeute optimiert wurden.
Für die Rekonstitution des F-Aktin-Netzwerks ist es wichtig, eine geeignete Konzentration des Adenosintriphosphats (ATP), Dithiothreitol (DTT), der zugehörigen Salze und der pH-Bedingung zu wählen. Ein intermediärer Checkpoint des rekonstituierten F-Aktin-Netzwerks kann durch Beobachtung von Monolayer-Lipidtröpfchen mit eingekapseltem Aktin im Inneren erreicht werden. Verschiedene Formen von eingekapseltem Aktin innerhalb des Monolayer-Lipidtröpfchens sind in Abbildung 2B dargestellt. Die Aktinpolymerisation erfolgt bei >20 mM K+ Salz und in >0,2 mM Mg2+ Salz mit einem pH-Wert zwischen 6,5 und 8,5, wie zuvor berichtet53,54,55. Vor der Bildgebung von Liposomen wurden alle Lösungen auf Eis gehalten, um eine frühe Aktinpolymerisation zu verhindern. Die Proben wurden bei Raumtemperatur abgebildet, um die Aktinpolymerisation auszulösen. Die Architektur des rekonstituierten F-Aktin-Netzwerks wird überwiegend durch die Aktivität des Arp2/3-Komplexes reguliert. Der Arp 2/3-Komplex kerniert und verzweigt Aktinfilamente von der Seite eines bestehenden Mutterfilaments, um dendritische Architekturen zu erzeugen56,57. Das Nickel-Lipid (DOGS-NTA-Ni) und das VCA-His sind entscheidend für die Bildung der F-Aktin-Schicht. VCA-His dient als keimbildungsfördernder Faktor, der an der Membran22,58 mit Nickellipiden verknüpft ist. Ein verzweigtes F-Aktin-Netzwerk wird dann aus VCA-His nukleiert, was den Arp2/3-Komplex erleichtert, und als Ergebnis wird eine dichte F-Aktin-Hülle am inneren Blättchen der Lipidmembran gebildet. Die Konzentration von VCA-He im Liposom bestimmt die Dicke der F-Aktinschicht. Die Zugabe der aktinregulatorischen Proteine (Cofilin und Gelsolin) fördert zudem die Bildung der F-Aktinschicht. Das Cofilin durchtrennt Aktinfilamente, um die Anzahl der Filamentenden zu erhöhen, während das Gelsolin an die Stachelenden von Aktinfilamenten bindet, um ihr Wachstum zu begrenzen. Dabei kann in Gegenwart von Cofilin und Gelsolin eine größere Anzahl von Filamenten durch Arp2/3 kernisiert und dann von VCA-His rekrutiert werden, um die F-Aktinschicht zu bilden.
Ähnliche Arbeiten, die auf der Emulsionstransfermethode für die Proteinverkapselung basieren, wurden in den letzten Jahren veröffentlicht 28,30,34. Ein Hauptunterschied zwischen dem Protokoll hier und den Protokollen in diesen Papieren ist die Wahl des primären Lipids für Liposomen. In dieser Arbeit verwenden wir das L-α-Phosphatidylcholin (EPC, eine Mischung verschiedener Phosphatidylcholinspezies, die etwa 60% POPC59 enthält) als Hauptbestandteil der Liposomenmembran. Zur Bildung einer F-Aktinschicht wurde eine Mischung aus dem EPC und dem Nickel-Lipid (DOGS-NTA-Ni) im Verhältnis 10:1 verwendet. In einer früheren Arbeit wurden Liposomen auf Polyhistidin beschichtetem Glas verteilt, und EPC, Cholesterin und Nickel-Lipid wurden in einem Verhältnis von 53:37:1020 gemischt. Im Vergleich dazu wählten Natsume et al. und Bashirzadeh et al. das Dioleoyl-Phosphocholin (DOPC, eine einzige Art von Phospholipid), um Mikrosphären28 bzw. Faszin-Aktin-Bündel34 zu verkapseln, während Fujii et al. 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC, ein rein synthetisches Phospholipid) als primäres Lipid empfahlen, um eine Liposomen-basierte Membranproteinsynthesetechnologie zu etablieren30 . Die Wahl der primären Lipide beeinflusst die physikalischen Eigenschaften von Liposomen. Wenn beispielsweise der Grad der Ungesättigtheit der Acylkette zunimmt (d. h. POPC< EPC< DOPC60), nehmen die Permeabilitätseigenschaften verschiedener Moleküle durch die Doppelschicht61 ab. Die Wahl hängt auch davon ab, ob die interessierenden Lipide gemischt werden. Zum Beispiel macht die Zugabe des Cholesterins EPC-Liposomen stabiler, während sie die Doppelschichtstruktur der DOPC/DOPE-Mischung61 destabilisiert.
Die Ähnlichkeiten zwischen dieser Arbeit und einer aktuellen Publikation von Bashirzadeh et al.34 fallen auf das gleiche Thema der Aktinverkapselung. Mittlerweile gibt es klare Unterscheidungen. Bashirzadeh et al. berichteten über einen modifizierten cDICE-Ansatz unter Verwendung einer 3D-gedruckten Drehkammer. Hier wenden wir die einfache, traditionelle invertierte Emulsionstransfermethode mit einer Spritze und einer Zentrifugenmaschine an. Beide Methoden erzeugen eine hohe Ausbeute an Liposomen und haben eine hohe Verkapselungseffizienz für große Biomoleküle24. Neben dem oben erwähnten Unterschied in den Lipidkomponenten ändern sich auch die Architekturen des verkapselten Aktinnetzwerks. Bashirzadeh et al. verkapselten Faszin-Aktin-Bündel innerhalb des Liposoms, während wir in dieser Arbeit ein verzweigtes Netzwerk einkapselten, das durch den Arp2/3-Komplex ausgelöst wurde. Darüber hinaus wurde hier die Bildung einer F-Aktin-Schicht zur Schaffung eines Kortex-Biomiiktionssystems in Gegenwart VCA-His ausgearbeitet.
Die hier beschriebene Methode hat zwei Einschränkungen. Einer ist, dass die Größe der Liposomen, die in vitro rekonstituierte Aktinnetzwerke enthalten, nicht präzise manipuliert werden kann (von 5 bis 50 μm Durchmesser) und die Ausbeute im Vergleich zur Elektrobildungsmethode gering ist. Die andere Einschränkung eines Wasser-Öl-basierten Verfahrens besteht darin, dass Spuren von Öl zwischen den Doppelschichtblättchen24 eingeschlossen werden. Obwohl es die Membrandicke oder die Biokompatibilität dieser bioimitierenden Liposomen 24,35,62,63 nicht signifikant beeinflusst, kann die Membrandynamik der in Öl eingefügten Liposomen verändert sein 62. Bei dieser Methode wird der Aktinnukleator Arp2/3 eingebaut. Zukünftige Studien können andere Zytoskelettproteine 64,65,66,67, Nukleatoren wie Formin 68 oder molekulare Motoren wie Myosin II 69 umfassen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir bestätigen die Finanzierung von ARO MURI W911NF-14-1-0403 an M.P.M., die National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 an M.P.M., die National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 und die Fördernummer RGY0073/2018 des Human Frontiers Science Program (HFSP) an M.P.M. Alle Meinungen, Ergebnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der ARO, NIH oder HFSP wider. S.C. würdigt fruchtbare Gespräche mit V. Yadav, C. Muresan und S. Amiri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni) | Avanti Polar Lipids Inc. | 231615773 | Nickel Lipid |
| 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane | Sigma | D27802-25G | DABCO |
| Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton, Inc | AKL99-D | non-fluorescent G-actin |
| Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton, Inc | AR05 | fluorescently labeled actin |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma | A2383-10G | ATP |
| Alexa Fluor 647 dye | ThermoFisher | fluorescent dye | |
| Andor iQ3 | Andor Technologies | control and acquisition software for confocal microscope | |
| Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain | Cytoskeleton, Inc | RP01P-A | Arp 2/3 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | 10035048 | CaCl2 |
| Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) | Quorum Technologies | incubation chamber | |
| Cofilin protein: human recombinant | Cytoskeleton, Inc | CF01-C | cofilin |
| Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) | Andor Technologies | LEICA DMi8 | |
| D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA | Sigma | G7528 | glucose |
| Dithiothreitol | DOT Scientific | DSD11000-10 | DTT |
| Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant | Cytoskeleton, Inc | HPG6 | gelsolin |
| Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip | Cole-Parmer | UX-07940-53 | glass syringe |
| HEPES | AmericanBio | 7365-45-9 | |
| ImageJ/Fiji | https://imagej.net/tutorials/ | ||
| L-alpha-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids Inc. | 97281442 | EPC |
| Magnesium chloride | Sigma | 7786303 | MgCl2 |
| Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | Sigma | 8042475 | mineral oil |
| N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) | VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests | ||
| Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) | Thermo Fisher | O12650 | DHPE |
| Potassium chloride | Sigma | 7447407 | KCl |
| Sucrose | Sigma | 57-50-1 | sucrose |
| β-Casein from bovine milk | Sigma | C6905-250MG |
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