Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Un protocolo para evaluar y cuantificar patologías del epitelio pigmentado retiniano en modelos murinos de degeneración macular relacionada con la edad

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64927
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

Summary

Los modelos de ratón pueden ser herramientas útiles para investigar la biología del epitelio pigmentado de la retina (EPR). Se ha establecido que los ratones pueden desarrollar una serie de patologías del EPR. Aquí, describimos un protocolo de fenotipado para dilucidar y cuantificar patologías de EPR en ratones utilizando luz, electrones de transmisión y microscopía confocal.

Abstract

La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) es un trastorno retiniano debilitante en las poblaciones que envejecen. Se cree ampliamente que la disfunción del epitelio pigmentado de la retina (EPR) es un evento patobiológico clave en la DMAE. Para comprender los mecanismos que conducen a la disfunción del EPR, los investigadores pueden utilizar modelos de ratón. Se ha establecido por estudios previos que los ratones pueden desarrollar patologías del EPR, algunas de las cuales se observan en los ojos de individuos diagnosticados con DMAE. Aquí, describimos un protocolo de fenotipado para evaluar patologías de EPR en ratones. Este protocolo incluye la preparación y evaluación de cortes transversales retinianos mediante microscopía óptica y microscopía electrónica de transmisión, así como la de montajes planos RPE por microscopía confocal. Detallamos los tipos comunes de patologías murinas del EPR observadas por estas técnicas y las formas de cuantificarlas a través de métodos imparciales para las pruebas estadísticas. Como prueba de concepto, utilizamos este protocolo de fenotipado de EPR para cuantificar las patologías del EPR observadas en ratones que sobreexpresan la proteína transmembrana 135 (Tmem135) y ratones envejecidos C57BL / 6J de tipo salvaje. El objetivo principal de este protocolo es presentar métodos estándar de fenotipado de EPR con evaluaciones cuantitativas imparciales para científicos que utilizan modelos de ratón de DMAE.

Introduction

La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es una enfermedad ceguera común que afecta a poblaciones mayores de 55 años1. Muchos investigadores creen que la disfunción dentro del epitelio pigmentado de la retina (EPR) es un evento patobiológico temprano y crucial en la DMAE2. El EPR es una monocapa de células polarizadas encargadas de mantener la homeostasis de los fotorreceptores vecinos y los vasos sanguíneos coroideos3. Existe una variedad de modelos para investigar los mecanismos asociados a la enfermedad dentro del EPR, incluidos los modelos de cultivo celular 4,5 y los ratones 6,7,8. Un informe reciente ha descrito protocolos estandarizados y criterios de control de calidad para modelos de cultivo celular de EPR4, sin embargo, ningún informe ha intentado estandarizar el fenotipado del EPR en modelos de ratón. De hecho, muchas publicaciones sobre modelos de ratón de DMAE carecen de una descripción completa del EPR o cuantificación de las patologías del EPR en ellos. El objetivo general de este protocolo es presentar métodos estándar de fenotipado de EPR con evaluaciones cuantitativas imparciales para científicos que utilizan modelos de ratón DMAE.

Publicaciones anteriores han observado la presencia de varias patologías del EPR en ratones a través de tres técnicas de imagen. Por ejemplo, la microscopía óptica permite a los investigadores ver la morfología macroscópica de la retina murina (Figura 1A) y detectar patologías del EPR como el adelgazamiento, la vacuolización y la migración del EPR. El adelgazamiento del EPR en un modelo de ratón AMD se ejemplifica mediante una desviación en la altura del EPR de sus respectivos controles (Figura 1B). La vacuolización del EPR se puede dividir en dos categorías separadas: microvacuolización (Figura 1C) y macrovacuolización (Figura 1D). La microvacuolización del EPR se resume en la presencia de vacuolas en el EPR que no afectan su altura total, mientras que la macrovacuolización está indicada por la presencia de vacuolas que sobresalen en los segmentos externos de los fotorreceptores. La migración del EPR se distingue por el agregado focal de pigmento por encima de la monocapa del EPR en una sección transversal retiniana (Figura 1E). Cabe señalar que las células migratorias del EPR en los ojos de los donantes de DMAE exhiben inmunorreactividad a los marcadores de células inmunitarias, como el grupo de diferenciación 68 (CD68)9, y podrían representar células inmunitarias que envuelven restos de EPR o EPR en transdiferenciación9. Otra técnica de imagen llamada microscopía electrónica de transmisión puede permitir a los investigadores visualizar la ultraestructura del EPR y su membrana basal (Figura 2A). Esta técnica puede identificar el depósito sub-EPR predominante en ratones, conocido como depósito laminar basal (BLamD) (Figura 2B)10. Por último, la microscopía confocal puede revelar la estructura de las células del EPR a través de montajes planos de imágenes del EPR (Figura 3A). Este método puede descubrir la dismorfia del EPR, la desviación del EPR de su forma clásica de panal (Figura 3B). También puede detectar la multinucleación del EPR, la presencia de tres o más núcleos dentro de una célula del EPR (Figura 3C). Para un resumen de los tipos de patologías del EPR presentes en los modelos actuales de ratón DMAE, remitimos a los investigadores a estas revisiones de la literatura 6,7.

Los investigadores que estudian la DMAE deben ser conscientes de las ventajas y desventajas de usar ratones para investigar patologías RPE antes del protocolo de fenotipado. Los ratones son ventajosos debido a su vida relativamente corta y rentabilidad, así como a su manipulabilidad genética y farmacológica. Los ratones también exhiben cambios degenerativos del EPR, incluyendo migración del EPR, dismorfia y multinucleación, que se observan en los ojos de los donantes de DMAE 11,12,13,14,15,16,17; esto sugiere que mecanismos similares pueden subyacer al desarrollo de estas patologías del EPR en ratones y humanos. Sin embargo, existen diferencias clave que limitan la traducibilidad de los estudios con ratones a la DMAE humana. Primero, los ratones no tienen una mácula, una región anatómicamente distinta de la retina humana necesaria para la agudeza visual que se ve afectada preferentemente en la DMAE. En segundo lugar, algunas patologías del EPR en ratones, como el adelgazamiento del EPR y la vacuolización, no se observan típicamente en los ojos de los donantes de DMAE18. En tercer lugar, los ratones no desarrollan drusas, un sello distintivo de la patología de la DMAE19. Las drusas son depósitos que contienen lípidos y proteínas con muy pocas proteínas de la membrana basal que se forman entre la lámina basal del EPR y la capa colágena interna de la membrana de Bruch (BrM)19. Las drusas difieren de BLamD, el depósito común de sub-RPE en ratones, tanto en su composición como en su ubicación anatómica. Los BLamD son anomalías enriquecidas con matriz extracelular dependientes de la edad y el estrés que se forman entre la lámina basal del EPR de BrM y los pliegues basales del EPR20. Curiosamente, los BLamD tienen una composición y apariencia de proteínas similares tanto en ratones como en humanos 6,10,21. Trabajos recientes sugieren que los BLamD pueden actuar en la patobiología de la DMAE al influir en la progresión de la DMAE a sus etapas posteriores18,22; por lo tanto, estos depósitos pueden representar EPR enfermo en la retina del ratón. El conocimiento de estos beneficios y limitaciones es fundamental para los investigadores interesados en traducir los resultados de los estudios con ratones a la DMAE.

En este protocolo, discutimos los métodos para preparar los ojos para la luz, el electrón de transmisión y la microscopía confocal para visualizar patologías de EPR. También describimos cómo cuantificar las patologías del EPR de manera imparcial para las pruebas estadísticas. Como prueba de concepto, utilizamos el protocolo de fenotipado de EPR para investigar las patologías estructurales del EPR observadas en ratones que sobreexpresan la proteína transmembrana 135- (Tmem135) y ratones envejecidos tipo salvaje (WT) C57BL / 6J. En resumen, nuestro objetivo es describir la metodología de fenotipado para caracterizar el EPR en modelos de ratón DMAE, ya que actualmente no hay protocolos estándar disponibles. Los investigadores interesados en examinar y cuantificar patologías de los fotorreceptores o coroides, que también se ven afectados en modelos de ratón DMAE, pueden no encontrar este protocolo útil para sus estudios.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Wisconsin-Madison, y cumplen con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión.

1. Evaluación del EPR del ratón mediante microscopía óptica

  1. Haga un tampón fijador que tenga una concentración final de 2% de paraformaldehído y 2% de glutaraldehído a temperatura ambiente (RT) en una botella de vidrio.
    NOTA: Este protocolo requiere, como máximo, 14 ml de tampón fijador por ratón.
    PRECAUCIÓN: El paraformaldehído y el glutaraldehído son sustancias peligrosas. Siga los procedimientos operativos estándar cuando trabaje con estas sustancias.
  2. Preparar un sistema de perfusión de alimentación por gravedad en una almohadilla absorbente para la perfusión cardíaca en una campana extractora (Figura suplementaria 1A).
    1. Introducir 40 ml del tampón fijador en el cilindro de la jeringa del sistema de perfusión (figura complementaria 1B).
    2. Gire la válvula hasta que esté paralela a la línea de tubería para permitir que el amortiguador fluya a través de la línea de tubería (Figura suplementaria 1C). Enjuague la línea con un tampón hasta que se eliminen todas las burbujas de aire de la línea.
    3. Gire la válvula hasta que esté perpendicular a la tubería para evitar que el amortiguador fluya hacia la tubería (Figura suplementaria 1D).
      NOTA: El sistema de perfusión ya está listo para su uso.
  3. Eutanasia del ratón colocándolo en una cámara de dióxido de carbono (CO 2) y permita que el CO2 fluya hacia la cámara a una tasa de flujo del 30% del volumen de la cámara por minuto. Una vez que el ratón deje de respirar, permita que elCO2 fluya hacia la cámara durante al menos 1 minuto. Verifique que el mouse esté muerto antes de continuar con el siguiente paso.
    NOTA: La eutanasia mediante inyección de agentes farmacológicos se puede utilizar en este protocolo como una alternativa a la inhalación deCO2 .
  4. Realizar perfusión cardíaca en el ratón sacrificado.
    1. Transfiera el ratón a una bandeja poco profunda cerca del sistema de perfusión con el abdomen hacia arriba. Rocíe el abdomen con etanol al 70% (EtOH).
    2. Haga cuatro incisiones para exponer la cavidad abdominal (Figura complementaria 2A).
      1. Cree un corte inferior de 5 cm usando tijeras curvas y fórceps a través de la piel y la pared abdominal en el lado izquierdo más alejado del ratón que está directamente debajo de la caja torácica.
      2. Se procede a realizar un corte medial de 3 cm a través de la piel y la pared abdominal del ratón que comienza en la parte superior del corte inferior.
      3. Haga otro corte inferior de 5 cm al final del corte medial a través de la piel y la pared abdominal en el lado derecho más lejano del ratón directamente debajo de la caja torácica.
      4. Haga otra incisión medial de 3 cm para retirar el colgajo de piel abdominal con fórceps curvos.
    3. Corte a través del diafragma y el esternón para exponer el corazón (Figura suplementaria 2B).
      NOTA: Tenga cuidado de evitar cortar el corazón, las arterias y las venas. Cortarlos conducirá a una perfusión cardíaca ineficiente.
    4. Inserte la aguja de calibre en el ventrículo izquierdo del corazón. Gire la válvula hasta que esté paralela a la línea de tubería. Corte la aurícula derecha con tijeras curvas para permitir que la sangre y el fijador salgan del corazón (Figura complementaria 2C).
    5. Permita que 10 ml de tampón fijador penetren en el ratón durante al menos 1-2 minutos, o hasta que el hígado se vuelva de color pálido y no salga sangre de la aurícula derecha. Una vez que se complete la perfusión, gire la válvula hasta que esté perpendicular a la línea de tubería para detener el flujo del amortiguador.
  5. Enuclear los ojos del ratón después de la perfusión cardíaca.
    1. Retire el ratón de la bandeja poco profunda y colóquelo sobre la almohadilla inferior absorbente en una campana extractora. Oriente la cabeza del ratón de tal manera que el ojo izquierdo esté orientado hacia el experimentador y el ojo derecho esté fuera de la vista. Anote el lado superior del ojo con un tinte de marcado de tejido.
    2. Empuje suavemente hacia abajo con el pulgar y el índice alrededor de la cuenca del ojo para causar la protrusión del ojo de la cuenca del ojo (Figura complementaria 3A).
    3. Tome tijeras curvas y sosténgalas con la hoja en un ángulo de 30 ° desde la cuenca del ojo. Proceda a cortar alrededor del ojo con las tijeras curvas en un ángulo de 30° (Figura suplementaria 3B).
      NOTA: Está bien cortar el exceso de tejido de la cuenca del ojo para preservar la integridad del globo ocular.
    4. Retire el globo ocular de la cabeza con pinzas curvas y colóquelo en una almohadilla absorbente. Corte la córnea con una hoja de bisturí número 11 y coloque el ojo con fórceps curvos en un microtubo de 2 ml con 2 ml de tampón fijador. Etiquete el microtubo de 2 ml con la identificación del ratón y "izquierda" para indicar el ojo izquierdo.
      NOTA: La muesca en la córnea permite que el fijador penetre fácilmente en el ojo para preservarlo mejor.
    5. Repita los pasos 1.5.1-1.5.4 para el ojo derecho.
  6. Deje que los ojos se incuben en un tampón fijador durante la noche en una coctelera en una habitación de 4 ° Celsius (C), a una velocidad de 75 rotaciones por minuto (rpm).
  7. Reemplace el tampón fijador con 2 ml de solución salina tampón fosfato 1x (PBS). Incubar los ojos en 1x PBS durante 10 min en un agitador a RT y 75 rpm. Repita este paso dos veces.
  8. Limpiar y diseccionar los ojos para generar segmentos posteriores.
    NOTA: El segmento posterior es el globo ocular del ratón con la retina neural, el EPR, la coroides y la esclerótica sin la córnea, el iris y el cristalino.
    1. Coloque el ojo en una placa de Petri llena de 1x PBS bajo un microscopio de disección (Figura suplementaria 4A).
    2. Levante suavemente cualquier grasa y músculo lejos del globo ocular con pinzas de punta fina. Recorte cuidadosamente la grasa y el músculo con tijeras de microdisección en dirección paralela al globo ocular hasta que el globo ocular tenga un color negro azulado uniforme (Figura suplementaria 4B).
      NOTA: No corte en dirección perpendicular, ya que esto daña el globo ocular. Además, si el tinte de marcado de tejido se desprende durante el procesamiento, vuelva a anotar el lado superior del globo ocular inmediatamente.
    3. Coloque fórceps de punta fina en el sitio de punción corneal. Cortar alrededor del perímetro de la córnea, comenzando en el sitio de punción, con tijeras de microdisección, para extraer la córnea y el iris del globo ocular (Figura complementaria 4C).
    4. Tome fórceps de punta fina y retire suavemente la lente del globo ocular para obtener el segmento posterior (Figura suplementaria 4D).
    5. Coloque el segmento posterior de nuevo en un microtubo de 2 ml con 2 ml de 1x PBS. Conservar el segmento posterior en nevera a 4 °C.
      NOTA: Los segmentos posteriores pueden permanecer en 1x PBS a 4 °C durante muchas semanas antes de su posterior procesamiento.
  9. Repita los pasos 1.3-1.8 para preparar los ojos de otros ratones en el estudio.
  10. Procese e incruste uno de los segmentos posteriores de cada ratón en parafina para la sección. Asegúrese de que el lado superior del segmento posterior esté en la parte superior.
    NOTA: Los autores confían en el laboratorio de Iniciativas de Investigación Traslacional en Patología (TRIP) de la Universidad de Wisconsin-Madison (UW) para realizar estas tareas. Aquí hay protocolos publicados que utilizan un método similar de procesamiento e incrustación de parafina23,24.
  11. Recorte y seccione cada bloque de parafina para obtener una sección retiniana de 5 μm de espesor que incluya la cabeza del nervio óptico, así como cuatro secciones retinianas adicionales de 5 μm de espesor que estén separadas entre sí. Etiquete las diapositivas con la identificación del mouse y el número de sección de serie (es decir, 1, 2, 3, 4 o 5). Guarde las diapositivas en un cuadro de diapositivas.
    NOTA: Los autores confían en el laboratorio UW TRIP para sus servicios en la sección de parafina. Aquí hay protocolos publicados que utilizan un método similar de seccionamiento de parafina25,26.
  12. Manchar los portaobjetos que contienen secciones retinianas con hematoxilina y eosina (H&E). Un protocolo de tinción H&E se puede encontrar en la Figura Suplementaria 5.
    NOTA: Todos los pasos del procedimiento de tinción H&E deben completarse en una campana extractora.
  13. Recopile imágenes cosidas de secciones retinianas teñidas con H&E con una barra de escala utilizando un microscopio de luz con un aumento de 20x.
  14. Cuantificar el grosor del EPR en las imágenes retinianas que contienen la cabeza del nervio óptico para cada muestra.
    1. Descargue y abra el programa Fiji ImageJ. Arrastre todas las imágenes retinianas cosidas que contienen la cabeza del nervio óptico a la barra de tareas Fiji ImageJ. Verifique que la escala de imagen esté calibrada en μm y no en píxeles.
      NOTA: La escala de la imagen se encuentra en la esquina superior izquierda de la ventana que contiene una imagen de retina en el programa Fiji ImageJ. Si la escala se establece en píxeles, consulte el manual de instrucciones del programa Fiji ImageJ para convertir píxeles a μm.
    2. Marque cada intervalo de 300 μm en cada imagen desde el borde de la cabeza del nervio óptico hasta el final de la retina (ora serrata). Haga clic en el icono Recto en la barra de tareas de Fiji ImageJ. Haga clic y arrastre una línea desde el borde de la cabeza del nervio óptico hacia la ora serrata que tiene 300 μm de longitud. Haga clic en la herramienta Pincel en la barra de tareas Fiji ImageJ y haga clic en el final de la línea de 300 μm para marcarla.
    3. Mida el espesor del EPR en cada intervalo marcado. Haga clic en el icono Recto en la barra de tareas de Fiji ImageJ. Haga clic y arrastre una línea desde la parte superior hasta la inferior del RPE (Figura complementaria 6). Haga clic en Analizar > medida en la barra de menú Fiji ImageJ para obtener el grosor del EPR.
    4. Transfiera las mediciones de espesor del EPR a una hoja de cálculo y etiquete la columna que contiene las mediciones con la identificación del ratón. Etiquete una columna adicional con 'Intervalo marcado' e ingrese la distancia lejos de los valores del nervio óptico (es decir, 300, 600, 900, etc.)
      NOTA: El primer intervalo medido corresponde a 300 μm de distancia del nervio óptico, el segundo intervalo medido corresponde a 600 μm de distancia, y así sucesivamente.
  15. Cuantificar las tasas de incidencia de patología del EPR en función de las imágenes retinianas de cada muestra.
    1. Abra el programa Fiji ImageJ.
    2. Abra la aplicación Cell Counter dentro del programa Fiji ImageJ. Haga clic en Plugins > Analyze > Cell Counter en la barra de menú Fiji ImageJ. Arrastre una imagen retiniana a la barra de tareas Fiji ImageJ y haga clic en Inicializar en la ventana Contador de celdas .
    3. Cuente el número de patologías de EPR por sección retiniana utilizando la aplicación Cell Counter . Haga clic en Tipo 1 en Contadores y luego haga clic en todos los eventos de microvacuolización en la imagen. Haga clic en Tipo 2 en Contadores y luego haga clic en todos los eventos de macrovacuolización en la imagen. Haga clic en Tipo 3 en Contadores y, a continuación, haga clic en todos los eventos de migración individuales de la imagen.
    4. Transfiera los números de las patologías del EPR a una hoja de cálculo. Etiquete las filas con microvacuolización, macrovacuolización o migración, y la columna con identificación del ratón.
    5. Repita los pasos 1.15.2-1.15.4 para otras imágenes del ejemplo. Promedie el número de patologías de EPR por muestra y divida por cinco para calcular la tasa de incidencia de cada patología de EPR para la muestra en la hoja de cálculo.
  16. Realizar análisis estadísticos sobre los espesores del EPR en cada intervalo y las tasas de incidencia de patología del EPR para determinar si existen diferencias significativas entre los grupos del estudio.

2. Evaluación del EPR del ratón mediante microscopía electrónica de transmisión

  1. Corte los otros segmentos posteriores cedidos después de los pasos 1.5-1.9 por la mitad a través de la marca superior en dos secciones con una cuchilla de afeitar. Anote el lado superior de los segmentos posteriores seccionados con un tinte de marcado de tejido. Separe los segmentos posteriores seccionados en nuevos microtubos de 2 ml que contengan 2 ml de 1x PBS e identificación del ratón.
    NOTA: El segmento posterior del ratón es demasiado grande para procesarlo en una sola pieza y debe cortarse por la mitad para el procesamiento de microscopía electrónica de transmisión.
  2. Enjuagar los tejidos con 2 mL de tampón de cacodilato 0,1 M, pH 7,2. Incubar durante 10 minutos en RT en la mesa de trabajo. Repita este paso dos veces más.
  3. Reemplace el tampón de cacodilato 0.1 M con 2 ml de tetróxido de osmio al 2% (OsO4) diluido en tampón de cacodilato 0.1 M. Incubar durante 1,5 h a RT en la campana extractora.
    PRECAUCIÓN: OsO4 es una sustancia venenosa. Siga los procedimientos operativos estándar cuando trabaje con OsO4.
  4. Enjuague los tejidos con 2 ml de tampón de cacodilato 0,1 M durante 10 min a RT en la campana extractora. Repita este paso una vez.
  5. Deshidratar los tejidos con diluciones graduadas de EtOH que van del 50% al 100% a RT en la campana extractora. Un protocolo para el procedimiento de deshidratación se puede encontrar en la Figura Suplementaria 7.
  6. Retire el 100% de EtOH de los tejidos y agregue 2 ml de óxido de propileno a los tejidos. Incubar a RT en la campana extractora durante 15 min. Retire el óxido de propileno de los tejidos y agregue 2 ml de óxido de propileno fresco a los tejidos. Incubar a RT en la campana extractora durante 15 min.
    PRECAUCIÓN: El óxido de propileno es una sustancia tóxica. Siga los procedimientos operativos estándar cuando trabaje con óxido de propileno.
  7. Retire el óxido de propileno de los tejidos y agregue 2 ml de una mezcla 1: 1 de óxido de propileno y resina a los tejidos. Dejar pasar la noche al vacío en la campana extractora de RT.
    PRECAUCIÓN: La resina es una sustancia peligrosa para los seres humanos. Siga los procedimientos operativos estándar del laboratorio cuando trabaje con resina.
  8. Reemplace la mezcla 1:1 de óxido de propileno y resina de los tejidos con 2 ml de resina pura. Dejar toda la noche bajo una aspiradora en la campana extractora en RT .
  9. Incrustar los tejidos en resina. Coloque una etiqueta con la identificación del ratón a lápiz y una gota de resina en el molde. Coloque el tejido sobre la gota de resina. Llenar el molde con resina y colocar al vacío durante 1 h a RT en la campana extractora.
  10. Vuelva a colocar las etiquetas y las muestras con pinzas de punta fina, con la parte posterior de la sección del ocular posterior en la parte superior. Dejar el molde toda la noche a 65 °C en un horno en la campana extractora.
  11. Retire los moldes del horno. Deje que los moldes se enfríen a RT en la mesa de trabajo. Retire los bloques de los moldes.
    NOTA: Los bloques ya están listos para recortar.
  12. Da forma a los bloques de resina con una cuchilla de afeitar para formar un trapezoide. Recorte los bloques de resina con un micrótomo hasta que la cabeza del nervio óptico sea visible. Proceda a utilizar un cuchillo de diamante para cortar secciones semifinas de los bloques de resina con un grosor de 0,5 μm.
    NOTA: Aquí hay un protocolo publicado sobre la sección de microtomótomos27. Si se desea, se pueden recolectar y teñir secciones semidelgadas de 0,5 μm de espesor de los bloques de resina para evaluar la integridad de la muestra.
  13. Corte una sección ultrafina de 70 nm de espesor de cada bloque recortado con un ultramicrótomo. Recolecte una sección ultrafina de 70 nm de espesor en una rejilla de cobre de barra delgada de 400 mallas. Coloque la cuadrícula en una caja de almacenamiento de cuadrícula y etiquete la ranura con la identificación del mouse.
    NOTA: Aquí hay un protocolo publicado sobre la sección de ultramicrotomo28.
  14. Manchar las rejillas con acetato de uranilo al 2% durante 5 min y luego con solución de citrato de plomo al 3,5% durante 5 min a RT en la campana extractora.
    PRECAUCIÓN: El acetato de uranilo y el citrato de plomo son sustancias peligrosas. Siga los procedimientos operativos estándar cuando trabaje con estas sustancias.
  15. Obtenga imágenes para cada muestra utilizando un microscopio electrónico de transmisión con un aumento de 15.000x, donde las líneas de cuadrícula de la rejilla de cobre intersecan el RPE y BrM.
    NOTA: Debe haber al menos 20 a 35 imágenes por sección y 40 a 70 imágenes por muestra.
  16. Cuantificar las alturas de BLamD en las imágenes de las muestras del estudio.
    1. Abra el programa Fiji ImageJ. Arrastre todas las imágenes de la sección de ejemplo a la barra de tareas Fiji ImageJ. Verifique que las imágenes estén calibradas en μm y no en píxeles.
    2. Mide la altura de BLamD en las imágenes. Haga clic en el icono Recto de la barra de tareas Fiji ImageJ. Haga clic y arrastre una línea desde la lámina elástica de BrM hasta la parte superior del depósito más alto de la imagen (Figura suplementaria 8). Haga clic en Analizar > medida en la barra de menús Fiji ImageJ para obtener la altura de BLamD en la imagen.
      NOTA: Si no hay BLamD en la imagen, dibuje una línea desde la lámina elástica de BrM hasta la lámina basal del EPR.
    3. Transfiera las alturas de BLamD a una hoja de cálculo y una etiqueta con identificación del ratón.
  17. Calcule las frecuencias acumuladas de alturas de BLamD por genotipo y los promedios de alturas de BLamD por ratón en la hoja de cálculo. Realizar análisis estadísticos sobre los promedios de las alturas de BLamD para determinar si existen diferencias significativas entre los grupos en el estudio.

3. Evaluación del EPR del ratón mediante microscopía confocal

  1. Recoge los ojos de los ratones. Eutanasia a los ratones de acuerdo con el procedimiento descrito en el paso 1.3. Nuclear los ojos usando el paso 1.5. Coloque los ojos usando fórceps curvos en un microtubo de 2 ml con 2 ml de PBS 1x e identificación del ratón.
    NOTA: No adapte la oscuridad de los ratones, ya que la interdigitalización de los fotorreceptores y los procesos apicales del EPR permite una mejor visualización del EPR a través de microscopía confocal.
  2. Limpie y disecte los ojos del ratón inmediatamente para generar oculares posteriores del ratón.
    NOTA: El ocular posterior es diferente del segmento posterior porque no contiene la retina neural.
    1. Transfiera el ojo a una placa de Petri que contenga 1x PBS bajo un microscopio de disección (Figura suplementaria 9A).
    2. Eliminar la grasa y el músculo del globo ocular, como se describe en el paso 1.8.2 (Figura complementaria 9B).
    3. Corta la córnea del globo ocular con una hoja de bisturí número 11. Extraer la córnea y el iris, como se detalla en el paso 1.8.3 (Figura complementaria 9C).
    4. Saque la lente con pinzas de punta fina. Tome dos pinzas de punta fina y separe suavemente la retina neural del segmento posterior.
    5. Corte cuidadosamente la retina neural en la cabeza del nervio óptico para extraerla del ocular posterior (Figura suplementaria 9D).
    6. Coloque el ocular posterior en un nuevo microtubo de 2 ml que contenga 500 μL de 1x PBS con identificación de ratón.
  3. Fijar los oculares posteriores con metanol (MeOH) (Figura complementaria 10).
    NOTA: El paso 3.3 tarda aproximadamente 2 h y 40 minutos en completarse.
    1. Añadir 500 μL de MeOH a los tejidos. Incubar en una agitadora a 75 rpm durante 5 min a RT.
    2. Retire los 500 μL de solución de los tejidos y agregue 500 μL de MeOH. Incubar durante 5 min en una coctelera a 75 rpm durante 5 min en RT. Repita este paso una vez más.
    3. Retire toda la solución de los tejidos y agregue 500 μL de MeOH. Incubar en una agitadora a 75 rpm durante al menos 2 h a RT.
      NOTA: Como alternativa al paso 3.3.3, el ocular posterior puede incubarse durante la noche en MeOH en un agitador a 75 rpm en una habitación a 4 °C.
    4. Agregue 500 μL de 1x PBS a los tejidos. Incubar en una agitadora a 75 rpm durante 5 min a RT.
    5. Retire los 500 μL de solución de los tejidos y agregue 500 μL de 1x PBS. Incubar en una coctelera a 75 rpm durante 5 min a RT. Repita este paso una vez más.
    6. Retire toda la solución de los tejidos y reemplácela con 500 μL de 1x PBS.
      NOTA: Los tejidos están completamente fijados por el MeOH y se pueden mantener en un refrigerador a 4 °C durante al menos 1 mes.
  4. Realizar tinción por inmunofluorescencia de los oculares posteriores para visualizar uniones estrechas y núcleos del EPR (Figura complementaria 11).
    1. Retire los 500 μL de 1x PBS de las muestras y agregue 100 μL de suero de burro normal diluido al 10% en 1x solución de PBS. Incubar en un agitador a 75 rpm durante 30 min a RT.
    2. Retirar de las muestras la solución diluida de suero de burro normal al 10% y añadir 100 μL de una dilución 1:50 de un anticuerpo policlonal anti-Zonula Occludens-1 (ZO-1) de conejo en 1x PBS. Transfiera las muestras a una habitación a 4 °C e incube durante la noche en un agitador a 75 rpm.
    3. Retire la dilución de anticuerpos de las muestras y agregue 2 ml de 1x PBS. Incubar en una coctelera a 75 rpm durante 10 min a RT. Repita este paso dos veces más.
    4. Elimine el PBS 1x de las muestras. Agregue 100 μL de una dilución 1:250 de un anticuerpo IgG anti-conejo burro con una etiqueta conjugada con fluoróforos 488 y una dilución 1:250 de diclorhidrato de 4',6-Diamidina-2'-fenilindol (DAPI) en 1x PBS a las muestras. Cubrir las muestras con papel de aluminio e incubar en un agitador a 75 rpm durante 2 h a RT.
      NOTA: Las muestras deben estar completamente cubiertas con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo.
    5. Retire las diluciones de anticuerpos y DAPI de las muestras. Agregue 2 ml de 1x PBS a las muestras, vuelva a cubrir con papel de aluminio e incube en un agitador a 75 rpm durante 10 minutos a RT. Repita este paso tres veces más.
      NOTA: Las uniones estrechas y los núcleos del EPR ahora están completamente etiquetados y teñidos, respectivamente.
  5. Monte los oculares posteriores en portaobjetos de microscopio.
    1. Etiquete un portaobjetos de microscopio con identificación del ratón. Transfiera el ocular posterior a un portaobjetos de microscopio bajo un microscopio de disección con el lado coroideo hacia abajo. Agregue una gota de 1x PBS al ocular posterior para evitar que se seque (Figura complementaria 12).
    2. Corte el ocular posterior con una hoja de bisturí número 11 en cuatro puntos que producirán cuatro cuadrantes correspondientes a las direcciones cardinales (es decir, norte, este, sur y oeste). Frote el exceso 1x PBS con tejido del perímetro del ocular posterior. Aplanar suavemente el ocular posterior con un cepillo para el pelo de camello y pinzas de punta fina (Figura suplementaria 12).
      NOTA: El producto resultante ahora se conoce como montaje plano RPE.
    3. Agregue una gota de medio de montaje al soporte plano RPE y coloque un cubreobjetos encima. Aplique esmalte de uñas transparente para sellar el cubreobjetos y deje que se seque durante al menos 30 minutos en RT en un cajón cerrado. Coloque las guías en una caja portacorrederas y guárdela en un refrigerador a 4 °C.
      NOTA: Tenga cuidado de evitar la introducción de burbujas en el soporte plano RPE. Los soportes planos RPE se pueden visualizar dentro de un marco de tiempo de 2 semanas.
  6. Obtenga una imagen de cada uno de los cuatro cuadrantes que rodean el nervio óptico del montaje plano del EPR en un microscopio confocal con un aumento de 20x para cada muestra. Un ejemplo de una imagen de montaje plano RPE se puede encontrar en la Figura suplementaria 13A.
    NOTA: Puede ser necesario realizar imágenes de pila z de los soportes planos de RPE donde se toman y apilan varias imágenes para compensar las diferencias dimensionales del montaje plano de RPE.
  7. Trace las uniones estrechas de las celdas RPE dentro de cada imagen de montaje plano de RPE. Un ejemplo de una imagen de montaje plano RPE trazada se puede encontrar en la Figura Suplementaria 13B.
    1. Abra el programa Fiji ImageJ. Arrastre una imagen de montaje plano RPE a la barra de tareas Fiji ImageJ. Verifique que la imagen esté calibrada en micrómetros y no en píxeles.
    2. Haga doble clic en el icono Superposición de la herramienta Pincel en la barra de tareas Fiji ImageJ para establecer el ancho del pincel en 3, la transparencia en 0 y el color en rojo. Haga clic en el botón Cerrar de la ventana Herramienta Pincel superpuesto .
    3. Haga clic en el icono Overlay Brush Tool . Haga clic y arrastre en las uniones estrechas de todas las celdas RPE que están completamente dentro de la imagen.
      NOTA: En caso de que se cometa un error de rastreo, haga doble clic en el icono de la herramienta Pincel superpuesto y haga clic en el cuadro Deshacer en la ventana Herramienta Pincel superpuesto para eliminar el error de trazado de la imagen.
    4. Haga clic en el icono Rectángulo de la barra de tareas Fiji ImageJ. Haga clic en la imagen y arrastre alrededor del perímetro de la imagen. Haga clic en Editar > Borrar en la barra de menús Fiji ImageJ para mantener las líneas trazadas y eliminar los colores azul y verde de la imagen.
    5. Guarde la imagen de seguimiento en una ubicación adecuada con identificación del mouse, ubicación del cuadrante (es decir, norte, sur, este u oeste) y una etiqueta de sufijo CP.
      NOTA: No guarde la imagen de seguimiento de RPE antes de completar el paso 3.7.4.
  8. Calcule las áreas de celda RPE para cada muestra.
    1. Designe una ubicación para guardar los archivos del análisis de área RPE creando una carpeta en la pantalla del escritorio del equipo. Genere subcarpetas para cada imagen de seguimiento de RPE y etiquete las subcarpetas con la identificación del mouse, así como la ubicación del cuadrante (es decir, norte, sur, este u oeste).
    2. Instale y abra el programa Cell Profiler29. Descargue el archivo de proyecto Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Archivo de codificación suplementario 1). Abra el archivo Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj haciendo clic en Archivo > Abrir proyecto en la barra de menús del programa Cell Profiler.
    3. Arrastre una imagen de seguimiento RPE al cuadro Imagen > Colocar archivos y carpetas aquí en la ventana del programa Cell Profiler.
    4. Introduzca la ubicación de la carpeta en el programa Cell Profiler que corresponde a la imagen de seguimiento RPE. Haga clic en el botón Configuración de salida en la esquina inferior izquierda de la ventana del programa Cell Profiler e ingrese la ubicación de la carpeta en los cuadros de texto Carpeta de entrada predeterminada y Carpeta de salida predeterminada .
    5. Haga clic en el botón Analizar imágenes en la esquina inferior izquierda de la ventana del programa Cell Profiler. Una vez completado el análisis, aparecerá una ventana Análisis completo en la pantalla. Haga clic en el botón Aceptar en la ventana Análisis completo .
      NOTA: Esta acción generará un archivo csv y una imagen jpeg. El archivo csv contendrá las áreas para las celdas RPE dentro de la imagen de seguimiento. La imagen jpeg corresponderá a la imagen de traza RPE, donde cada celda RPE se etiquetará con un número (Figura suplementaria 13C).
    6. Transfiera las áreas RPE del archivo csv a una hoja de cálculo. Etiqueta la hoja de cálculo con la identificación del ratón.
    7. Realice una encuesta de control de calidad de los datos confirmando que cada área de RPE en el archivo csv se vincula a una celda RPE completamente trazada en una imagen jpeg. Quite los valores de la hoja de cálculo que no correspondan a las celdas RPE con seguimiento completo.
    8. Vuelva al programa Cell Profiler. Haga clic con el botón secundario en el nombre de la imagen de seguimiento RPE en el cuadro Colocar archivos y carpetas aquí y seleccione Borrar la lista para quitar la imagen del programa Cell Profiler.
    9. Repita los pasos 3.8.3-3.8.8 para calcular los tamaños de EPR para las tres imágenes de trazas de EPR restantes de la muestra.
  9. Cuantifique los promedios de tamaño de celda RPE para cada muestra en la hoja de cálculo.
  10. Cuantifique las densidades de celda RPE para cada muestra en la hoja de cálculo. Para calcular la densidad de células del EPR, divida el número total de células del EPR por cuadrante por el área total de células del EPR por cuadrante detectadas por el programa del Generador de perfiles de células. Determine el promedio de las densidades de células RPE de los cuatro cuadrantes por muestra.
  11. Cuantificar el número de células RPE multinucleadas por montaje plano de RPE para cada muestra. Utilice la aplicación Cell Counter dentro del programa Fiji ImageJ, como se describe en los pasos 1.15.1-1.15.3, para contar el número de células RPE con más de tres núcleos en cuatro cuadrantes de la muestra.
  12. Realizar análisis estadísticos sobre el tamaño de las células del EPR y los promedios de densidad, así como el número de células del EPR multinucleadas para determinar si existen diferencias significativas entre los grupos del estudio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La finalización del protocolo de fenotipado del EPR descrito en este artículo proporciona un análisis cuantitativo de las anomalías estructurales del EPR comúnmente observadas en modelos de ratón de DMAE. Para confirmar la efectividad de este protocolo, lo utilizamos en ratones que se sabe que presentan patologías del EPR, incluidos los ratones transgénicos que sobreexpresan WT Tmem135 impulsado por el promotor de beta-actina de pollo (Tmem135 TG)30 y ratones C57BL / 6J envejecidos 31,32. El objetivo de estos experimentos es mostrar resultados representativos que podrían obtenerse utilizando los métodos descritos en este protocolo a investigadores nuevos en modelos de ratón.

Nos adherimos a los métodos del Paso 1 del protocolo para procesar y evaluar ojos de ratones WT y Tmem135 TG para evaluar patologías de EPR utilizando microscopía óptica. Encontramos que los ratones Tmem135 TG de 4 meses de edad tienen una reducción significativa en el grosor del EPR en dos intervalos medidos en relación con el WT de la misma edad a través de un ANOVA con prueba de Tukey post-hoc (Figura 4). Estos resultados indican que el EPR es más delgado en los ratones Tmem135 TG de 4 meses de edad que en ratones WT de la misma edad a 600 y 900 μm del nervio óptico.

Además, utilizando los métodos del Paso 1 del protocolo, calculamos la incidencia de patologías del EPR, incluyendo microvacuolización, macrovacuolización y migración de tres ratones WT y Tmem135 TG de 25 días de edad (Figura 5A). La frecuencia media de patologías de microvacuolización del EPR por portaobjetos en ratones WT fue de 0,67 ± 0,31 y en ratones Tmem135 TG fue de 7,07 ± 0,61 (Figura 5B). No hubo macrovacuolización del EPR en ratones WT, pero hubo, en promedio, 5,33 ± 2,02 eventos de macrovacuolización en ratones Tmem135 TG (Figura 5C). Por último, las tasas de células migratorias del EPR por portaobjetos fueron cero en ratones WT y 0,4 ± 0,35 en ratones Tmem135 TG (Figura 5D). Después de realizar la prueba t de un estudiante, la incidencia de microvacuolización y microvacuolización del EPR fue significativamente diferente entre los ratones WT y Tmem135 TG. Sin embargo, la mayor incidencia de células migratorias del EPR en ratones Tmem135 TG no fue significativamente diferente en comparación con WT (p = 0,1161). Estos datos muestran que la microvacuolización y macrovacuolización del EPR, pero no la migración, es significativamente mayor en Tmem135 TG de 25 días de edad que en ratones WT.

Siguiendo los métodos del protocolo incluido en el Paso 2, preparamos secciones de retina de ratones WT C57BL / 6J de 2 meses y 24 meses de edad para microscopía electrónica de transmisión para analizar la presencia y las alturas de BLamDs. Encontramos BLamDs presentes en retinas WT de 24 meses de edad que estaban notablemente ausentes en retinas WT de 2 meses de edad (Figura 6A). Presentamos las alturas de los BLamDs en las retinas WT de 24 meses de edad calculando y trazando las frecuencias acumuladas de su ocurrencia. Las frecuencias acumuladas de las alturas de BLamD se graficaron contra la altura del depósito para ilustrar la distribución de las alturas del depósito. Hay un desplazamiento a la derecha de la línea para las alturas WT BLamD de 24 meses de edad en comparación con las alturas WT BLamD de 2 meses de edad, lo que demuestra un aumento de los depósitos en ratones WT de 24 meses (Figura 6B). Este gráfico está respaldado por un promedio más grande de alturas BLamD en retinas WT de 24 meses de edad (1.01 μm ± 0.43 μm) que retinas WT de 2 meses (0.23 μm ± 0.017 μm), que fueron significativamente diferentes en la prueba t de un estudiante (Figura 6C). En resumen, concluimos que los ratones WT de 24 meses de edad tienen grandes BLamD en el espacio sub-RPE de sus retinas en comparación con los ratones WT de 2 meses de edad.

Aplicamos los métodos de preparación de ojos de ratones WT y Tmem135 TG de 4 meses de edad en el Paso 3 para generar montajes planos de EPR para la detección y análisis de dismorfia y multinucleación de EPR. En este protocolo, definimos la dismorfia RPE por cambios en el tamaño y la densidad de las células RPE en un modelo de ratón AMD en relación con sus controles. Encontramos que el EPR en ratones Tmem135 TG de 4 meses de edad es dismórfico (Figura 7A). El EPR en las retinas Tmem135 TG es más grande (806,89 μm 2 ± 252,67 vs. 291,69 μm 2 ± 26,31) y menos denso (0,0014 células/μm2 ± 0,00039 vs. 0,0033 células/μm2 ± 0,00024) que las retinas WT de la misma edad (Figura 7B,C). Además, había más células RPE multinucleadas en las retinas Tmem135 TG en comparación con los controles WT (8,04 células ± 5,54 vs. 0,33 células ± 0,29) (Figura 7D). Todos estos parámetros alcanzaron significación estadística con la prueba t de un estudiante. Juntos, los ratones Tmem135 TG de 4 meses de edad tienen más células RPE dismórficas y multinucleadas que los ratones WT de 4 meses de edad.

Figure 1
Figura 1: Patologías del EPR detectadas por microscopía óptica. Imágenes representativas de EPR normal en WT(A) y EPR anormal en ratones Tmem135 TG (B-E). Las patologías del EPR observadas en ratones Tmem135 TG incluyen adelgazamiento del EPR (B), macrovacuolización (C), microvacuolización (D) y migración (E). Cada patología está ilustrada por una flecha negra. Barra de escala = 100 μm. Aumento = 20x. Abreviaturas: RGC = capa de células ganglionares de la retina, IPL = capa plexiforme interna, INL = capa nuclear interna, OPL = capa plexiforme externa, ONL = capa nuclear externa, IS = segmentos internos fotorreceptores, OS = segmentos externos fotorreceptores, RPE = epitelio pigmentado de la retina, Cho = coroides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Patologías del EPR detectadas por microscopía electrónica de transmisión. Imágenes representativas de (A) EPR en ratones CFH-H/H jóvenes y (B) ratones CFH-H/H de 2 años de edad que tienen abundantes depósitos laminares basales (BLamDs). Los BLamD se trazan con puntos amarillos en la imagen. Barra de escala = 800 nm. Ampliación = 15.000x. Abreviaturas: N = núcleo, M = mitocondria, P = gránulo de pigmento, BI = pliegues basales, EL = lámina elástica, RPE = epitelio pigmentado de la retina, BrM = membrana de Bruch, Cho = coroides. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Patologías del EPR detectadas por microscopía confocal. Imágenes representativas de (A) EPR normal de WT de 8 meses de edad y (B) EPR anormal de ratones Tmem135 TG de 8 meses de edad que exhiben dismorfia de EPR. El cuadrado blanco se amplía (C) para representar una célula RPE multinucleada con tres núcleos. El color verde es uniones estrechas de EPR asociadas a anti-ZO1, y el color azul es la tinción DAPI de los núcleos de EPR. Barra de escala = 50 μm. Ampliación = 20x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Grosor del EPR en ratones de tipo salvaje (WT) y Tmem135 TG de 4 meses de edad. (A) Imágenes representativas de la retina de ratones WT y Tmem135 TG (TG) de 4 meses de edad. Ampliación = 20x. Barra de escala = 100 μm. (B) Gráficos lineales de las mediciones de espesor del EPR en ratones WT (negro) y Tmem135 TG (verde) de 4 meses de edad hasta 3.000 μm de distancia del nervio óptico. Los números después del genotipo denotan el número de ratones utilizados en este estudio. *p < 0,05, ANOVA con prueba de Tukey post-hoc. Todos los datos son medios ± sd. Consulte la leyenda de la Figura 1 para abreviaturas de las capas retinianas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Patologías del EPR en ratones Tmem135 TG de 25 días de edad. (A) Imágenes representativas de microvacuolización, macrovacuolización y migración de RPE en tres ratones Tmem135 TG (TG) de 25 días de edad. Las patologías del EPR se resaltan con flechas negras en cada imagen. Ampliación = 40x. Barra de escala = 20 μm. (B-D) Cuantificación de micro y macrovacuolización de EPR, así como células migratorias de EPR en ratones WT y Tmem135 TG de 25 días de edad. Los números entre paréntesis denotan el número de ratones utilizados en este estudio. *p < 0,05 y ****p < 0,0001, prueba t de Student. Todos los datos son medios ± sd. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Análisis ultraestructural de BLamDs en retinas WT jóvenes y envejecidas . (A) Micrografías electrónicas representativas de RPE WT de 2 meses y 24 meses de edad. Ampliación = 15.000x. Barra de escala = 800 nm. Un ejemplo de un depósito laminar basal (BLamD) se diagrama con un corchete. (B) Frecuencias acumuladas de las alturas BLamD. (C) Medias de altura BLamD. Los números entre paréntesis denotan el número total de ratones por genotipo utilizado en este estudio. **P < 0,01, prueba t de Student. Todos los datos son medios ± sd. Consulte la leyenda de la Figura 2 para abreviaturas de las capas retinianas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Los soportes planos de EPR revelan patologías de EPR en ratones Tmem135 TG. (A) Imágenes representativas de soportes planos RPE WT y Tmem135 TG (TG) de 4 meses de edad con anti-ZO-1 en verde y DAPI en azul. Ampliación = 20x. Barra de escala = 100 μm. (B) tamaño de la célula EPR, (C) densidad celular del EPR y (D) multinucleación del EPR en ratones WT y Tmem135 TG de 4 meses de edad. El número entre paréntesis denota el número de ratones utilizados en el estudio. *p < 0,05, **p < 0,01 y ****p < 0,0001, prueba t de Student. Todos los datos son medios ± sd. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Esquema de configuración y uso de la perfusión cardíaca. (A) Sistema de perfusión de alimentación por gravedad. (B) Barril de jeringa del sistema de perfusión para tampón fijador. (C) La válvula debe girarse hasta que esté paralela a la línea de tubería para permitir que el amortiguador fluya a través de la línea de tubería. (D) Válvula que se girará hasta que esté perpendicular con la línea de tubería para evitar que el amortiguador fluya hacia la línea de tubería. Imagen creada en Biorender. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Esquema del procedimiento para la perfusión cardíaca de un ratón. (A) Cuatro incisiones hechas para exponer la cavidad abdominal. (B) Corte hecho a través del diafragma y el esternón para exponer el corazón. (C) Aguja de calibre insertada en el ventrículo izquierdo del corazón. La válvula se gira hasta que está paralela a la línea de tubería. La aurícula derecha se corta con tijeras curvas para permitir que la sangre y el fijador salgan. Imagen creada en Biorender. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Esquema del procedimiento para enuclear ojos de un ratón. (A) Empuje suavemente hacia abajo con el pulgar y el índice alrededor de la cuenca del ojo para causar la protrusión del ojo de la cuenca del ojo. (B) Tome las tijeras curvas y sosténgalas con la hoja en un ángulo de 30 ° desde la cuenca del ojo. Proceda a cortar alrededor del ojo con las tijeras curvas en un ángulo de 30 °. Los puntos de colores representan la colocación de los dedos en el ratón o tijeras curvas. Imagen creada en Biorender. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: Imágenes de disección del ojo del ratón para producir el segmento posterior del ratón. (A) Ojo transferido a un microscopio de disección. (B) Grasa y músculo extraídos del globo ocular. (C) Córnea e iris extirpados del globo ocular. (D) Lente extraída del globo ocular. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 5: Procedimiento de tinción con hematoxilina eosina (H&E). Esquema que representa el procedimiento H&E para teñir secciones retinianas incrustadas en parafina. Las flechas indican la transferencia entre pasos. El tiempo de cada paso se da en letra roja. Los reactivos para la tinción se proporcionan en fuente negra dentro de los recipientes de tinción de vidrio. Debe haber un recipiente de tinción de vidrio preparado para cada reactivo que se incluye en el diagrama anterior. Todos los pasos deben completarse en una campana extractora. Al agregar un cubreobjetos a una diapositiva, tenga cuidado de no introducir burbujas en la diapositiva. Después de completar el procedimiento, las diapositivas se pueden almacenar en un cuadro de diapositivas. Imagen creada en Biorender. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 6: Ejemplo de medición del espesor del EPR. La flecha negra representa una línea roja desde la parte superior hasta la parte inferior del RPE. Esta línea se puede medir para determinar el espesor del RPE. Barra de escala = 100 μm. Aumento = 20x. El área en caja se aleja para facilitar la visualización del RPE. Consulte la leyenda de la Figura 1 para abreviaturas de las capas retinianas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 7: Procedimiento de deshidratación de EtOH de segmentos posteriores de ratón para el procesamiento de TEM. Imagen creada en Biorender. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 8: Ejemplo de medición de altura BLamD. La línea roja muestra el BLamD más grande en esta imagen. Los puntos amarillos delinean BLamDs en la imagen. Esta línea roja se puede medir para determinar la altura de este BLamD en esta imagen. Barra de escala = 800 nm. Ampliación = 15.000x. Consulte la leyenda de la Figura 2 para abreviaturas de las capas retinianas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 9: Disección del ojo del ratón para montaje plano RPE. (A) Ojo transferido a una placa de Petri que contiene 1x PBS bajo un microscopio de disección. (B) Grasa y músculo extraídos del globo ocular. (C) Córnea e iris extirpados del globo ocular. (D) Extracción del cristalino y la retina del globo ocular. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 10: Procedimiento de fijación de metanol (MeOH) de oculares posteriores de ratón. Imagen creada en Biorender. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 11: Procedimiento de inmunofluorescencia para marcar uniones estrechas y núcleos de células EPR. Diagrama que representa los pasos de la técnica de inmunofluorescencia de este protocolo. Tenga en cuenta que esta técnica tarda 2 días en completarse. Todos los pasos ocurren en RT y en un agitador con una velocidad de 75 rpm, a menos que se indique específicamente en el diagrama. El anticuerpo primario (1°) utilizado en este estudio fue el anti-ZO1 policlonal de conejo, y el anticuerpo secundario (2º) utilizado en este estudio fue 488 IgG anti-conejo conjugado con fluoróforos. Una vez que el anticuerpo secundario y DAPI se agregan a las muestras, las muestras deben envolverse en papel de aluminio para proteger contra el fotoblanqueo de la muestra. Imagen creada en Biorender. Abreviaturas: NDS = suero de burro normal, Ab = anticuerpo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 12: Representación de cortes para producir cuatro cuadrantes de montaje plano RPE de ratón. N = norte, E = este, S = sur, W = oeste. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 13: Ejemplos de extremos de análisis de montaje plano de RPE. (A) Imagen de montaje plano RPE. (B) Imagen de traza de límite de RPE. (C) Imagen analizada de RPE Cell Profiler. Ampliación = 20x. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 1: Ikeda RPE Area Calculator.cpproj Haga clic aquí para descargar este archivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En este artículo, presentamos un protocolo de fenotipado para evaluar las patologías estructurales del EPR de modelos de ratón. Describimos los pasos necesarios para procesar los ojos para diversas técnicas de imagen, incluida la luz, el electrón de transmisión y la microscopía confocal, así como la cuantificación de patologías típicas observadas a través de estos métodos de imagen. Demostramos la efectividad de nuestro protocolo de fenotipado de EPR examinando ratones Tmem135 TG y WT de 24 meses de edad, ya que estos ratones muestran patologías de EPR30,31,32. Este protocolo se puede aplicar a cualquier ratón modificado genéticamente o tratado farmacológicamente que pueda albergar patologías del EPR como adelgazamiento del EPR, vacuolización, migración y dismorfia, así como BLamDs 6,7. Aunque las patologías del EPR observadas en ratones Tmem135 TG y WT de 24 meses de edad están presentes en otros modelos de ratón AMD 7,30, es importante que el investigador se familiarice con el modelo de ratón AMD elegido para sus estudios, ya que la edad de aparición y la gravedad de las patologías del EPR de su modelo de ratón AMD pueden diferir del Tmem135 TG y ratones WT de 24 meses de edad. Es posible que los investigadores necesiten utilizar más ratones para sus estudios que el número de ratones utilizados para producir los resultados representativos que se muestran en este artículo, si la presentación de las patologías del EPR es variable en sus respectivos modelos de ratón AMD. Además, muchos modelos de ratones AMD están actualmente disponibles para los investigadores de AMD, pero no tienen descripciones completas de sus patologías de EPR, lo que puede requerir que los investigadores realicen estudios preliminares para adquirir esta información.

Aunque se pueden hacer modificaciones en la forma en que se procesan los ojos del ratón para los diversos métodos de imagen, es fundamental mantener la evaluación cuantitativa de las anomalías estructurales del EPR como se describe en el protocolo. Por ejemplo, se prepararon cinco secciones retinianas teñidas con H&E para contar el número de eventos de microvacuolización, macrovacuolización y migración de EPR, lo que permitió a los investigadores evaluar patologías de EPR en múltiples ubicaciones en la retina del ratón. Otro ejemplo es el uso de una rejilla de microscopía electrónica de cobre de barra delgada de 400 mallas para evaluar las anomalías ultraestructurales del RPE. La rejilla de microscopía electrónica proporciona un marco para evaluar una muestra de retina de forma sistemática e imparcial mediante micrografía electrónica de transmisión, así como para obtener de 40 a 70 imágenes por sección retiniana para examinar la presencia de BLamDs. Esto no se puede lograr con una rejilla de ranura de microscopía electrónica, y sugerimos no utilizarlos con este protocolo. Por último, la captura de imágenes de aumento de 20x de los cuatro cuadrantes de un montaje plano RPE permite a los investigadores investigar grandes áreas de RPE murino para dismorfia y multinucleación. Los investigadores son libres de ampliar este protocolo y examinar secciones retinianas adicionales para patologías de EPR en sus estudios. Juntos, estos métodos permiten a los investigadores recopilar amplios datos para sacar conclusiones sobre las patologías estructurales del EPR que pueden estar presentes en sus modelos de ratón AMD.

Otra característica clave de este protocolo es la consistencia de los métodos de fenotipado de RPE. Por ejemplo, todos los ojos utilizados para la microscopía electrónica de luz y transmisión fueron orientados por el lado superior de la retina del ratón para la sección. Es importante mantener la orientación del ojo del ratón durante todo su procesamiento para la microscopía electrónica de luz y transmisión, ya que el ojo del ratón tiene una distribución topográfica de las células de la retina33,34. La orientación anatómica del ojo del ratón no se mantuvo para la preparación de montaje plano del EPR, ya que no se han observado cambios topográficos superiores a inferiores de la célula del EPR del ratón. De hecho, el EPR en la retina humana muestra cambios topográficos que irradian lejos de la cabeza del nervio óptico35, lo que sugiere que este puede ser el caso del EPR de ratón. Por último, la adquisición de imágenes descrita en este protocolo se basa en el posicionamiento anatómico del nervio óptico. La inclusión de estos aspectos metodológicos ayudará a reproducir los resultados de las patologías del EPR para los investigadores a medida que trabajan con sus modelos de ratón DMAE.

Los investigadores pueden desear agregar más características analíticas al protocolo de fenotipado de RPE. Algunos resultados fenotípicos que no se presentan en este protocolo son el examen del grosor de BrM, las microvellosidades apicales del EPR y otros componentes ultraestructurales del EPR. Estos componentes incluyen mitocondrias, gránulos de pigmento y otros orgánulos como fagosomas. Los investigadores pueden determinar el tamaño y el número de estos componentes en las micrografías electrónicas obtenidas con este protocolo utilizando el programa Fiji ImageJ. En particular, el estado de las mitocondrias puede ser un resultado fenotípico importante a considerar, ya que dirigirse a las mitocondrias en el EPR es una estrategia terapéutica importante para la DMAE36. Otro resultado fenotípico son mediciones adicionales de la dismorfia del EPR en montajes planos del EPR. Las imágenes de montaje plano de EPR obtenidas mediante el protocolo se pueden examinar para determinar la forma hexagonal del EPR, el número de celdas de EPR vecinas y otras propiedades con el programa REShAPE (https://github.com/nih-nei/REShAPE)35. Otro posible resultado fenotípico es si las patologías del EPR ocurren en las áreas central o periférica de la retina del ratón. Estas consideraciones fenotípicas adicionales fortalecerán aún más el protocolo de fenotipado del EPR descrito en este artículo.

Existen algunas limitaciones de este protocolo de fenotipado RPE. Una limitación de este método es la necesidad de sacrificar ratones para cosechar sus ojos para el fenotipado del EPR. Como alternativa, los nuevos avances en la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) permiten cuantificar el grosor y las patologías del EPR en ratones vivos37-39. Esto puede ser ventajoso para los investigadores que desean realizar estudios longitudinales en sus cohortes de modelos de ratones AMD. Otra limitación de este método es la falta de evaluaciones funcionales de RPE en ratones. Si los investigadores están interesados en una evaluación funcional del EPR en ratones, recomendamos realizar una electrorretinografía y medir el componente de la onda c, ya que la onda c es indicativa del papel funcional del EPR en la fototransducción40. Otra limitación de este método es la falta de mediciones bioquímicas de los marcadores de EPR en ratones. Si los investigadores desean investigar los niveles de marcadores de EPR, como la proteína de unión a retinaldehído celular (CRABLP), la proteína 65 kDa específica del epitelio pigmentario de la retina (RPE65), el miembro 13 de la subfamilia J del canal rectificador interno de potasio (KCNJ13) o la bestrofina 1 (BEST1), recomendamos recolectar ojos para inmunohistoquímica, PCR cuantitativa en tiempo real o análisis de Western blot.

En conclusión, este protocolo de fenotipado de EPR puede ser un recurso importante para los investigadores que utilizan modelos de ratón que recapitulan aspectos patológicos de la DMAE. Este protocolo también sirve para estandarizar cómo se evalúa el RPE en los modelos de ratón AMD, lo que no se ha descrito previamente en la literatura. La estandarización del fenotipado del EPR sería fundamental para traducir los hallazgos de ratones a otros modelos de DMAE, incluidos los modelos de cultivo celular del EPR4 y los modelos de organismos superiores, incluidos los primates no humanos. También ayudaría en nuestra comprensión de los mecanismos patobiológicos subyacentes al desarrollo de la DMAE y potencialmente el desarrollo de nuevas terapias para esta enfermedad cegadora.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores de este protocolo no tienen divulgaciones ni conflictos de intereses.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a Satoshi Kinoshita y al laboratorio de Iniciativas de Investigación Traslacional en Patología (TRIP) de la Universidad de Wisconsin (UW) por preparar nuestros tejidos para la microscopía óptica. Este núcleo cuenta con el apoyo del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de la Universidad de Wisconsin, el Centro de Cáncer Carbone de la Universidad de Wisconsin (P30 CA014520) y la Oficina del Director de los NIH (S10OD023526). La microscopía confocal se realizó en el Núcleo Óptico de Bioquímica de la UW, que se estableció con el apoyo del Departamento de Dotación de Bioquímica de la UW. Este trabajo también fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Ojo (R01EY022086 a A. Ikeda; R01EY031748 a C. Bowes Rickman; P30EY016665 al Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales de la UW; P30EY005722 al Duke Eye Center; NIH T32EY027721 a M. Landowski; F32EY032766 a M. Landowski), Presidente de Timothy William Trout (A. Ikeda), Premio FFB Free Family AMD (C. Bowes Rickman); y una subvención sin restricciones de la Investigación para Prevenir la Ceguera (Duke Eye Center).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2 PolyScientiifc R&D Company S1619
100 Capacity Slide Box Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol  MDS Warehouse 2292-CASE Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks Qosina 11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS) Premade 1x PBS can be used in this protocol. 
2.0 mL microtubes Genesee Scientific  24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold Electron Microscopy Sciences 70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends Fisher Scientific NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids Electron Microscopy Sciences T400-Cu
95% Ethanol MDS Warehouse 2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches) VWR 56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle VWR 23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG  Thermo Fisher Scientific A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle Sigma-Aldrich  Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width Roboz Surgical Instrument RS-5211 Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush Electron Microscopy Sciences 65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps Fisher Scientific  05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand Fisher Scientific  11-474-207
Cell Prolifer Program Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender VWR 10118-956
Computer
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
Distilled H20 Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55 Roboz Surgical Instrument RS-4984 Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder Electron Microscopy Sciences 71147-01
EPON 815 Resin Electron Microscopy Sciences 14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye Fisher Scientific  22050460 Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye. 
Epredia Mounting Media Fisher Scientific 22-110-610 Use for mounting H&E slides. 
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source Dolan-Jenner Industries Mi-150 Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector Thermo Scientific   14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32% Electron Microscopy Sciences 16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels Electron Microscopy Sciences 77564-05
Lead Citrate Electron Microscopy Sciences 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips Thermo Fisher Scientific 22X22I24788001LS Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin VWR 100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors Roboz Surgical Instrument RS-5600 Known as micro-dissecting scissors in protocol. 
Methanol Fisher Scientific  A412-4
Mice Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length Roboz Surgical Instrument RS-5913 Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum SouthernBiotech 0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades VWR 21909-380
Osmium Tetroxide  Electron Microscopy Sciences 19150
Paraformaldehyde, 32% Electron Microscopy Sciences 15714-S
Pencil
Petri Dish VWR  21909-380
Pipette Tips
Pipettes 
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody Thermo Fisher Scientific 402200
Propylene Oxide Electron Microscopy Sciences 20412
Razor Blade VWR 10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic VWR 89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker Staples 642736
Slide Rack for Staining Grainger 49WF31
Squared Cover Glass Slips Fisher Scientific  12-541B
Staining Dish with Cover Grainger 49WF30 Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe  Thermo Scientific  S7510-50 Use only the syringe barrel.
Timer Fisher 1464917
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium Vector Laboratories H-1000 Use for mounting RPE flat mounts. 
Xylene Fisher Scientific  22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching. 
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope Electron Microscopy Sciences 65575-02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
  4. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  5. Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
  6. Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  8. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
  9. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34 (2021).
  10. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
  11. Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  12. Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
  13. Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
  14. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19 (2022).
  15. Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
  16. Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
  17. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
  18. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19 (2020).
  19. Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160 (2018).
  20. Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
  21. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
  22. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33 (2021).
  23. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  25. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196 (2018).
  26. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  27. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
  28. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235 (2018).
  29. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  30. Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16 (2020).
  31. Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
  32. Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
  33. Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392 (2014).
  34. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
  35. Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119 (2022).
  36. Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
  37. Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
  38. Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
  39. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588 (2020).
  40. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).

Tags

Este mes en JoVE Número 193
Un protocolo para evaluar y cuantificar patologías del epitelio pigmentado retiniano en modelos murinos de degeneración macular relacionada con la edad
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., … More

Landowski, M., Grindel, S., Hao, Y., Ikeda, S., Bowes Rickman, C., Ikeda, A. A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration. J. Vis. Exp. (193), e64927, doi:10.3791/64927 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter