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Bioengineering

In vitro Reconstitution du cytosquelette d’actine à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/64026
Automatic Translation
1, 2,3, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Yale University, 2Systems Biology Institute, Yale University, 3Department of Physics, Yale University

Summary

Dans ce manuscrit, nous démontrons les techniques expérimentales pour encapsuler le cytosquelette F-actine dans des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (également appelées liposomes), et la méthode pour former une couche de F-actine biomitant le cortex au niveau du feuillet interne de la membrane liposomique.

Abstract

Le cytosquelette d’actine, la principale machinerie mécanique de la cellule, intervient dans de nombreuses activités cellulaires physiques essentielles, notamment la déformation, la division, la migration et l’adhésion cellulaires. Cependant, l’étude de la dynamique et de la structure du réseau d’actine in vivo est compliquée par la régulation biochimique et génétique au sein des cellules vivantes. Pour construire un modèle minimal dépourvu de régulation biochimique intracellulaire, l’actine est encapsulée dans des vésicules unilamellaires géantes (GUV, également appelées liposomes). Les liposomes biomimétiques sont de la taille d’une cellule et facilitent un aperçu quantitatif des propriétés mécaniques et dynamiques du réseau de cytosquelettes, ouvrant une voie viable pour la biologie synthétique ascendante. Pour générer des liposomes pour l’encapsulation, la méthode d’émulsion inversée (également appelée méthode de transfert d’émulsion) est utilisée, qui est l’une des techniques les plus efficaces pour encapsuler des solutions complexes dans des liposomes afin de préparer divers systèmes imitant les cellules. Avec cette méthode, un mélange de protéines d’intérêt est ajouté au tampon interne, qui est ensuite émulsionné dans une solution d’huile minérale contenant des phospholipides pour former des gouttelettes lipidiques monocouches. Les liposomes souhaités sont générés à partir de gouttelettes lipidiques monocouches traversant une interface lipide/huile-eau. Cette méthode permet l’encapsulation de polymères d’actine concentrés dans les liposomes avec les composants lipidiques souhaités, ouvrant la voie à la reconstitution in vitro d’un réseau de cytosquelettes biomimiques.

Introduction

Le cytosquelette d’actine joue un rôle fondamental dans la construction de l’architecture intracellulaire de la cellule en coordonnant la contractilité au niveau moléculaire et la génération de force 1,2,3. En conséquence, il intervient dans de nombreuses activités cellulaires essentielles, notamment la déformation cellulaire4,5, la division6, la migration 7,8 et l’adhésion9. La reconstitution in vitro des réseaux d’actine a attiré énormément d’attention ces dernières années 10,11,12,13,14,15,16,17. Le but de la reconstitution est de construire un modèle minimal de la cellule dépourvu de la régulation biochimique complexe qui existe dans les cellules vivantes. Cela offre un environnement contrôlable pour sonder des activités intracellulaires spécifiques et facilite l’identification et l’analyse des différents composants du cytosquelette d’actine18,19. De plus, l’encapsulation de réseaux d’actine in vitro à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes phospholipides (GUV, liposomes) fournit un espace confiné mais déformable avec une limite semi-perméable. Il imite le microenvironnement physiologique et mécanique de la machinerie d’actine dans la cellule 9,20,21,22.

Parmi les différentes méthodes de préparation des liposomes, la méthode d’hydratation du film lipidique (également connue sous le nom de méthode de gonflement) est l’une des premières techniques23. Le film lipidique sec s’hydrate avec l’ajout de tampons, formant des bulles membraneuses qui finissent par devenir des vésicules24. Pour produire des vésicules plus grandes avec un rendement plus élevé, une méthode améliorée passant de la méthode d’hydratation du film, connue sous le nom de méthode d’électroformation25, applique un champ électrique AC pour favoriser efficacement le processus d’hydratation26. Les principales limites de ces méthodes basées sur l’hydratation pour l’encapsulation de l’actine sont qu’elles ont une faible efficacité d’encapsulation des protéines hautement concentrées, et qu’elles ne sont compatibles qu’avec des compositions lipidiques spécifiques24. La technique de l’émulsion inversée, en comparaison, a moins de limitations pour les composants lipidiques et les concentrations de protéines20,27,28,29. Dans cette méthode, un mélange de protéines pour l’encapsulation est ajouté au tampon aqueux interne, qui est ensuite émulsionné dans une solution d’huile minérale contenant des lipides, formant des gouttelettes lipides-monocouches. Les gouttelettes lipidiques monocouches traversent ensuite une autre interface lipide/huile-eau par centrifugation pour former des vésicules lipidiques bicouches (liposomes). Cette technique s’est avérée être l’une des stratégies les plus efficaces pour l’encapsulation d’actine24,30. Séparément, il existe certaines méthodes de dispositifs microfluidiques, notamment le jet pulsé31,32, l’éjection à membrane transitoire 33 et la méthode cDICE 34. Les similitudes entre la méthode d’émulsion inversée et la méthode microfluidique sont le solvant lipidique (huile) utilisé et l’introduction d’une interface lipide/huile-eau pour la formation du feuillet externe des liposomes. En revanche, la génération de liposomes par la méthode microfluidique nécessite une mise en place de dispositifs microfluidiques et s’accompagne d’huile piégée entre les deux feuillets de la bicouche, ce qui nécessite une étape supplémentaire pour l’élimination de l’huile35.

Dans ce manuscrit, nous avons utilisé la technique de l’émulsion inversée pour préparer des liposomes encapsulant un réseau d’actine F polymérisé tel qu’utilisé précédemment22. Le mélange de protéines pour l’encapsulation a d’abord été placé dans un tampon avec des conditions non polymérisantes pour maintenir l’actine sous sa forme globulaire (G). L’ensemble du processus a été effectué à 4 ° C pour empêcher la polymérisation précoce de l’actine, qui a ensuite été déclenchée en permettant à l’échantillon de se réchauffer à température ambiante. Une fois à température ambiante, l’actine polymérise sous sa forme filamenteuse (F). Une variété de protéines liant l’actine peuvent être ajoutées à la solution tampon aqueuse interne pour étudier les fonctionnalités et les propriétés des protéines, fournissant ainsi des informations supplémentaires sur son interaction avec le réseau d’actine et la surface de la membrane. Cette méthode peut également être appliquée à l’encapsulation de diverses protéines d’intérêt36 et de grands objets (microparticules, micronageurs automoteurs, etc.) proches de la taille des liposomesfinaux28,37.

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Protocol

1. Préparation des tampons et des solutions protéiques

  1. Préparer le tampon aqueux de non-polymérisation interne (INP) dans un volume total de 5 mL en mélangeant 0,1 mM de CaCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM de DTT, 0,5 mM de Dabco, 320 mM de saccharose et0,2 mM d’ATP.
  2. Préparer le mélange de protéines (PM) en ajoutant des protéines au tampon INP à 4 °C avec les concentrations suivantes : 11,2 μM de G-actine non fluorescente, 2,8 μM d’actine marquée par fluorescence et 0,24 μM d’Arp2/3 (Tableau des matériaux). Pour former une couche d’actine F, ajoutez 100 nM de gelsoline, 4 μM de cofiline et 2,2 μM de VCA-His au PM. Comme expérience de contrôle, remplacer les particules par un colorant fluorescent de 100 μg/mL (Tableau des matériaux).
  3. Préparer le tampon aqueux de polymérisation interne (IP) (aqueux) dans un volume total de 5 mL en mélangeant 100 mM KCl, 4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 10 mM ATP et 80 mM saccharose.
  4. Préparer le tampon final (FB) en mélangeant le tampon INP (contenant PM) et le tampon IP à un rapport volumique de 1:1 pour obtenir la solution aqueuse interne dans un volume total de 30 μL qui sera encapsulé dans le liposome.
  5. Préparer le tampon extérieur aqueux (OB) dans un volume total de 150 μL en mélangeant 10 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KCl, 2mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, 2mM ATP, 1 mM DTT, 0,5 mM Dabco, 212 mM glucose et0,1 mg/mL β-caséine.
    REMARQUE: L’osmolarité de l’OB peut être ajustée avec du glucose pour s’assurer que la pression osmotique de l’OB est légèrement supérieure à celle de l’OB (20-60 mOsm). La densité de la FB devrait être légèrement supérieure à celle de l’OB.

2. Préparation de liposomes basée sur les techniques d’émulsion inversée

  1. Préparer le mélange lipide-huile
    1. Ajouter 100 μL de 25 mg/mL de L-α-phosphatidylcholine (Egg PC non fluorescent, aussi appelé EPC, y compris 1 % de DHPE) dans un flacon en verre. Évaporer le chloroforme avec du gaz argon, en laissant un film lipidique solide sec (2,5 mg) au fond du flacon.
      1. Pour former une couche de F-actine, ajouter du sel de 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacétique] succinyl} nickel (DOGS-NTA-Ni) dans un rapport de 10:1 EPC / DOGS-NTA-Ni et mélanger avant l’évaporation du chloroforme.
    2. Ajouter 2 mL d’huile minérale et sonifier le mélange lipide-huile à température ambiante dans un bain pendant 1 h pour remettre les lipides en suspension.
      REMARQUE: Le mélange lipide-huile après sonication peut être conservé pendant 1 semaine à 4 ° C. La ré-sonication est suggérée avant utilisation.
  2. Préparer une émulsion finale de tampon dans l’huile (FB/huile) pour préparer des gouttelettes lipidiques monocouches contenant la protéine d’intérêt.
    1. À 100 μL de mélange lipide-huile pris dans un tube en plastique, ajouter 10 μL de FB. Assurez-vous que FB est dans une gouttelette.
    2. À l’aide d’une seringue en verre, prélever le mélange lipide-huile-FB et aspirer doucement de haut en bas plusieurs fois pour l’émulsionner; prélever d’abord une petite quantité de mélange lipide-huile, puis la gouttelette FB en plaçant l’extrémité de la seringue à la périphérie de la gouttelette pour la briser en minuscules gouttelettes. Répétez l’aspiration de haut en bas jusqu’à ce qu’une émulsion blanchâtre et trouble se forme.
  3. Mettez 30 μL d’OB dans un tube en plastique séparé. Placez 30 μL du mélange lipide-huile sur l’OB et laissez-le reposer pendant ~ 10 minutes pour développer une monocouche lipidique à l’interface.
    REMARQUE: Si les lipides sont chargés ou si la protéine est incorporée, la durée de cette étape doit être prolongée38.
  4. Préparer les liposomes
    1. Ajouter délicatement 50 μL de l’émulsion FB/huile (étape 2.2) à la phase huileuse supérieure du tube à partir de l’étape 2.3.
    2. Centrifuger le tube en plastique à 100 x g pendant 15 minutes à 4 °C. Variez le temps et la vitesse de centrifugation pour optimiser la formation de liposomes.
      REMARQUE: Après la centrifugation, la phase supérieure de l’huile doit être claire et l’OB inférieur (contenant des liposomes) doit être légèrement trouble.
    3. Retirez délicatement la phase huileuse à l’aide d’une pipette. Aspirez un volume supplémentaire si nécessaire. Assurez-vous de ne pas placer l’embout de la pipette sur le côté du tube pour éviter de créer un ménisque d’huile au-dessus de la phase liposomique.
    4. Avec une nouvelle pipette, collez lentement l’embout de la pipette dans la phase inférieure restante et aspirez le volume aqueux pour recueillir les liposomes.
      REMARQUE: Il est préférable de perdre du volume que d’incorporer l’huile. L’inclusion d’huile provoquera la rupture des liposomes et les composants internes seront libérés dans le tampon externe. Coupez l’extrémité d’une pipette pour réduire le cisaillement.

3. Observation microscopique

  1. Verser 100 μL d’OB dans le puits d’une chambre d’incubation (plaque à 4 puits contenant des lamelles de couverture rondes de 12 mm). Déposer délicatement les liposomes collectés (étape 2.4.4) dans l’OB, puis placer une autre lamelle de couverture sur le dessus de la chambre.
    REMARQUE: L’OB contient la β-caséine pour passiver la surface du verre et minimiser le collage entre les liposomes20.
  2. Observez les liposomes avec un microscope confocal à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 63x. Utilisez des raies laser de 488 nm, 647 nm et 561 nm pour observer respectivement les lipides marqués par fluorescence, les colorants fluorescents encapsulés et l’actine encapsulée marquée par fluorescence. Capturez les images d’intérêt et enregistrez les images au format TIFF.
  3. Traiter et analyser des images dans ImageJ/Fiji39. Pour les nouveaux utilisateurs d’ImageJ/Fiji, un tutoriel en ligne est disponible (voir le tableau des matériaux).
    1. Ouvrez le fichier TIFF à l’aide du logiciel ImageJ/Fiji.
    2. Accédez à Image > Réglez > luminosité/contraste. Ajustez la luminosité et le contraste de l’image à l’échelle souhaitée en ajustant les paramètres Minimum et Maximum , ainsi que les curseurs Luminosité et Contraste .
    3. Cliquez sur l’outil de sélection de rectangle dans la barre d’outils et sélectionnez la région d’intérêt (ROI). Accédez à Image > Recadrer pour recadrer le retour sur investissement.
    4. Allez à Analyser > échelle définie. Dans la fenêtre contextuelle, entrez 1.0 dans le champ Format des pixels et définissez μm comme unité de longueur. Dans le champ Distance en pixels, entrez la largeur de l’image en pixels . Dans le champ Distance connue , entrez la largeur réelle de l’image en microns.
    5. Pour mesurer la taille du liposome, à l’aide de l’outil de sélection ovale de la barre d’outils, tracez un cercle le long du bord du liposome. Allez à Analyser > Mesure pour mesurer la surface du cercle, à partir de laquelle le diamètre du liposome peut être calculé.

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Representative Results

La préparation des liposomes basée sur la technique de l’émulsion inversée est illustrée graphiquement et schématiquement sur la figure 1.

Tout d’abord, des liposomes vides (nus) (~5-50 μm de diamètre) composés de phospholipides (EPC) et de lipides fluorescents (DHPE) ont été préparés. Un colorant fluorescent rouge vif a été encapsulé dans des liposomes nus comme expérience de contrôle. Il a été possible de déterminer si une monocouche lipidique s’est formée avec succès dans la périphérie de la gouttelette en observant des gouttelettes lipidiques monocouches incorporant un colorant fluorescent dans l’émulsion, comme le montre la figure 2A. La génération réussie de liposomes a pu être vérifiée par la visualisation de l’anneau circulaire mince, qui est la bicouche lipidique fluorescente verte (conjugaison des lipides avec DHPE), sous laser 488 nm par microscopie confocale (Figure 2A, panneau le plus à droite). Pour confirmer l’encapsulation du colorant fluorescent, l’environnement interne des liposomes doit être uniformément fluorescent sous un laser de 647 nm (Figure 2A; image superposée) en raison du colorant fluorescent rouge lointain (Tableau des matériaux).

Différentes formes d’actine encapsulée à l’intérieur de la gouttelette lipidique monocouche sont illustrées à la figure 2B. Les images de gauche à droite montrent l’actine globulaire (G-actine), l’actine filamenteuse (F-actine), l’actine formant une fine couche de F-actine avec l’ajout de VCA-His au tampon final et de nickel-lipide à la membrane, et l’actine formant une fine couche de F-actine avec l’ajout de VCA-His, de cofiline et de gelsoline au tampon final et de nickel-lipide à la membrane.

Ensuite, la G-actine purifiée et les protéines de liaison à la F-actine associées ont été encapsulées dans le liposome. Composés des mêmes composants membranaires que ci-dessus (EPC mélangé avec DHPE), les liposomes avaient ici ~5-50 μm de diamètre. La formation des liposomes a pu être visualisée par les minces anneaux circulaires verts montrés à la figure 3A,B. La polymérisation de l’actine a été déclenchée en permettant à l’échantillon de se réchauffer à température ambiante. Comme le montre la figure 3A, les réseaux F-actine reconstitués (avec 20% d’actine marquée par fluorescence) à l’intérieur des liposomes sont hétérogènes, se manifestant par des structures de réseau ramifiées de filaments d’actine. L’architecture ramifiée a été déclenchée par l’introduction du complexe Arp2/3, qui contrôle simultanément la nucléation et la ramification des filaments d’actine, ainsi que VCA-His 40,41,42,43,44,45.

Enfin, un système de biomimétisme du cortex F-actine a été créé. Une fine couche d’actine F, mais densément ramifiée, a été créée au niveau du feuillet interne de la bicouche de liposomes22, qui pourrait être visualisée comme une coquille fluorescente (Figure 3C). Dans ce cas, en outre, VCA-His, la cofiline et la gelsoline ont été encapsulés dans des liposomes. Des lipides de nickel étaient nécessaires dans le composant de la membrane lipidique. VCA-His, un fragment WASP, porte une étiquette d’histidine en interaction avec les lipides de nickel de la membrane lipidique. En attendant, il recrute le complexe Arp2/3 20,46,47,48. En conséquence, l’actine nucléée par le complexe Arp2/3 génère une couche de F-actine enrobée le long de la couche interne de la membrane en présence de cofiline et de gelsoline.

Figure 1
Figure 1 : Préparation des liposomes basée sur la technique de l’émulsion inversée. (A) La préparation des liposomes se compose de deux étapes. Première étape : Une gouttelette de 10 μL de tampon final (FB) portant des protéines d’intérêt a été ajoutée à 100 μL du mélange phospholipide-huile dans un rapport de 1:10 et suspendue en aspirant doucement de haut en bas avec une seringue en verre. Les solutions contenant des gouttelettes lipidiques monocouches sont devenues blanchâtres après l’aspiration aller-retour. Deuxième étape: Dans un tube en plastique séparé, quelques microlitres du mélange lipide-huile ont été placés sur la même quantité d’OB et laissés reposer pendant ~ 10 minutes pour développer une monocouche lipidique à l’interface OB / huile. L’émulsion de la première étape a été versée sur la phase huileuse de la deuxième étape et a été centrifugée (100 x g; 15 minutes) à 4 °C. Après la centrifugation, la solution d’huile supérieure doit être limpide et la solution inférieure d’OB (contenant des liposomes) doit être légèrement trouble. (B) Schémas de la préparation de liposomes à partir d’une émulsion inversée. L’émulsion blanchâtre sur le dessus contenait des gouttelettes lipidiques monocouches qui incorporaient un réseau d’actine ramifié à l’intérieur. Pendant la centrifugation, des gouttelettes lipidiques monocouches ont traversé l’interface OB / huile pour former un feuillet externe tel que des liposomes ont été créés et accumulés au fond du tube en plastique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Images microscopiques de la gouttelette lipidique monocouche. (A) La gouttelette lipidique monocouche incorporant un colorant fluorescent dans l’émulsion. Les images de gauche à droite montrent une gouttelette lipidique monocouche sous le canal DIC, un canal fluorescent de 640 nm, une superposition du canal DIC et 640 nm, et un canal fluorescent de 488 nm, respectivement. (B) Différentes formes d’actine encapsulée à l’intérieur de la gouttelette lipidique monocouche sous un canal fluorescent de 561 nm. Les images de gauche à droite montrent l’actine globulaire (G-actine), l’actine filamenteuse (F-actine), l’actine formant une fine couche de F-actine avec l’ajout de VCA-His au tampon final et de nickel-lipide à la membrane, et l’actine formant une fine couche de F-actine avec l’ajout de VCA-His, de cofiline et de gelsoline au tampon final et de nickel-lipide à la membrane. Les barres d’échelle sont de 10 μm à un grossissement de 63x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Images microscopiques de l’encapsulation des réseaux d’actine à l’intérieur des liposomes. (A) Un réseau d’actine F ramifié polymérisé encapsulant des liposomes (Arp 2/3 nucléé). De gauche à droite : canal fluorescent 488 nm (gauche), canal fluorescent 561 nm (centre), superposition (droite). (B) Un résultat représentatif des suspensions de liposomes encapsulant des réseaux ramifiés polymérisés (Arp 2/3 nucléés) F-actine. De gauche à droite : canal fluorescent 488 nm (gauche), canal fluorescent 561 nm (centre) et superposition (droite). (C) L’apparition de la formation d’une couche mince mais dense de F-actine enrobée le long de la couche interne de la membrane lipidique d’un liposome. De haut en bas : canal fluorescent 488 nm (haut), canal fluorescent 561 nm (centre), superposition (bas). Les barres d’échelle sont de 10 μm à un grossissement de 63x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Plusieurs étapes clés déterminent le succès d’un rendement élevé en liposomes pendant le processus de préparation. Pour dissoudre complètement le film lipidique dans l’huile, l’échantillon doit être soniqué jusqu’à ce que le film lipidique au fond du flacon en verre disparaisse complètement. Après la sonication, le mélange lipide-huile doit être stocké pendant la nuit à température ambiante dans des conditions sombres pour que les molécules lipidiques se dispersent davantage29. Le mélange peut être conservé à 4 °C jusqu’à une semaine. Lors de la préparation d’une émulsion FB / huile avec des gouttelettes lipidiques monocouches contenant une protéine d’intérêt, le mélange lipide-huile-FB doit être doucement pompé d’avant en arrière à travers une seringue en verre pour éviter l’introduction de bulles d’air. Au cours de ce processus, une grosse gouttelette est cisaillée à l’extrémité de la seringue en verre en plusieurs gouttelettes plus petites (~ 5-100 μm de diamètre) après plusieurs répétitions. Le mélange doit être blanchâtre après le processus30. Pour vérifier la qualité des phospholipides et si une monocouche lipidique s’était formée avec succès dans la périphérie de la gouttelette contenant FB, des gouttelettes lipidiques monocouches incorporant un colorant fluorescent ont été examinées dans l’émulsion, comme le montre la figure 2A. Pour assurer le passage des gouttelettes lipidiques monocouches à travers l’interface OB / huile pendant la centrifugation et permettre aux liposomes collectés dans OB de se déposer sur la surface du verre, la densité de FB doit être légèrement supérieure à celle de l’OB. Par conséquent, le saccharose et le glucose ont été choisis comme composant principal des solutions aqueuses internes (FB) et externes (OB), respectivement. Dans les travaux précédents, le dextrane a été utilisé pour ajuster la densité de la solution aqueuse interne20, qui n’est pas incluse dans ce protocole. De plus, l’osmolarité de l’OB a été ajustée avec du glucose de telle sorte que la pression osmotique de l’OB est légèrement supérieure à celle de FB (20-60 mOsm) comme indiqué dans les travaux précédents20,22. Une grande différence d’osmolarité a conduit au rétrécissement (lorsque l’osmolarité de l’OB est supérieure à celle de FB) ou à la rupture (lorsque l’osmolarité de la FB est supérieure à celle de l’OB) des liposomes. Un osmomètre a été utilisé pour vérifier les osmolarités des tampons. Dans le protocole, de la β-caséine a été ajoutée dans l’OB pour passiver à la fois les surfaces des tubes en plastique et les surfaces en verre de la chambre d’imagerie et minimiser le collage entre les liposomes20,49. L’huile minérale a été utilisée comme solution d’huile (c.-à-d. le solvant lipidique). Différents solvants lipidiques ont été rapportés ailleurs, notamment le dodécane 50, la paraffine liquide30, le squalane51, etc. En conséquence, différentes vitesses et durées de centrifugation sont utilisées pour divers solvants lipidiques en raison de leurs différences de viscosité et de l’influence qu’ils apportent sur la tension superficielle des liposomes. La durée de l’étape 2.3 doit être prolongée pour les lipides chargés car, dans la monocouche, ces molécules chargées se repoussent, nécessitant ainsi plus de temps pour diffuser et bien s’organiser à l’interface entre le mélange lipide/huile et OB38. Pour les lipides incorporés avec des protéines d’intérêt, une extension de cette étape est également recommandée pour assurer une meilleure formation de monocouche52. Pour le rendement en liposomes des liposomes encapsulant un réseau F-actine polymérisé, le nombre de liposomes par champ de vision (100 μm x 100 μm) est d’environ 5-10 avec un diamètre moyen de 20 μm. Une image agrandie d’un échantillon typique de microscopie est illustrée à la figure 3B. Des images confocales plus agrandies des liposomes produits par la méthode de l’émulsion inversée peuvent être trouvées dans une étude récente52 où divers paramètres (différence de densité, vitesse/temps de centrifugation, concentration lipidique, pH, température, etc.) ont été optimisés pour la production de liposomes à haut rendement.

Pour la reconstitution du réseau F-actine, il est essentiel de choisir une concentration appropriée de l’adénosine triphosphate (ATP), du dithiothréitol (DTT), des sels associés et de l’état du pH. Un point de contrôle intermédiaire du réseau F-actine reconstitué peut être fait en observant des gouttelettes lipidiques monocouches avec de l’actine encapsulée à l’intérieur. Différentes formes d’actine encapsulée à l’intérieur de la gouttelette lipidique monocouche sont illustrées à la figure 2B. La polymérisation de l’actine se produit à >20 mM de sel K+ et dans >0,2 mM de sel Mg2+ avec un pH stabilisé entre 6,5 et 8,5, comme indiqué précédemment53,54,55. Avant l’imagerie des liposomes, toutes les solutions étaient conservées sur la glace pour empêcher la polymérisation précoce de l’actine. Les échantillons ont été imagés à température ambiante pour déclencher la polymérisation de l’actine. L’architecture du réseau F-actine reconstitué est principalement régulée par l’activité du complexe Arp2/3. Le complexe Arp 2/3 nuclée et ramifie les filaments d’actine du côté d’un filament mère existant pour générer des architectures dendritiques56,57. Le nickel-lipide (DOGS-NTA-Ni) et le VCA-His sont essentiels à la formation de la couche F-actine. VCA-His sert de facteur favorisant la nucléation, qui est lié aux lipides de nickel à la membrane22,58. Un réseau ramifié F-actine est ensuite nucléé à partir de VCA-His facilitant le complexe Arp2/3, et par conséquent, une coquille dense de F-actine est formée au niveau du feuillet interne de la membrane lipidique. La concentration de VCA-His dans le liposome détermine l’épaisseur de la couche de F-actine. L’ajout des protéines régulatrices de l’actine (cofiline et gelsoline) favorise également la formation de la couche F-actine. La cofiline coupe les filaments d’actine pour augmenter le nombre d’extrémités de filaments, tandis que la gelsoline se lie aux extrémités barbelées des filaments d’actine pour limiter leur croissance. Ainsi, en présence de cofiline et de gelsoline, un plus grand nombre de filaments peuvent être nucléés par Arp2/3, puis recrutés par VCA-His pour former la couche F-actine.

Des articles similaires basés sur la méthode de transfert d’émulsion pour l’encapsulation de protéines ont été publiés ces dernières années 28,30,34. Une différence majeure entre le protocole ici et les protocoles de ces articles est le choix du lipide primaire pour les liposomes. Dans ce travail, nous utilisons la L-α-phosphatidylcholine (EPC, un mélange de différentes espèces de phosphatidylcholine contenant environ 60% de POPC59) comme composant principal de la membrane des liposomes. Pour former une couche de F-actine, un mélange de l’EPC et du nickel-lipide (DOGS-NTA-Ni) a été utilisé dans un rapport de 10:1. Dans un travail précédent, les liposomes ont été étalés sur du verre recouvert de polyhistidine, et l’EPC, le cholestérol et le nickel-lipide ont été mélangés dans un rapport de 53: 37: 1020. En comparaison, Natsume et al. et Bashirzadeh et al. ont choisi la dioléoyl-phosphocholine (DOPC, un seul type de phospholipide) pour encapsuler les microsphères28 et les faisceaux de fascine-actine34, respectivement, tandis que Fujii et al. ont recommandé le 1-Palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC, un phospholipide synthétique pur) comme lipide primaire pour établir une technologie de synthèse des protéines membranaires à base de liposomes30 . Le choix des lipides primaires affecte les propriétés physiques des liposomes. Par exemple, à mesure que le degré d’insaturation de la chaîne acyle augmente (c.-à-d. POPC< EPC< DOPC60), les propriétés de perméabilité de diverses molécules à travers la bicouche diminuent61. Le choix dépend également du mélange des lipides d’intérêt. Par exemple, l’ajout du cholestérol rend les liposomes EPC plus stables, tout en déstabilisant la structure bicouche du mélange DOPC/DOPE61.

Les similitudes entre ce travail et une publication récente de Bashirzadeh et al.34 portent sur le même sujet de l’encapsulation de l’actine. Entre-temps, il y a des distinctions claires. Bashirzadeh et al. ont rapporté une approche cDICE modifiée utilisant une chambre tournante imprimée en 3D. Ici, nous adoptons la méthode simple et traditionnelle de transfert d’émulsion inversée à l’aide d’une seringue et d’une centrifugeuse. Ces deux méthodes génèrent un rendement élevé en liposomes et ont des rendements d’encapsulation élevés pour les grosses biomolécules24. Outre la différence dans les composants lipidiques comme mentionné ci-dessus, les architectures du réseau d’actine encapsulée changent également. Bashirzadeh et al. ont encapsulé des faisceaux de fascine-actine dans le liposome, tandis que dans ce travail, nous avons encapsulé un réseau ramifié déclenché par le complexe Arp2/3. De plus, la formation d’une couche F-actine pour créer un système cortex-biomimique en présence de VCA-His a été élaborée ici.

La méthode décrite ici a deux limites. La première est que la taille des liposomes qui incorporent in vitro des réseaux d’actine reconstitués ne peut pas être manipulée avec précision (variant de 5 à 50 μm de diamètre), et le rendement est faible par rapport à la méthode d’électroformation. L’autre limitation d’une méthode à base d’huile d’eau est que des traces d’huile sont piégées entre les folioles bicouches24. Bien que cela n’affecte pas de manière significative l’épaisseur de la membrane ou la biocompatibilité de ces liposomes bio-imitant 24,35,62,63, la dynamique membranaire des liposomes insérés dans l’huile peut être altérée 62. Dans cette méthode, le nucléateur d’actine Arp2/3 est incorporé. Les études futures pourraient inclure d’autres protéines du cytosquelette 64,65,66,67, des nucléateurs, tels que la formine68, ou des moteurs moléculaires tels que la myosine II 69.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous reconnaissons le financement ARO MURI W911NF-14-1-0403 à M.P.M., le National Institutes of Health (NIH) R01 1R01GM126256 à M.P.M., les National Institutes of Health (NIH) U54 CA209992, NIH RO1 GM126256, NIH U54 CA209992, University of Michigan / Genentech, SUBK00016255 et Human Frontiers Science Program (HFSP) numéro de subvention RGY0073/2018 à M.P.M. Toute opinion, constatation, conclusion ou recommandation exprimée dans ce document est celle de l’auteur (s) et ne reflète pas nécessairement les points de vue de l’ARO, des NIH ou du HFSP. S.C. reconnaît les discussions fructueuses avec V. Yadav, C. Muresan et S. Amiri.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-{[n(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid]succinyl} nickel salt (DOGS-NTA-Ni)  Avanti Polar Lipids Inc. 231615773 Nickel Lipid
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane Sigma D27802-25G DABCO
Actin protein (>99% pure): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AKL99-D non-fluorescent G-actin
Actin protein (rhodamine): rabbit skeletal muscle Cytoskeleton, Inc AR05 fluorescently labeled actin
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma A2383-10G ATP
Alexa Fluor 647 dye ThermoFisher fluorescent dye
Andor iQ3 Andor Technologies control and acquisition software for confocal microscope
Arp2/3 Protein Complex: Porcine Brain Cytoskeleton, Inc RP01P-A Arp 2/3
Calcium chloride dihydrate Sigma 10035048 CaCl2
Chamlide Chambers (4-well for 12 mm round coverslip) Quorum Technologies incubation chamber
Cofilin protein: human recombinant Cytoskeleton, Inc CF01-C cofilin
Confocal Microscope (63× oil-immersion objective) Andor Technologies LEICA DMi8
D-(+)-GLUCOSE BIOXTRA Sigma G7528 glucose
Dithiothreitol DOT Scientific  DSD11000-10 DTT
Gelsolin Protein: Homo Sapiens Recombinant Cytoskeleton, Inc HPG6 gelsolin
Hamilton 1750 Gastight Syringe, 500 µL, cemented needle, 22 G, 2" conical tip Cole-Parmer UX-07940-53 glass syringe
HEPES AmericanBio 7365-45-9
ImageJ/Fiji https://imagej.net/tutorials/
L-alpha-Phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids Inc. 97281442 EPC
Magnesium chloride Sigma 7786303 MgCl2
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil Sigma 8042475 mineral oil
N-WASP fragment WWA (aa400–501, VCA-His) VCA-His is purified using lab protocol. The protocol can be provided upon reasonable requests
Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine (Oregon Green 488 DHPE) Thermo Fisher O12650 DHPE
Potassium chloride Sigma 7447407 KCl
Sucrose Sigma 57-50-1 sucrose
β-Casein from bovine milk Sigma C6905-250MG

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References

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Bioengineering numéro 186
<em>In vitro</em> Reconstitution du cytosquelette d’actine à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes
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Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. … More

Chen, S., Sun, Z. G., Murrell, M. P. In Vitro Reconstitution of the Actin Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (186), e64026, doi:10.3791/64026 (2022).

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