Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

في المختبر إعادة تشكيل الهيكل الخلوي للأكتين داخل حويصلات يونيلاميلار العملاقة

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64026
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

Summary

في هذه المخطوطة، نوضح التقنيات التجريبية لتغليف الهيكل الخلوي F-actin في حويصلات دهنية عملاقة أحادية الصفيحة (وتسمى أيضا الجسيمات الشحمية)، وطريقة تشكيل طبقة F-actin تحاكي القشرة الحيوية في النشرة الداخلية للغشاء الشحمي.

Abstract

يتوسط الهيكل الخلوي للأكتين ، وهو الآلية الميكانيكية الرئيسية في الخلية ، العديد من الأنشطة الخلوية الفيزيائية الأساسية ، بما في ذلك تشوه الخلية والانقسام والهجرة والالتصاق. ومع ذلك ، فإن دراسة ديناميكيات وبنية شبكة الأكتين في الجسم الحي معقدة بسبب التنظيم الكيميائي الحيوي والجيني داخل الخلايا الحية. لبناء نموذج الحد الأدنى الخالي من التنظيم الكيميائي الحيوي داخل الخلايا ، يتم تغليف الأكتين داخل حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs ، وتسمى أيضا الجسيمات الشحمية). الجسيمات الشحمية المحاكاة الحيوية بحجم الخلية وتسهل نظرة كمية على الخصائص الميكانيكية والديناميكية لشبكة الهيكل الخلوي ، مما يفتح طريقا قابلا للتطبيق للبيولوجيا التركيبية من أسفل إلى أعلى. لتوليد الجسيمات الشحمية للتغليف ، يتم استخدام طريقة المستحلب المقلوب (يشار إليها أيضا باسم طريقة نقل المستحلب) ، والتي تعد واحدة من أنجح التقنيات لتغليف المحاليل المعقدة في الجسيمات الشحمية لإعداد أنظمة محاكاة الخلايا المختلفة. باستخدام هذه الطريقة ، يضاف مزيج من البروتينات ذات الأهمية إلى المخزن المؤقت الداخلي ، والذي يتم استحلابه لاحقا في محلول زيت معدني يحتوي على الدهون الفوسفاتية لتشكيل قطرات دهنية أحادية الطبقة. يتم إنشاء الجسيمات الشحمية المطلوبة من قطرات الدهون أحادية الطبقة التي تعبر واجهة الدهون / الزيت والماء. تمكن هذه الطريقة من تغليف بوليمرات الأكتين المركزة في الجسيمات الشحمية مع مكونات الدهون المطلوبة ، مما يمهد الطريق لإعادة تكوين شبكة الهيكل الخلوي التي تحاكي بيولوجيا في المختبر .

Introduction

يلعب الهيكل الخلوي للأكتين دورا أساسيا في بناء البنية داخل الخلايا للخلية من خلال تنسيق الانقباض على المستوى الجزيئي وتوليد القوة1،2،3. ونتيجة لذلك ، فإنه يتوسط العديد من الأنشطة الخلوية الأساسية ، بما في ذلك تشوه الخلايا4,5 ، والانقسام6 ، والهجرة 7,8 ، والالتصاق9. اكتسبت إعادة تشكيل شبكات الأكتين في المختبر اهتماما هائلا في السنوات الأخيرة10،11،12،13،14،15،16،17. الهدف من إعادة التشكيل هو بناء نموذج الحد الأدنى من الخلية الخالية من التنظيم الكيميائي الحيوي المعقد الموجود داخل الخلايا الحية. وهذا يوفر بيئة يمكن التحكم فيها للتحقيق في أنشطة محددة داخل الخلايا ويسهل تحديد وتحليل المكونات المختلفة للهيكل الخلوي الأكتين18،19. علاوة على ذلك ، فإن تغليف شبكات الأكتين في المختبر داخل حويصلات أحادية الصفائح العملاقة الفوسفاتية (GUVs ، الجسيمات الشحمية) يوفر مساحة محصورة ولكنها قابلة للتشوه مع حدود شبه منفذة. إنه يحاكي البيئة الفسيولوجية والميكانيكية الدقيقة لآلات الأكتين داخل الخلية9،20،21،22.

من بين الطرق المختلفة لإعداد الجسيمات الشحمية ، تعد طريقة ترطيب فيلم الدهون (المعروفة أيضا باسم طريقة التورم) واحدة من أقدم التقنيات23. يرطب فيلم الدهون الجاف مع إضافة المخازن المؤقتة ، ويشكل فقاعات غشائية تصبح في النهاية حويصلات24. لإنتاج حويصلات أكبر ذات عائد أعلى ، تقوم طريقة محسنة تتقدم من طريقة ترطيب الفيلم ، والمعروفة باسم طريقة التكوين الكهربائي25 ، بتطبيق مجال كهربائي AC لتعزيز عملية الترطيب بكفاءة26. القيود الرئيسية لهذه الطرق القائمة على الترطيب لتغليف الأكتين هي أن لديها كفاءة تغليف منخفضة للبروتينات عالية التركيز ، وهي متوافقة فقط مع تركيبات دهنية محددة24. تقنية المستحلب المقلوب ، في المقابل ، لديها قيود أقل على مكونات الدهون وتركيزات البروتين20،27،28،29. في هذه الطريقة ، يضاف مزيج من البروتينات للتغليف إلى المخزن المؤقت المائي الداخلي ، والذي يتم استحلابه لاحقا في محلول زيت معدني يحتوي على الدهون ، مما يشكل قطرات أحادية الطبقة من الدهون. ثم تعبر قطرات الدهون أحادية الطبقة من خلال واجهة أخرى للدهون / الزيت والماء من خلال الطرد المركزي لتشكيل حويصلات دهنية ثنائية الطبقة (الجسيمات الشحمية). وقد أثبتت هذه التقنية أنها واحدة من أنجح الاستراتيجيات لتغليف الأكتين24,30. بشكل منفصل ، هناك بعض طرق أجهزة الموائع الدقيقة ، بما في ذلك النفث النبضي31,32 ، وطرد الغشاء العابر 33 ، وطريقة cDICE 34. أوجه التشابه بين طريقة المستحلب المقلوب وطريقة الموائع الدقيقة هي مذيب الدهون (الزيت) المستخدم وإدخال واجهة الدهون / الزيت والماء لتشكيل النشرة الخارجية للجسيمات الشحمية. على النقيض من ذلك ، يتطلب توليد الجسيمات الشحمية بطريقة الموائع الدقيقة إعداد أجهزة الموائع الدقيقة ويرافقه زيت محبوس بين منشوري الطبقة الثنائية ، الأمر الذي يتطلب خطوة إضافية لإزالة الزيت35.

في هذه المخطوطة، استخدمنا تقنية المستحلب المقلوب لإعداد الجسيمات الشحمية التي تغلف شبكة F-actin المبلمرة كما كانت تستخدم سابقا22. تم وضع خليط البروتين للتغليف لأول مرة في مخزن مؤقت مع ظروف غير بلمرة للحفاظ على الأكتين في شكله الكروي (G). تم تنفيذ العملية برمتها عند 4 درجات مئوية لمنع بلمرة الأكتين المبكرة ، والتي تم تشغيلها لاحقا عن طريق السماح للعينة بالدفء إلى درجة حرارة الغرفة. بمجرد الوصول إلى درجة حرارة الغرفة ، يتبلمر الأكتين في شكله الخيطي (F). يمكن إضافة مجموعة متنوعة من البروتينات المرتبطة بالأكتين إلى المحلول العازل المائي الداخلي لدراسة وظائف البروتين وخصائصه ، وبالتالي ، توفير المزيد من الأفكار حول تفاعله مع شبكة الأكتين وسطح الغشاء. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تغليف البروتينات المختلفة ذات الأهمية36 والأشياء الكبيرة (الجسيمات الدقيقة ، السباحين الدقيقين ذاتي الدفع ، إلخ) بالقرب من حجم الجسيمات الشحمية النهائية 28,37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المخازن المؤقتة ومحاليل البروتين

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت الداخلي المائي غير البلمرة (INP) بحجم إجمالي قدره 5 مل عن طريق خلط 0.1 mM CaCl 2 و 10 mM HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5) و 1 mM DTT و 0.5 mM Dabco و 320 mM sucrose و0.2 mM ATP.
  2. تحضير مزيج البروتين (PM) عن طريق إضافة البروتينات إلى مخزن INP العازل عند 4 درجات مئوية مع التركيزات التالية: 11.2 ميكرومتر غير الفلورسنت G-actin ، 2.8 μM المسمى بالفلورسنت الأكتين ، و 0.24 μM Arp2/3 (جدول المواد). لتشكيل طبقة F-actin ، أضف 100 نانومتر جيلسولين ، و 4 ميكرومتر كوفلين ، و 2.2 ميكرومتر VCA-His إلى PM. كتجربة تحكم ، استبدل PM بصبغة فلورسنت 100 ميكروغرام / مل (جدول المواد).
  3. قم بإعداد المخزن المؤقت للبلمرة الداخلية المائية (IP) (مائي) بحجم إجمالي قدره 5 مل عن طريق خلط 100 ملليمتر KCl و 4 ملليمتر MgCl2 و 10 ملم HEPES (درجة الحموضة 7.5) و 1 ملليمتر DTT و 0.5 ملليمتر دابكو و 10 ملليمتر ATP و 80 ملليمتر سكروز .
  4. قم بإعداد المخزن المؤقت النهائي (FB) عن طريق خلط المخزن المؤقت INP (الذي يحتوي على PM) والمخزن المؤقت IP بنسبة حجم 1: 1 لإنتاج المحلول المائي الداخلي بحجم إجمالي قدره 30 ميكرولتر سيتم تغليفه داخل الجسيمات الشحمية.
  5. قم بإعداد المخزن المؤقت الخارجي المائي (OB) بحجم إجمالي قدره 150 ميكرولتر عن طريق خلط 10 mM HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، 50 mM KCl ، 2mM MgCl 2 ،0.2 mM CaCl2 ، 2mM ATP ، 1 mM DTT ، 0.5 mM Dabco ، 212 mM glucose ، و 0.1 mg / mL β-casein.
    ملاحظة: يمكن ضبط الأسمولية ل OB مع الجلوكوز لضمان أن يكون الضغط الأسموزي ل OB أكبر قليلا من ضغط FB (20-60 mOsm). يجب أن تكون كثافة FB أعلى قليلا من OB.

2. تحضير الجسيمات الشحمية على أساس تقنيات المستحلب المقلوب

  1. تحضير خليط الدهون والزيت
    1. أضف 100 ميكرولتر من 25 ملغم / مل L-α-phosphatidylcholine (كمبيوتر البيض غير الفلوري ، ويسمى أيضا EPC ، بما في ذلك 1٪ DHPE) في قارورة زجاجية. تبخر الكلوروفورم بغاز الأرجون ، تاركا طبقة دهنية صلبة جافة (2.5 ملغ) في قاع القارورة.
      1. لتشكيل طبقة F-actin ، أضف 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid] succinyl} ملح النيكل (DOGS-NTA-Ni) بنسبة 10: 1 من EPC إلى DOGS-NTA-Ni واخلطه قبل تبخر الكلوروفورم.
    2. أضف 2 مل من الزيت المعدني وقم بسونيك خليط الدهون والزيوت في درجة حرارة الغرفة في الحمام لمدة 1 ساعة لإعادة تعليق الدهون.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بخليط الدهون والزيت بعد الصوتنة لمدة 1 أسبوع عند 4 درجات مئوية. يقترح إعادة الصوتنة قبل الاستخدام.
  2. قم بإعداد مستحلب Final Buffer in Oil (FB / oil) لإعداد قطرات دهنية أحادية الطبقة تحتوي على البروتين محل الاهتمام.
    1. إلى 100 ميكرولتر من خليط زيت الدهون المأخوذ في أنبوب بلاستيكي ، أضف 10 ميكرولتر من FB. تأكد من أن FB في قطرة واحدة.
    2. باستخدام حقنة زجاجية ، اسحب خليط الدهون والزيت و FB وقم بشفطه بلطف لأعلى ولأسفل عدة مرات لاستحلابه ؛ ارسم كمية صغيرة من خليط زيت الدهون أولا ، ثم قطرة FB عن طريق وضع طرف المحقنة في محيط القطيرة لتقسيمها إلى قطرات صغيرة. كرر الطموح لأعلى ولأسفل حتى يتم تشكيل مستحلب أبيض وغائم.
  3. ضع 30 ميكرولتر من OB في أنبوب بلاستيكي منفصل. ضع 30 ميكرولتر من خليط الدهون والزيت فوق OB واتركه لمدة 10 دقائق تقريبا لتطوير طبقة أحادية الدهون في الواجهة.
    ملاحظة: إذا تم شحن الدهون أو تم دمج البروتين ، فيجب تمديد مدة هذه الخطوة38.
  4. تحضير الجسيمات الشحمية
    1. أضف بعناية 50 ميكرولتر من مستحلب FB / الزيت (الخطوة 2.2) إلى مرحلة الزيت العليا للأنبوب من الخطوة 2.3.
    2. جهاز طرد مركزي للأنبوب البلاستيكي عند 100 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. قم بتغيير الوقت وسرعة الطرد المركزي لتحسين تكوين الجسيمات الشحمية.
      ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، يجب أن تكون مرحلة الزيت العلوية واضحة ، ويجب أن يكون OB السفلي (الذي يحتوي على الجسيمات الشحمية) غائما قليلا.
    3. قم بإزالة مرحلة الزيت بعناية بواسطة الماصة. استنشق حجما إضافيا إذا لزم الأمر. تأكد من عدم وضع طرف الماصة على جانب الأنبوب لتجنب إنشاء غضروف مفصلي من الزيت فوق مرحلة الجسيمات الشحمية.
    4. باستخدام ماصة جديدة ، قم بلصق طرف الماصة ببطء في المرحلة السفلية المتبقية وقم بشفط الحجم المائي لجمع الجسيمات الشحمية.
      ملاحظة: من الأفضل أن تفقد الحجم بدلا من دمج الزيت. سيؤدي إدراج الزيت إلى تمزق الجسيمات الشحمية ، وسيتم إطلاق المكونات الداخلية في المخزن المؤقت الخارجي. قطع طرف ماصة للحد من القص.

3. المراقبة المجهرية

  1. صب 100 ميكرولتر من OB في بئر غرفة الحضانة (لوحة من 4 آبار تحتوي على أغطية مستديرة 12 مم). قم بإيداع الجسيمات الشحمية التي تم جمعها بلطف (الخطوة 2.4.4) في OB ، ثم ضع غطاء آخر أعلى الغرفة.
    ملاحظة: يحتوي OB على الكازين β لتخميل سطح الزجاج وتقليل الالتصاق بين الجسيمات الشحمية20.
  2. راقب الجسيمات الشحمية باستخدام مجهر متحد البؤرة باستخدام هدف غمر الزيت 63x. استخدم خطوط ليزر 488 نانومتر و 647 نانومتر و 561 نانومتر لمراقبة الدهون المصنفة بالفلورسنت ، وصبغة الفلورسنت المغلفة ، والأكتين المغطى المسمى بالفلورسنت ، على التوالي. التقط الإطارات المثيرة للاهتمام واحفظ الصور بتنسيق TIFF.
  3. معالجة الصور وتحليلها في ImageJ/Fiji39. بالنسبة للمستخدمين الجدد ل ImageJ/Fiji، يتوفر برنامج تعليمي عبر الإنترنت (انظر جدول المواد).
    1. افتح ملف TIFF باستخدام برنامج ImageJ/Fiji.
    2. انتقل إلى الصورة > ضبط سطوع/تباين >. اضبط سطوع الصورة وتباينها إلى المقياس المطلوب عن طريق ضبط إعدادات الحد الأدنى والحد الأقصى ومنزلقي السطوع والتباين .
    3. انقر على أداة تحديد المستطيل في شريط الأدوات وحدد منطقة الاهتمام (ROI). انتقل إلى صورة > اقتصاص لاقتصاص عائد الاستثمار.
    4. انتقل إلى تحليل > تعيين المقياس. في النافذة المنبثقة، أدخل 1.0 في حقل نسبة أبعاد البكسل وقم بتعيين μm كوحدة الطول. في الحقل المسافة بالبكسل، أدخل عرض الصورة بالبكسل. في الحقل "المسافة المعروفة"، أدخل عرض الصورة الحقيقي بالميكرون.
    5. لقياس حجم الجسيم الشحمي، باستخدام أداة التحديد البيضاوي في شريط الأدوات، ارسم دائرة على طول حافة الجسيم الشحمي. انتقل إلى تحليل > قياس لقياس مساحة الدائرة ، والتي يمكن من خلالها حساب قطر الجسيم الشحمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يتم توضيح إعداد الجسيمات الشحمية على أساس تقنية المستحلب المقلوب بيانيا وتخطيطيا في الشكل 1.

أولا ، تم إعداد الجسيمات الشحمية الفارغة (العارية) (قطرها ~ 5-50 ميكرومتر) التي كانت تتكون من الدهون الفوسفاتية (EPC) والدهون الفلورية (DHPE). تم تغليف صبغة فلورسنت ساطعة حمراء بعيدة داخل الجسيمات الشحمية العارية كتجربة تحكم. يمكن تحديد ما إذا كانت الطبقة الأحادية الدهنية قد تشكلت بنجاح في محيط القطرة من خلال مراقبة قطرات الدهون أحادية الطبقة التي تتضمن صبغة الفلورسنت في المستحلب ، كما هو موضح في الشكل 2A. يمكن التحقق من نجاح توليد الجسيمات الشحمية من خلال تصور الحلقة الدائرية الرقيقة ، وهي الطبقة الثنائية من الدهون الخضراء الفلورية (اقتران الدهون مع DHPE) ، تحت ليزر 488 نانومتر باستخدام المجهر البؤري (الشكل 2A ، اللوحة الموجودة في أقصى اليمين). لتأكيد تغليف صبغة الفلورسنت ، يجب أن تكون البيئة الداخلية للجسيمات الشحمية فلورية بشكل موحد تحت ليزر 647 نانومتر (الشكل 2A ؛ صورة تراكب) بسبب صبغة الفلورسنت الحمراء البعيدة (جدول المواد).

تظهر أشكال مختلفة من الأكتين المغلف داخل قطرة الدهون أحادية الطبقة في الشكل 2B. تظهر الصور من اليسار إلى اليمين الأكتين الكروي (G-actin) ، والأكتين الخيطي (F-actin) ، والأكتين الذي يشكل طبقة رقيقة من F-actin مع إضافة VCA-His إلى المخزن المؤقت النهائي والنيكل الدهني إلى الغشاء ، والأكتين الذي يشكل طبقة رقيقة من F-actin مع إضافة VCA-His، cofilin، و gelsolin إلى المخزن المؤقت النهائي والنيكل - الدهون إلى الغشاء.

بعد ذلك ، تم تغليف G-actin النقي والبروتينات المرتبطة بربط F-actin داخل الجسيمات الشحمية. تتكون الجسيمات الشحمية من نفس مكونات الغشاء كما هو موضح أعلاه (EPC مختلطة مع DHPE) ، وكان قطرها حوالي 5-50 ميكرومتر. يمكن تصور تكوين الجسيمات الشحمية من خلال الحلقات الدائرية الخضراء الرقيقة الموضحة في الشكل 3A ، B. تم تشغيل بلمرة الأكتين عن طريق السماح للعينة بالدفء إلى درجة حرارة الغرفة. وكما هو مبين في الشكل 3 ألف، فإن شبكات F-actin المعاد تشكيلها (مع 20٪ من الأكتين المسمى بالفلورسنت) داخل الجسيمات الشحمية غير متجانسة، وتظهر على شكل هياكل شبكية متفرعة من خيوط الأكتين. تم تشغيل العمارة المتفرعة من خلال إدخال مجمع Arp2/3 ، الذي يتحكم في وقت واحد في نواة وتفرع خيوط الأكتين ، إلى جانب VCA-His 40,41,42,43,44,45.

وأخيرا ، تم إنشاء نظام محاكاة حيوية للقشرة F-actin. تم إنشاء طبقة F-actin رقيقة ، ولكنها متفرعة بكثافة في النشرة الداخلية للطبقة الثنائية من الجسيمات الشحمية22 ، والتي يمكن تصورها على أنها قشرة فلورية (الشكل 3C). في هذه الحالة ، بالإضافة إلى ذلك ، تم تغليف VCA-Hisو cofilin و gelsolin في الجسيمات الشحمية. كانت هناك حاجة إلى دهون النيكل في مكون الغشاء الدهني. يحمل VCA-His، وهو جزء من WASP، علامة هيستيدين في التفاعل مع دهون النيكل في الغشاء الدهني. في غضون ذلك ، تقوم بتجنيد مجمع Arp2/320،46،47،48. ونتيجة لذلك ، يولد الأكتين الذي ينوى بواسطة مركب Arp2/3 طبقة F-actin مغلفة على طول الطبقة الداخلية للغشاء في وجود cofilin و gelsolin.

Figure 1
الشكل 1: تحضير الجسيمات الشحمية على أساس تقنية المستحلب المقلوب. (أ) يتكون إعداد الجسيمات الشحمية من خطوتين. الخطوة الأولى: تمت إضافة قطرة من 10 ميكرولتر من Final Buffer (FB) تحمل بروتينات ذات أهمية إلى 100 ميكرولتر من خليط زيت الفوسفوليبيدات بنسبة 1:10 وتم تعليقها عن طريق الشفط بلطف لأعلى ولأسفل باستخدام حقنة زجاجية. أصبحت المحاليل التي تحتوي على قطرات دهنية أحادية الطبقة بيضاء بعد الطموح ذهابا وإيابا. الخطوة الثانية: في أنبوب بلاستيكي منفصل ، تم وضع بضعة ميكرولترات من خليط زيت الدهون فوق نفس الكمية من OB وسمح لها بالجلوس لمدة 10 دقائق تقريبا لتطوير طبقة أحادية الدهون في واجهة OB / الزيت. تم سكب المستحلب من الخطوة الأولى أعلى مرحلة الزيت من الخطوة الثانية وتم طرده مركزيا (100 × جم ؛ 15 دقيقة) عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، يجب أن يكون محلول الزيت العلوي واضحا ، ويجب أن يكون محلول OB السفلي (الذي يحتوي على الجسيمات الشحمية) غائما قليلا. (ب) مخططات تحضير الجسيمات الشحمية من مستحلب مقلوب. يحتوي المستحلب الأبيض الموجود في الأعلى على قطرات دهنية أحادية الطبقة تتضمن شبكة أكتين متفرعة في الداخل. أثناء الطرد المركزي ، مرت قطرات الدهون أحادية الطبقة عبر واجهة OB / Oil لتشكيل نشرة خارجية بحيث تم إنشاء الجسيمات الشحمية وتراكمها في الجزء السفلي من الأنبوب البلاستيكي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صور مجهرية لقطرة الدهون أحادية الطبقة . (أ) قطرة الدهون أحادية الطبقة التي تتضمن صبغة الفلورسنت في المستحلب. تظهر الصور من اليسار إلى اليمين قطرة دهنية أحادية الطبقة تحت قناة DIC ، وقناة فلورسنت 640 نانومتر ، وتراكب قناة DIC وقناة 640 نانومتر ، وقناة فلورسنت 488 نانومتر ، على التوالي. (ب) أشكال مختلفة من الأكتين المغلف داخل قطرة الدهون أحادية الطبقة تحت قناة فلورسنت 561 نانومتر. تظهر الصور من اليسار إلى اليمين الأكتين الكروي (G-actin) ، والأكتين الخيطي (F-actin) ، والأكتين الذي يشكل طبقة رقيقة من F-actin مع إضافة VCA-His إلى المخزن المؤقت النهائي والنيكل والدهون إلى الغشاء ، والأكتين الذي يشكل طبقة رقيقة من F-actin مع إضافة VCA-His، cofilin، و gelsolin إلى المخزن المؤقت النهائي والنيكل الدهني إلى الغشاء. أشرطة المقياس هي 10 ميكرومتر عند تكبير 63x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صور مجهرية لتغليف شبكات الأكتين داخل الجسيمات الشحمية. (أ) شبكات F-actin المبلمرة المتفرعة (Arp 2/3 nucleated). من اليسار إلى اليمين: قناة الفلورسنت 488 نانومتر (يسار)، قناة الفلورسنت 561 نانومتر (الوسط)، التراكب (يمين). (ب) نتيجة تمثيلية لتعليق الجسيمات الشحمية التي تغلف شبكات F-actin المتفرعة المبلمرة (Arp 2/3 nucleated). من اليسار إلى اليمين: قناة فلورسنت 488 نانومتر (يسار)، قناة فلورسنت 561 نانومتر (وسط)، وتراكب (يمين). (ج) ظهور تشكيل طبقة رقيقة ولكن كثيفة من F-actin مغلفة على طول الطبقة الداخلية للغشاء الدهني للجسيم الشحمي. من الأعلى إلى الأسفل: قناة الفلورسنت 488 نانومتر (أعلى) ، قناة الفلورسنت 561 نانومتر (الوسط) ، التراكب (أسفل). أشرطة المقياس هي 10 ميكرومتر عند تكبير 63x. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحدد العديد من الخطوات الرئيسية نجاح العائد العالي من الجسيمات الشحمية أثناء عملية التحضير. لإذابة فيلم الدهون تماما في الزيت ، يجب أن تكون العينة صوتية حتى يختفي فيلم الدهون في الجزء السفلي من القارورة الزجاجية تماما. بعد الصوتنة ، يجب تخزين خليط زيت الدهون بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة تحت ظروف مظلمة حتى تتفرق جزيئات الدهون29 أخرى. يمكن تخزين الخليط في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. عند تحضير مستحلب FB / الزيت مع قطرات دهنية أحادية الطبقة تحتوي على بروتين مثير للاهتمام ، يجب ضخ خليط الدهون والزيت و FB بلطف ذهابا وإيابا من خلال حقنة زجاجية لتجنب إدخال فقاعات الهواء. خلال هذه العملية ، يتم قص قطرة كبيرة واحدة عند طرف المحقنة الزجاجية إلى العديد من القطرات الأصغر (قطرها ~ 5-100 ميكرومتر) بعد عدة تكرارات. يجب أن يكون الخليط أبيض بعد العملية30. للتحقق من جودة الدهون الفوسفاتية ، وما إذا كانت الطبقة الأحادية الدهنية قد تشكلت بنجاح في محيط FB الذي يحتوي على قطرات ، تم فحص قطرات الدهون أحادية الطبقة التي تتضمن صبغة الفلورسنت في المستحلب ، كما هو موضح في الشكل 2A. لضمان مرور قطرات الدهون أحادية الطبقة عبر واجهة OB / الزيت أثناء الطرد المركزي ، والسماح للجسيمات الشحمية المجمعة في OB بالاستقرار على السطح الزجاجي ، يجب أن تكون كثافة FB أعلى قليلا من OB. لذلك ، تم اختيار السكروز والجلوكوز كمكون رئيسي للمحاليل المائية الداخلية (FB) والخارجية (OB) ، على التوالي. في العمل السابق ، تم استخدام dextran لضبط كثافة المحلول المائي الداخلي20 ، والذي لم يتم تضمينه في هذا البروتوكول. علاوة على ذلك ، تم تعديل الأسمولية ل OB مع الجلوكوز بحيث يكون الضغط الأسموزي ل OB أكبر قليلا من ضغط FB (20-60 mOsm) كما ورد في العمل السابق20,22. أدى اختلاف الأسمولية الكبير إلى انكماش (عندما تكون أسمولية OB أكبر من تلك الموجودة في FB) أو تمزق (عندما تكون أسمولية FB أكبر من تلك الموجودة في OB) للجسيمات الشحمية. تم استخدام مقياس التناضح للتحقق من الأسمولية للمخازن المؤقتة. في البروتوكول ، تمت إضافة β-casein في OB لتخميل كل من أسطح الأنابيب البلاستيكية والأسطح الزجاجية لغرفة التصوير وتقليل الالتصاق بين الجسيمات الشحمية20,49. تم استخدام الزيت المعدني كمحلول زيت (أي مذيب الدهون). تم الإبلاغ عن مذيبات دهنية مختلفة في أماكن أخرى ، بما في ذلك دوديكان 50 ، بارافين سائل30 ، سكوالين51 ، إلخ. وفقا لذلك ، يتم استخدام سرعات ومدد مختلفة للطرد المركزي لمختلف مذيبات الدهون بسبب اختلافات اللزوجة والتأثير الذي تجلبه على التوتر السطحي الشحمي. يجب تمديد مدة الخطوة 2.3 للدهون المشحونة لأنه ، في الطبقة الأحادية ، تتنافر هذه الجزيئات المشحونة مع بعضها البعض ، مما يتطلب المزيد من الوقت للانتشار والتنظيم بشكل جيد في الواجهة بين خليط الدهون / الزيت و OB38. بالنسبة للدهون المدمجة مع البروتينات ذات الأهمية ، يوصى أيضا بتمديد هذه الخطوة لضمان تكوين أفضل للطبقة الأحادية52. بالنسبة لمحصول الجسيمات الشحمية للجسيمات الشحمية التي تغلف شبكة F-actin المبلمرة ، يبلغ عدد الجسيمات الشحمية لكل مجال رؤية (100 ميكرومتر × 100 ميكرومتر) حوالي 5-10 بمتوسط قطر 20 ميكرومتر. تظهر صورة مصغرة لعينة مجهرية نموذجية في الشكل 3B. يمكن العثور على المزيد من الصور البؤرية المصغرة للجسيمات الشحمية المنتجة من خلال طريقة المستحلب المقلوب في دراسة حديثة52 حيث تم تحسين المعلمات المختلفة (فرق الكثافة ، سرعة / وقت الطرد المركزي ، تركيز الدهون ، الرقم الهيدروجيني ، درجة الحرارة ، إلخ) لإنتاج الجسيمات الشحمية عالية الغلة.

لإعادة تشكيل شبكة F-actin ، من الضروري اختيار تركيز مناسب من الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) ، ثنائي ثيوثريتول (DTT) ، الأملاح المرتبطة بها ، وحالة الأس الهيدروجيني. يمكن إجراء نقطة تفتيش وسيطة لشبكة F-actin المعاد تشكيلها عن طريق مراقبة قطرات الدهون أحادية الطبقة مع الأكتين المغلف في الداخل. تظهر أشكال مختلفة من الأكتين المغلف داخل قطرة الدهون أحادية الطبقة في الشكل 2B. تحدث بلمرة الأكتين عند >20 ملليمتر كلفن + ملح وفي >0.2 مللي مترملغم 2+ الملح مع استقرار الرقم الهيدروجيني بين 6.5 و 8.5 ، كما ذكر سابقا53,54,55. قبل تصوير الجسيمات الشحمية ، تم الاحتفاظ بجميع المحاليل على الجليد لمنع بلمرة الأكتين المبكرة. تم تصوير العينات في درجة حرارة الغرفة لتحفيز بلمرة الأكتين. يتم تنظيم بنية شبكة F-actin المعاد تشكيلها في الغالب من خلال نشاط مجمع Arp2/3. النواة المعقدة Arp 2/3 والفروع تعمل خيوط الأكتين من جانب خيوط الأم الموجودة لتوليد معماريات تغصنية56,57. النيكل الدهني (DOGS-NTA-Ni) و VCA-His ضروريان لتشكيل طبقة F-actin. يعمل VCA-His كعامل تعزيز للنواة ، والذي يرتبط بدهون النيكل في الغشاء22,58. ثم يتم نواة شبكة F-actin متفرعة من VCA-His مما يسهل مجمع Arp2/3 ، ونتيجة لذلك ، يتم تشكيل قشرة F-actin كثيفة في النشرة الداخلية للغشاء الدهني. يحدد تركيز VCA-His داخل الجسيمات الشحمية سمك طبقة F-actin. كما أن إضافة البروتينات التنظيمية للأكتين (cofilin و gelsolin) تعزز أيضا تكوين طبقة F-actin. يقطع الكوفيلين خيوط الأكتين لزيادة عدد نهايات الخيوط ، بينما يرتبط الجيلسولين بالنهايات الشائكة لخيوط الأكتين للحد من نموها. وبالتالي ، في وجود cofilin و gelsolin ، يمكن نوى عدد أكبر من الخيوط بواسطة Arp2/3 ، ثم تجنيدها بواسطة VCA-His لتشكيل طبقة F-actin.

تم نشر أوراق مماثلة تستند إلى طريقة نقل المستحلب لتغليف البروتين في السنوات الأخيرة28،30،34. أحد الاختلافات الرئيسية بين البروتوكول هنا والبروتوكولات في هذه الأوراق هو اختيار الدهون الأولية للجسيمات الشحمية. في هذا العمل ، نستخدم L-α-phosphatidylcholine (EPC ، وهو مزيج من أنواع مختلفة من الفوسفاتيديل كولين يحتوي على حوالي 60٪ POPC59) كمكون رئيسي للغشاء الشحمي. لتشكيل طبقة F-actin ، تم استخدام خليط من EPC و Nickel-lipid (DOGS-NTA-Ni) بنسبة 10: 1. في عمل سابق ، انتشرت الجسيمات الشحمية على الزجاج المطلي بالبولي هيستيدين ، وتم خلط EPC والكوليسترول والنيكل والدهون بنسبة 53:37:1020. وبالمقارنة، اختار ناتسومي وآخرون وبشير زاده وآخرون الديولويل-فوسفوكولين (DOPC، وهو نوع واحد من الدهون الفوسفاتية) لتغليف الميكروسفير28 وحزم الأكتين الفاشي34، على التوالي، في حين أوصى فوجي وآخرون ب 1-بالميتويل-2-أوليويل-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC، وهو فوسفوليبيد اصطناعي نقي) كدهون أساسية لإنشاء تقنية تخليق البروتين الغشائي القائم على الجسيمات الشحمية30 . يؤثر اختيار الدهون الأولية على الخصائص الفيزيائية للجسيمات الشحمية. على سبيل المثال ، مع زيادة درجة عدم تشبع سلسلة الأسيل (أي POPC < EPC < DOPC60) ، تنخفض خصائص نفاذية الجزيئات المختلفة من خلال الطبقة الثنائية61. يعتمد الاختيار أيضا على الدهون ذات الاهتمام التي يتم خلطها. على سبيل المثال ، فإن إضافة الكوليسترول تجعل الجسيمات الشحمية EPC أكثر استقرارا ، في حين أنها تزعزع استقرار بنية الطبقة الثنائية لخليط DOPC / DOPE61.

أوجه التشابه بين هذا العمل ومنشور صدر مؤخرا عن بشير زاده وآخرين.34 تقع على نفس موضوع تغليف الأكتين. وفي الوقت نفسه، هناك فروق واضحة. أبلغ بشيرزاده وآخرون عن نهج cDICE معدل باستخدام غرفة دوارة مطبوعة 3D. هنا ، نعتمد طريقة نقل المستحلب المقلوب التقليدية البسيطة باستخدام حقنة وآلة طرد مركزي. تولد كلتا الطريقتين غلة عالية من الجسيمات الشحمية ولها كفاءة تغليف عالية للجزيئات الحيوية الكبيرة24. إلى جانب الاختلاف في مكونات الدهون كما ذكر أعلاه ، تتغير معماريات شبكة الأكتين المغلفة أيضا. قام بشير زاده وآخرون بتغليف حزم الأكتين الفاكن-أكتين داخل الجسيمات الشحمية، بينما في هذا العمل، قمنا بتغليف شبكة متفرعة تم تشغيلها بواسطة مجمع Arp2/3. بالإضافة إلى ذلك ، تم وضع تشكيل طبقة F-actin لإنشاء نظام محاكاة حيوية للقشرة في وجود VCA-His هنا.

الطريقة المذكورة هنا لها قيدان. أحدهما هو أن حجم الجسيمات الشحمية التي تتضمن شبكات الأكتين المعاد تشكيلها في المختبر لا يمكن التلاعب بها بدقة (يتراوح قطرها من 5 إلى 50 ميكرومتر) ، والعائد منخفض مقارنة بطريقة التكوين الكهربائي. القيد الآخر للطريقة القائمة على زيت الماء هو أن كميات ضئيلة من الزيت محاصرة بين المنشورات ثنائية الطبقة24. على الرغم من أنه لا يؤثر بشكل كبير على سمك الغشاء أو التوافق الحيوي لهذه الجسيمات الشحمية التي تحاكي بيولوجيا24،35،62،63 ، إلا أن ديناميكيات الغشاء للجسيمات الشحمية المدخلة بالزيت قد تتغير62. في هذه الطريقة ، يتم دمج نواة الأكتين Arp2/3. قد تشمل الدراسات المستقبلية بروتينات الهيكل الخلوي الأخرى 64،65،66،67 ، والنواة ، مثل الفورمين 68 ، أو المحركات الجزيئية مثل الميوسين II 69.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نحن نقر بتمويل ARO MURI W911NF-14-1-0403 إلى M.P.M. ، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 1R01GM126256 إلى M.P.M. ، والمعاهد الوطنية للصحة (NIH) U54 CA209992 ، و NIH RO1 GM126256 ، و NIH U54 CA209992 ، وجامعة ميشيغان / Genentech ، و SUBK00016255 و Human Frontiers Science Program (HFSP) رقم المنحة RGY0073/2018 إلى M.P.M. أي رأي أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المواد هي آراء المؤلفين (المؤلفين) ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر ARO أو NIH أو HFSP. وتقر س. س. بالمناقشات المثمرة مع ف. ياداف و س. موريسان و س. أميري.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)  Avanti Polar Lipids Inc. 231615773 Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802-25G DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AKL99-D non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AR05 fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383-10G ATP
Alexa Fluor 647 dye ThermoFisher fluorescent dye
Andor iQ3 Andor Technologies control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain Cytoskeleton, Inc RP01P-A Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate Sigma 10035048 CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) Quorum Technologies incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant Cytoskeleton, Inc CF01-C cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) Andor Technologies LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA Sigma G7528 glucose
Dithiothreitol DOT Scientific  DSD11000-10 DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant Cytoskeleton, Inc HPG6 gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip Cole-Parmer UX-07940-53 glass syringe
HEPES AmericanBio 7365-45-9
ImageJ/Fiji https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids Inc. 97281442 EPC
Magnesium chloride Sigma 7786303 MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil Sigma 8042475 mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) Thermo Fisher O12650 DHPE
Potassium chloride Sigma 7447407 KCl
Sucrose Sigma 57-50-1 sucrose
β-Casein from bovine milk Sigma C6905-250MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murrell, M., Oakes, P. W., Lenz, M., Gardel, M. L. Forcing cells into shape: the mechanics of actomyosin contractility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 486-498 (2015).
  2. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  3. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  4. Yousafzai, M., Yadav, V., Amiri, S., Errami, Y., Murrell, M. Active regulation of pressure and volume defines an energetic constraint on the size of cell aggregates. Physical Review Letters. 128 (4), 048103 (2022).
  5. Simon, C., et al. Actin dynamics drive cell-like membrane deformation. Nature Physics. 15 (6), 602-609 (2019).
  6. Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Developmental Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
  7. Bray, D., White, J. Cortical flow in animal cells. Science. 239 (4842), 883-888 (1988).
  8. Beaune, G., et al. Spontaneous migration of cellular aggregates from giant keratocytes to running spheroids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 12926-12931 (2018).
  9. Murrell, M. P., et al. Liposome adhesion generates traction stress. Nature Physics. 10 (2), 163-169 (2014).
  10. Lee, G., et al. Myosin-driven actin-microtubule networks exhibit self-organized contractile dynamics. Science Advances. 7 (6), (2021).
  11. Anderson, S., Garamella, J., Adalbert, S., McGorty, R., Robertson-Anderson, R. Subtle changes in crosslinking drive diverse anomalous transport characteristics in actin-microtubule networks. Soft Matter. 17 (16), 4375-4385 (2021).
  12. Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
  13. McCall, P. M., MacKintosh, F. C., Kovar, D. R., Gardel, M. L. Cofilin drives rapid turnover and fluidization of entangled F-actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12629-12637 (2019).
  14. Köhler, S., Schaller, V., Bausch, A. R. Structure formation in active networks. Nature Materials. 10 (6), 462-468 (2011).
  15. Koenderink, G. H., et al. An active biopolymer network controlled by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (36), 15192-15197 (2009).
  16. Seara, D. S., et al. Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin. Nature Communications. 9 (1), 1-10 (2018).
  17. Tabatabai, A. P., et al. Detailed balance broken by catch bond kinetics enables mechanical-adaptation in active materials. Advanced Functional Materials. 31 (10), 2006745 (2021).
  18. Murrell, M. P., Gardel, M. L. F-actin buckling coordinates contractility and severing in a biomimetic actomyosin cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (51), 20820-20825 (2012).
  19. Murrell, M., Gardel, M. L. Actomyosin sliding is attenuated in contractile biomimetic cortices. Molecular Biology of the Cell. 25 (12), 1845-1853 (2014).
  20. Murrell, M., et al. Spreading dynamics of biomimetic actin cortices. Biophysical Journal. 100 (6), 1400-1409 (2011).
  21. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nature Physics. 4 (10), 789-793 (2008).
  22. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  23. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  24. Litschel, T., Schwille, P. Protein reconstitution inside giant unilamellar vesicles. Annual Review of Biophysics. 50, 525-548 (2021).
  25. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  26. Limozin, L., Sackmann, E. Polymorphism of cross-linked actin networks in giant vesicles. Physical Review Letters. 89 (16), 168103 (2002).
  27. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  28. Natsume, Y., et al. Preparation of giant vesicles encapsulating microspheres by centrifugation of a water-in-oil emulsion. Journal of Visualized Experiments. (119), e55282 (2017).
  29. Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, I. s Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophysical Journal. 107 (2), 346-354 (2014).
  30. Fujii, S., et al. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nature Protocols. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  31. Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesiclelike compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. Journal of the American Chemical Society. 129 (42), 12608-12609 (2007).
  32. Okushima, S., Nisisako, T., Torii, T., Higuchi, T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 20 (23), 9905-9908 (2004).
  33. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  34. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
  35. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7 (1), 1-9 (2016).
  36. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  37. Vutukuri, H. R., et al. Active particles induce large shape deformations in giant lipid vesicles. Nature. 586 (7827), 52-56 (2020).
  38. Lemière, J., Carvalho, K., Sykes, C. Methods in Cell Biology. 128, Elsevier. 271-285 (2015).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Liman, J., et al. The role of the Arp2/3 complex in shaping the dynamics and structures of branched actomyosin networks. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (20), 10825-10831 (2020).
  41. Sun, Y., Leong, N. T., Wong, T., Drubin, D. G. A Pan1/End3/Sla1 complex links Arp2/3-mediated actin assembly to sites of clathrin-mediated endocytosis. Molecular Biology of the Cell. 26 (21), 3841-3856 (2015).
  42. Bretschneider, T., et al. Dynamic actin patterns and Arp2/3 assembly at the substrate-attached surface of motile cells. Current Biology. 14 (1), 1-10 (2004).
  43. Goley, E. D., et al. An actin-filament-binding interface on the Arp2/3 complex is critical for nucleation and branch stability. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 107 (18), 8159-8164 (2010).
  44. Svitkina, T. M., Borisy, G. G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. The Journal of Cell Biology. 145 (5), 1009-1026 (1999).
  45. Kelleher, J. F., Atkinson, S. J., Pollard, T. D. Sequences, structural models, and cellular localization of the actin-related proteins Arp2 and Arp3 from Acanthamoeba. The Journal of Cell Biology. 131 (2), 385-397 (1995).
  46. Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D., Lim, W. A. Integration of multiple signals through cooperative regulation of the N-WASP-Arp2/3 complex. Science. 290 (5492), 801-806 (2000).
  47. Delatour, V., et al. Arp2/3 controls the motile behavior of N-WASP-functionalized GUVs and modulates N-WASP surface distribution by mediating transient links with actin filaments. Biophysical Journal. 94 (12), 4890-4905 (2008).
  48. Izdebska, M., Zielińska, W., Hałas-Wiśniewska, M., Grzanka, A. Involvement of actin and actin-binding proteins in carcinogenesis. Cells. 9 (10), 2245 (2020).
  49. Schäfer, E., Kliesch, T. -T., Janshoff, A. Mechanical properties of giant liposomes compressed between two parallel plates: impact of artificial actin shells. Langmuir. 29 (33), 10463-10474 (2013).
  50. Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  51. Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
  52. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  53. Vale, R. Reconstituting the Cytoskeleton. , Academic Press. (2014).
  54. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Mechanism of K+-induced actin assembly. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 648-654 (1982).
  55. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of pH on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 27 (20), 7766-7772 (1988).
  56. Wegner, A. M., et al. N-wasp and the arp2/3 complex are critical regulators of actin in the development of dendritic spines and synapses. Journal of Biological Chemistry. 283 (23), 15912-15920 (2008).
  57. Blanchoin, L., et al. Direct observation of dendritic actin filament networks nucleated by Arp2/3 complex and WASP/Scar proteins. Nature. 404 (6781), 1007-1011 (2000).
  58. Römer, W., et al. Actin dynamics drive membrane reorganization and scission in clathrin-independent endocytosis. Cell. 140 (4), 540-553 (2010).
  59. Popova, A. V., Hincha, D. K. Effects of flavonol glycosides on liposome stability during freezing and drying. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1858 (12), 3050-3060 (2016).
  60. Harrigan, P., Madden, T., Cullis, P. Protection of liposomes during dehydration or freezing. Chemistry and Physics of Lipids. 52 (2), 139-149 (1990).
  61. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9 (1), 467-508 (1980).
  62. Campillo, C., et al. Unexpected membrane dynamics unveiled by membrane nanotube extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  63. Deng, N. -N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. Monodisperse uni-and multicompartment liposomes. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7584-7591 (2016).
  64. Ricketts, S. N., Ross, J. L., Robertson-Anderson, R. M. Co-entangled actin-microtubule composites exhibit tunable stiffness and power-law stress relaxation. Biophysical journal. 115 (6), 1055-1067 (2018).
  65. Sheung, J. Y., et al. Motor-driven restructuring of cytoskeleton composites leads to tunable time-varying elasticity. ACS Macro Letters. 10 (9), 1151-1158 (2021).
  66. Falzone, T. T., Blair, S., Robertson-Anderson, R. M. Entangled F-actin displays a unique crossover to microscale nonlinearity dominated by entanglement segment dynamics. Soft Matter. 11 (22), 4418-4423 (2015).
  67. Francis, M. L., et al. Non-monotonic dependence of stiffness on actin crosslinking in cytoskeleton composites. Soft Matter. 15 (44), 9056-9065 (2019).
  68. Yadav, V., et al. Filament nucleation tunes mechanical memory in active polymer networks. Advanced Functional Materials. 29 (49), 1905243 (2019).
  69. Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. Methods in Enzymology. 540, Elsevier. 265-282 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 186 ،
<em>في المختبر</em> إعادة تشكيل الهيكل الخلوي للأكتين داخل حويصلات يونيلاميلار العملاقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. … More

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (186), e64026, doi:10.3791/64026 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter