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Biology

प्रकाशिकी-आधारित प्रणाली का उपयोग करके हाइड्रोगेल-एम्बेडेड बरकरार माउस मांसपेशी फाइबर के उच्च-थ्रूपुट सिकुड़ा हुआ माप

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/65103
Automatic Translation
*1, *1, 1,4, 1,2,3
1Department of Physiology, Amsterdam UMC, 2Amsterdam Cardiovascular Sciences, Heart Failures and Arrhythmias, Amsterdam UMC, 3Amsterdam Movement Sciences, Tissue Function and Regeneration, Amsterdam UMC, 4Discipline of Child and Adolescent Health, Faculty of Health and Medicine, University of Sydney
* These authors contributed equally

Summary

कंकाल की मांसपेशी समारोह का मूल्यांकन पृथक मांसपेशी फाइबर की सिकुड़न को निर्धारित करके किया जा सकता है, पारंपरिक रूप से श्रमसाध्य, कम-थ्रूपुट दृष्टिकोण का उपयोग करके। यहां, हम हाइड्रोगेल-एम्बेडेड मांसपेशी फाइबर की सिकुड़न को निर्धारित करने के लिए एक प्रकाशिकी-आधारित, उच्च-थ्रूपुट विधि का वर्णन करते हैं। इस दृष्टिकोण में दवा स्क्रीनिंग और चिकित्सीय विकास के लिए अनुप्रयोग हैं।

Abstract

इन विट्रो सेल कल्चर सेलुलर प्रक्रियाओं का आकलन करने और चिकित्सीय रणनीतियों का परीक्षण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। कंकाल की मांसपेशियों के लिए, सबसे आम दृष्टिकोण में या तो मायोजेनिक पूर्वज कोशिकाओं को अपरिपक्व मायोट्यूब में अलग करना या पृथक व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबर की अल्पकालिक पूर्व विवो संस्कृति शामिल है। इन विट्रो पर पूर्व विवो संस्कृति का एक महत्वपूर्ण लाभ जटिल सेलुलर वास्तुकला और सिकुड़ा हुआ विशेषताओं का प्रतिधारण है। यहां, हम चूहों से बरकरार फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस मांसपेशी फाइबर के अलगाव और उनके बाद के पूर्व विवो संस्कृति के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, तंतुओं को गतिहीन करने और उनके सिकुड़ा हुआ कार्य बनाए रखने के लिए मांसपेशियों के तंतुओं को एक फाइब्रिन-आधारित और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स हाइड्रोगेल में एम्बेडेड किया जाता है। फिर हम प्रकाशिकी-आधारित, उच्च-थ्रूपुट अनुबंध प्रणाली का उपयोग करके मांसपेशी फाइबर सिकुड़ा हुआ कार्य का आकलन करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। एम्बेडेड मांसपेशी फाइबर को संकुचन को प्रेरित करने के लिए विद्युत रूप से उत्तेजित किया जाता है, जिसके बाद उनके कार्यात्मक गुणों, जैसे कि सरकोमेरे शॉर्टनिंग और सिकुड़ा हुआ वेग, का मूल्यांकन प्रकाशिकी-आधारित परिमाणीकरण का उपयोग करके किया जाता है। इस प्रणाली के साथ मांसपेशी फाइबर संस्कृति युग्मन संकुचनशील कार्य पर औषधीय एजेंटों के प्रभावों के उच्च-थ्रूपुट परीक्षण और आनुवंशिक मांसपेशी विकारों के पूर्व विवो अध्ययन की अनुमति देता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल को लाइव-सेल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मांसपेशी फाइबर में गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

इन विट्रो सेल कल्चर तकनीकों में प्रगति ने ऊतक पुनर्योजी क्षमताओं, पैथोफिजियोलॉजिकल सेलुलर तंत्र और बाद में चिकित्सीय रणनीतियों का अध्ययन करने के लिए नई संभावनाएं खोली हैं, जबकि सभी अच्छी तरह सेनियंत्रित परिस्थितियों में स्तनधारी ऊतकों का उपयोग करते हैं। इन विट्रो कल्चर सिस्टम का उपयोग मांसपेशी अनुसंधान क्षेत्र 4,5 के भीतर अच्छी तरह से स्थापित है। सामान्य तौर पर, मायोजेनिक पूर्वज कोशिकाओं से इन विट्रो-विभेदित अपरिपक्व मायोट्यूब का उपयोग 2,6,7,8 किया जाता है। यद्यपि अधिक परिपक्व मांसपेशी फाइबर9 उत्पन्न करने के लिए भेदभाव प्रोटोकॉल में प्रगति की गई है, लेकिन उनकी अपरिपक्वता अभी भी निष्कर्षों के अनुवाद को विवो सेटिंग 1,10 में सीमित करती है। मांसपेशी जीव विज्ञान क्षेत्र में एक केंद्रीय मुद्दा इन विट्रो-विभेदित मायोट्यूब्स की अक्षमता है जो मूल मांसपेशी ऊतक में देखे गए जटिल इंट्रासेल्युलर संरचनाओं, सेल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं और बाह्य अंतःक्रियाओं को पूरी तरह से प्रतीक बनाती है और महत्वपूर्ण रूप से, मांसपेशी फाइबर 1,2,10,11,12 द्वारा उत्पादित सिकुड़ा हुआ बलों को पुन: उत्पन्न करती है।. इसके अलावा, भेदभाव प्रक्रिया के दौरान मायोट्यूब्स के असमन्वित संकुचन के परिणामस्वरूप अक्सर संस्कृति व्यंजनों से सहज अलगाव होता है, जिससे इन विट्रो विभेदित मायोट्यूब का सिकुड़ा हुआ मूल्यांकन चुनौतीपूर्ण हो जाता है और गुणात्मक या अर्ध-मात्रात्मक मूल्यांकन 8,11,12,13 तक सीमित हो जाता है। इन सीमाओं को अक्सर जानवरों के साथ विवो प्रयोगों में नियमित रूप से आवश्यक होता है, खासकर अगर मांसपेशियों की सिकुड़न एक प्राथमिक प्रयोगात्मक परिणामहै।

विट्रो-विभेदित मायोट्यूब में संवर्धन का एक विकल्प पृथक परिपक्व मांसपेशी फाइबर 1,14 की पूर्व विवो संस्कृति है। पूर्व विवो संस्कृति के दौरान, विकासात्मक रूप से परिपक्व मांसपेशियों के ऊतकों को शरीर से बाहर निकाल दिया जाता है, इसके बाद प्रयोगशाला स्थितियों में खेती के लिए एकल-कोशिका अलगाव 1,14। पृथक परिपक्व मांसपेशी फाइबर मूल ऊतक14,15 के भीतर देखी गई अपनी जटिल सेलुलर संरचनाओं को बनाए रखते हैं, और यह विधि एक अच्छी तरह से परिभाषित और नियंत्रणीय संस्कृति वातावरण में आनुवंशिक हेरफेर और दवा स्क्रीनिंग जैसे प्रत्यक्ष हस्तक्षेप की संभावना खोलती है। कंकाल की मांसपेशी फाइबर अलगाव और पूर्व विवो संस्कृति के बारे में पहली रिपोर्टों में से एक 1930 के दशक की है; हालांकि, इस प्रोटोकॉल से व्यवहार्य फाइबर की उपज कमथी। अलगाव प्रक्रिया और संस्कृति स्थितियों के निरंतर अनुकूलन के साथ, व्यवहार्य और कार्यात्मक मांसपेशी फाइबर की मात्रा में एक महत्वपूर्ण सुधार अब संभव है14,15,17,18,19. संस्कृति की स्थिति में इस तरह के एक सुधार में संस्कृति डिश 15,18,20 पर पृथक मांसपेशी फाइबर के पालन को बढ़ावा देने के लिए बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ कोटिंग कल्चर व्यंजन शामिल हैं। आमतौर पर, लेमिनिन कोटिंग का उपयोग किया जाता है, क्योंकि लैमिनिन मांसपेशियों के बाह्य मैट्रिक्स20,21 के भीतर सबसे प्रचुर मात्रा में तत्वों में से एक है। संस्कृति व्यंजनों की कोटिंग के साथ संयुक्त अलगाव प्रक्रिया के अनुकूलन ने मांसपेशी अनुसंधान क्षेत्र को 1,15,18,22 की छोटी अवधि के लिए बरकरार सेलुलर वास्तुकला और संकुचनशील कार्यक्षमता के साथ पृथक व्यवहार्य मांसपेशी फाइबर रखने में सक्षम बनाया है।

बल और संकुचन क्षमताओं को मापने के लिए मांसपेशी क्षेत्र के भीतर उपयोग किया जाने वाला सबसे पारंपरिक दृष्टिकोण एक लंबाई ड्राइवर मोटर और एक बल ट्रांसड्यूसर23,24 के बीच व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबर को माउंट करना है। सामान्य तौर पर, इन मोटर-चालित सेटअपों के लिए उपयोग किए जाने वाले मांसपेशी फाइबर को स्नैप-जमे हुए या ताजा ऊतक से विच्छेदित किया जाता है, इसके बाद परमेबिलाइजेशन या "स्किनिंग" होता है, जो बाहरी कैल्शियम सक्रियण की अनुमति देता है, जहां मांसपेशियों के फाइबर संकुचनको प्रेरित करने के लिए अलग-अलग कैल्शियम सांद्रता का उपयोग किया जाता है। जबकि यह विधि मांसपेशी फाइबर सिकुड़ा हुआ माप के लिए स्वर्ण मानक है, एक समय में केवल एक मांसपेशी फाइबर को मापा जा सकता है, जिससे यह तकनीक एक श्रमसाध्य और समय लेने वाली प्रक्रियाबन जाती है। इसके अलावा, मांसपेशी फाइबर की अलगाव और चमड़ी प्रक्रिया उत्तेजना-संकुचन युग्मन (यानी, कैल्शियम रिलीज और बाद में सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम में रीपटेक) में शामिल विभिन्न संरचनाओं को बाधित करती है, जिससे विश्राम कैनेटीक्स और किसी भी बीमारी के अध्ययन की अनुमति नहीं मिलती है जो इस प्रक्रिया को प्रभावित कर सकती है।. चमड़ी वाले फाइबर की तैयारी का एक विकल्प बरकरार मांसपेशी फाइबर को अलग करने के लिए यांत्रिक विच्छेदन का उपयोग कर रहा है, जहां विद्युत सक्रियण28 के जवाब में सिकुड़ा हुआ बलों को मापा जा सकता है; हालांकि, यह दृष्टिकोण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और बहुत समय लेने वाला है, जिसके परिणामस्वरूप कम-थ्रूपुट माप होते हैं। अंत में, चमड़ी और बरकरार तैयारी दोनों में, मांसपेशियों की कोशिकाओं को सिकुड़ा हुआ माप24 के दौरान बाह्य वातावरण से पूरी तरह से हटा दिया जाता है, जिससे मांसपेशी फाइबर संकुचन पर बाह्य मैट्रिक्स संरचना / कठोरता के प्रभाव की जांच असंभवहो जाती है। नतीजतन, मांसपेशी फाइबर और बाह्य मैट्रिक्स के बीच संबंध को फिर से बनाते समय उच्च-थ्रूपुट तरीके से पृथक बरकरार मांसपेशी फाइबर के मांसपेशी फाइबर संकुचन माप को सक्षम करने के लिए वैकल्पिक तरीकों के विकास की आवश्यकता होती है।

हाल ही में, उच्च-थ्रूपुट मांसपेशी फाइबर सिकुड़न माप के लिए एक नया प्रकाशिकी-आधारितदृष्टिकोण विकसित किया गया था। यह प्रकाशिकी-आधारित प्रणाली उच्च गति इमेजिंग का उपयोग करके संकुचन के दौरान सरकोमेरे की लंबाई का आकलन करने के लिए सरकोमेरेस की आवधिकता को मापती है। इस प्रणाली के भीतर, कोशिकाएं संस्कृति डिश में जगह में रहती हैं, जबकि प्रकाशिकी को स्थानांतरित किया जाता है, जिससेकई कोशिकाओं के माप के बीच आवश्यक समय कम हो जाता है। इस उच्च-थ्रूपुट, ऑप्टिक्स-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करने का एक बड़ा लाभ यह है कि यह संस्कृति की स्थितियों को विकसित करने की अनुमति देता है जो मूल ऊतक के समान हैं। विवो स्थितियों में देशी की नकल करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक दृष्टिकोण हाइड्रोगेल30 में कोशिकाओं को एम्बेड कर रहा है। आमतौर पर, एक हाइड्रोगेल एक विस्कोस्टिक सामग्री है जो इसकी मात्रा और आकार को बनाए रखने में सक्षम है, और हाइड्रोगेल में ठोस औरतरल सामग्री दोनों के गुण होते हैं। ठोस भाग में बहुलक श्रृंखलाएं होती हैं जो एक दूसरे से क्रॉस-लिंक होती हैं, जिससे एक संरचना बनती है जो शुद्ध30,31 के समान दिखती है। हाइड्रोगेल के भौतिक गुणों को मांसपेशियों के मैट्रिक्स जमाव30,31 की नकल करने के लिए ट्यून किया जा सकता है। इस प्रकार, हाइड्रोगेल में एम्बेडेड कोशिकाओं के साथ एक उच्च-थ्रूपुट, ऑप्टिक्स-आधारित प्रणाली का संयोजन मांसपेशी फाइबर कार्यक्षमता पर बाह्य मैट्रिक्स संरचना और यांत्रिक गुणों के प्रभावों का आकलन करने के लिए नई संभावनाएं खोलता है।

इस पेपर का समग्र उद्देश्य 1) मूल ऊतक वातावरण की नकल करने वाली स्थितियों में मांसपेशी फाइबर के एंजाइमेटिक अलगाव और पूर्व विवो संस्कृति के लिए पद्धति का वर्णन करना है और 2) उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण का उपयोग करके मांसपेशी फाइबर संकुचन का आकलन करना है। हम एंजाइमेटिक पाचन का उपयोग करके फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस (एफडीबी) मांसपेशी से बड़ी संख्या में एकल मांसपेशी फाइबर को आसानी से अलग करने के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम मांसपेशियों के मूल वातावरण की नकल करने और मांसपेशी फाइबर व्यवहार्यता और संकुचन में सुधार के लिए फाइब्रिन-आधारित हाइड्रोगेल में पृथक मांसपेशी फाइबर को एम्बेड करने की एक तकनीक का वर्णन करते हैं। फिर हम इस हाल ही में विकसित प्रणाली का उपयोग करके विट्रो में जीवित मांसपेशी फाइबर संकुचन को मापने की एक उच्च-थ्रूपुट विधि की रूपरेखा तैयार करते हैं। इस एम्बेडिंग प्रक्रिया का एक अतिरिक्त लाभ संकुचन के दौरान तंतुओं का स्थिरीकरण है, जो इन मापों के सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार कर सकता है। यह जेल-एम्बेडिंग विधि एकल बहुलक और समग्र जेल एनकैप्सुलेशन प्रक्रियाओं दोनों के लिए लागू होती है, जिससे मांसपेशी फाइबर संकुचन पर बाह्य मैट्रिक्स संरचना के प्रभावों के आकलन की सुविधा मिलती है।

Protocol

पूर्व विवो संकुचन अध्ययन के लिए, नीदरलैंड के पशु अनुसंधान कानून की अनुमति से यूरोपीय परिषद निर्देश (2010/63 / ईयू) के अनुसार वीयू विश्वविद्यालय के अन्य अनुमोदित अनुसंधान परियोजनाओं और / या प्रजनन अधिशेष के लिए बलिदान किए गए जानवरों से पोस्टमार्टम ऊतक प्राप्त किया गया था।

1. सामग्री तैयार करना

  1. ट्राइट्यूरेशन के लिए पिपेट तैयार करें (उपयोग तक प्रवाह कैबिनेट में 70% इथेनॉल में स्टोर करें)। विभिन्न छेद आकार बनाने के लिए दो पी 1,000 युक्तियों के सिरों को काटें; सुनिश्चित करें कि छेद इतना बड़ा है कि पाइप को अवरुद्ध किए बिना मांसपेशियों से गुजरना है। कटे हुए सिरों को आंच के माध्यम से चलाएं ताकि वे चिकनी हो जाएं।
  2. 32 में वर्णित सिल्गार्ड व्यंजन तैयार करें, और अलगाव के दौरान पंजे और मांसपेशियों को सुरक्षित करने में उपयोग के लिए 70% इथेनॉल के साथ पहले से ही निष्फल करें।
    नोट: विआयनीकृत पानी और 70% इथेनॉल के साथ पूरी तरह से सफाई के बाद सिल्गार्ड व्यंजनों का पुन: उपयोग किया जा सकता है।
  3. अलगाव प्रक्रिया से पहले निम्नलिखित समाधान तैयार करें: विच्छेदन माध्यम, फाइब्रिन कल्चर माध्यम और मांसपेशी पाचन माध्यम ( तालिका 1 देखें)।
    नोट: मांसपेशियों के पाचन माध्यम को 0.22 μm फ़िल्टर का उपयोग करके फ़िल्टर-स्टरलाइज़ किया जाना चाहिए। सभी तैयार समाधानों को उपयोग से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर एक मानक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में समकक्ष किया जाना चाहिए।
  4. मांसपेशियों के पाचन के बाद, हाइड्रोगेल डालने के लिए निम्नलिखित समाधान तैयार करें: सेल मिश्रण और मैट्रिक्स मिश्रण ( तालिका 2 देखें)। 2.5 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम फाइब्रिन एकाग्रता के लिए सेल मिश्रण और मैट्रिक्स मिश्रण को 1: 1 के अनुपात में मिलाएं।
    नोट: बर्फ पर मैट्रिक्स तैयार करें, और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के समय से पहले पोलीमराइजेशन को रोकने के लिए प्रीचिल्ड पिपेट युक्तियों का उपयोग करें। यहां उपयोग किए जाने वाले थ्रोम्बिन: फाइब्रिनोजेन अनुपात 1: 10 (यूनिट प्रति मिलीग्राम फाइब्रिनोजेन) को 30 मिनट के पोलीमराइजेशन समय के लिए अनुकूलित किया गया है। यदि जेल 30 मिनट के भीतर पॉलीमराइज्ड होता है, तो कम थ्रोम्बिन एकाग्रता का उपयोग किया जाना चाहिए। अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें।

2. एफडीबी मांसपेशी विच्छेदन।

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें। 70% अल्कोहल के साथ पिछले अंग को कीटाणुरहित करें।
  2. टखने के ऊपर निचले पिछले पैर को काट दें। पैर की उंगलियों की ओर पैर के पृष्ठीय पक्ष की त्वचा को काट लें।
    नोट: बाद में आवश्यकता पड़ने पर निचले अंग की मांसपेशियों और टिबिया को नुकसान से बचाने के लिए टखने के जोड़ पर निचले पिछले पैर को काट दें।
  3. सावधानी से पैर की उंगलियों की ओर त्वचा को छीलें। ध्यान रखें कि मांसपेशियों को नुकसान न पहुंचे। एफडीबी पैर के उदर पक्ष पर सबसे सतही मांसपेशी है।
  4. विच्छेदित पैर को 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीलीटर प्रीवार्म्ड विच्छेदन माध्यम के साथ एक सिल्गार्ड डिश में रखें। पैर को त्वचा के माध्यम से पिन करें जो अभी भी पैर की उंगलियों से जुड़ा हुआ है, और निचले पैर को टखने से परे पिन करें।
  5. मांसपेशियों के शीर्ष पर संयोजी ऊतक को ध्यान से हटा दें। एड़ी पर कण्डरा काटें, और मांसपेशियों को उसके कण्डरा से ऊपर उठाएं।
  6. संयोजी ऊतक के माध्यम से मांसपेशियों के साथ और नीचे काटें। पैर की अंगुली के टेंडन के उजागर होने तक काटते रहें।
  7. जब तीन कण्डरा की लंबाई का आधा हिस्सा उजागर हो जाता है, तो कण्डरा को काट दें, और पैर से मांसपेशियों को छोड़ दें। वैकल्पिक: चौथे पार्श्व कण्डरा और उसके मांसपेशी फाइबर को ट्रिम करें।
  8. मांसपेशियों से संयोजी ऊतक को साफ करें, और एक ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें पहले से गर्म विच्छेदन माध्यम होता है।

3. एफडीबी मांसपेशी पाचन

  1. तालिका 1 के अनुसार मांसपेशियों के पाचन माध्यम तैयार करें।
  2. सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके एफडीबी मांसपेशियों को मांसपेशियों के पाचन माध्यम में स्थानांतरित करें। 80 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक ऊतक संवर्धन इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
    नोट: यह समय प्रत्येक कोलेजनेस बैच के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। पाचन तब पूरा होता है जब मांसपेशियों में खिंचाव आने लगता है और बढ़ी हुई दिखती है। पाचन समय के अनुकूलन के लिए चर्चा देखें।
  3. पाचन के बाद, मांसपेशियों को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 3 एमएल विच्छेदन माध्यम होता है, और ट्राइट्यूरेशन से पहले 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।

4. एफडीबी मांसपेशी ट्राइट्यूरेशन और गुरुत्वाकर्षण अवसादन।

  1. मांसपेशियों को सबसे बड़े से सबसे छोटे आकार तक जाते हुए, पहले से तैयार किए गए ट्राइट्यूरेशन टिप्स (चरण 1.1) का उपयोग करके मांसपेशियों को ट्रिट्यूरेट करें। यदि इस चरण में 5 मिनट से अधिक समय लगता है, तो मांसपेशियों को 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें ताकि इसे आराम करने की अनुमति मिल सके।
  2. तब तक ट्रिट्यूरेट करें जब तक कि मांसपेशी फाइबर ज्यादातर कण्डरा से बाहर नहीं आ जाते हैं और कण्डरा पी 200 टिप से गुजर सकता है। टेंडन को हटा दें।
  3. विघटित एफडीबी फाइबर को 15 एमएल ट्यूब में जोड़ें जिसमें 10 एमएल विच्छेदन माध्यम होता है, और फाइबर को 20 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में बसने की अनुमति दें। गठित गोली का निरीक्षण करें।
  4. वैकल्पिक: शीर्ष से 10 एमएल माध्यम निकालें, और चरण 4.3 दोहराएं। यह कदम अतिरिक्त मलबे और संबंधित मोनोन्यूक्लियेटेड कोशिकाओं को हटाने की सुविधा प्रदान करता है।

5. एफडीबी फाइबर एम्बेडिंग

  1. फाइबर गोली के शीर्ष से सभी माध्यम को ध्यान से हटा दें। प्रति एफडीबी मांसपेशी (बर्फ पर) सेल मिश्रण के 875 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    नोट: एक एफडीबी मांसपेशी 24-वेल प्लेट के सात कुओं के लिए पर्याप्त फाइबर पैदा करती है। इस घनत्व को प्रयोग की जरूरतों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। निम्नलिखित जेल वॉल्यूम (250 μL) को 24-अच्छी तरह से प्रारूप के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन अन्य प्रारूपों के लिए तदनुसार बढ़ाया जा सकता है।
  2. सेल के एलिकोट 125 μL एकल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में मिश्रण करते हैं।
  3. एक बार में एक अच्छी तरह से, सेल सस्पेंशन एलिकोट में मैट्रिक्स मिश्रण के 125 μL जोड़ें, और बुलबुले के गठन से बचने के लिए सावधानी से ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं।
  4. अंतिम मिश्रण को तुरंत एक कुएं में स्थानांतरित करें।
    नोट: मिश्रण को कुएं के बीच में डालना सुनिश्चित करें। प्रत्येक अच्छी तरह से चरण 5.3 और चरण 5.4 दोहराएँ।
  5. 30-45 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में जैल को ठोस करें। जमने के बाद, कुओं में संस्कृति माध्यम को सावधानीपूर्वक जोड़ें।
    नोट: फास्ट पाइपिंग हाइड्रोगेल को कुएं से अलग कर सकती है। इस बिंदु से, तंतुओं को उत्तेजित और मापा जा सकता है। हालांकि, हमारे अनुभव में, फाइबर को 24 घंटे के लिए संस्कृति की स्थिति में समायोजित करने से फाइबर सिकुड़न में सुधार हो सकता है।
  6. लंबी संस्कृति के लिए, हर 2 दिनों में आधे-बदलाव से संस्कृति माध्यम को फिर से भरें। ऐसा करने के लिए, संस्कृति माध्यम के आधे हिस्से को हटा दें, और इसे ताजा माध्यम की समान मात्रा के साथ बदलें।

6. प्रकाशिकी-आधारित सिकुड़ा हुआ माप

  1. प्रकाशिकी-आधारित सिकुड़ा हुआ माप प्रणाली चालू करें (सामग्री की तालिका देखें), प्रतिदीप्ति लैंप, विद्युत सेल पेसर और कंप्यूटर। पृथक मांसपेशी फाइबर को उत्तेजित करने के लिए विद्युत उत्तेजक को 1.0 हर्ट्ज, 10.0 वी और 5.00 एमएस की पल्स अवधि पर सेट करें।
  2. प्लेट को माप प्रणाली में डालें। पेसर को पेसिंग इंसर्ट से कनेक्ट करें, और इसे कल्चर प्लेट में डालें।
  3. प्रोग्राम IonWizard खोलें, और फ़ाइल (स्क्रीन के शीर्ष बाएं) पर क्लिक करके एक नई फ़ाइल खोलें | नया.
  4. जांचें कि क्या कार्यक्रम सही प्रयोग पर है, कंकाल सरकोमेरे, न्यू पर क्लिक करके प्रयोग एकत्र करें। प्रयोग को बदलने के लिए, वांछित प्रयोग पर क्लिक करें, और जोड़ें दबाएँ। स्केलेटल सरकोमेरे प्रयोग के लिए, निम्नलिखित सेटिंग्स लागू करें: एसएआरसी 20x, औसत लाइनें, एकल एफएफटी, 250 हर्ट्ज नमूना दर, और 10 सेकंड का अधिग्रहण समय।
    नोट: प्रयोग से पहले प्रयोगात्मक सेटिंग्स तैयार किया जाना चाहिए। सेटिंग्स को प्रयोग की जरूरतों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
  5. माप प्रणाली के तापमान को 25 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित करें। टूलबार के नीचे ओपन सेल फाइंडर पर क्लिक करें, और एक नई स्क्रीन पॉप अप होने की प्रतीक्षा करें। इस स्क्रीन के शीर्ष दाईं ओर, प्लेट प्रकार और सक्रिय कुओं का चयन करें।
    नोट: तेजी से हिलने वाले एफडीबी मांसपेशी फाइबर की संकुचन गति को कम करने के लिए माप 25 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है, जिससे सिकुड़ा हुआ घटना के अंडरसैंपलिंग को रोका जा सकता है।
  6. फोकस स्लाइडर बार को समायोजित करके फाइबर को फोकस में लाएं। वैकल्पिक रूप से, इस फ़ोकस फ़ंक्शन के लिए डब्ल्यू कुंजी और एस कुंजी का उपयोग करें।
  7. विद्युत उत्तेजना शुरू करने के लिए पेसिंग को सक्षम करें। देखें कि फाइबर अब हिलना शुरू कर देते हैं।
    नोट: यदि कोई फाइबर नहीं हिल रहा है, तो सुनिश्चित करें कि सभी तार जुड़े हुए हैं और पेसर पूरी तरह से जलमग्न है। यदि इसके बाद भी कोई आंदोलन नहीं होता है, तो फाइबर अतिपाचन या पुनरावृत्ति के दौरान अत्यधिक क्षति के कारण प्रतिक्रिया नहीं दे सकते हैं।
  8. फाइबर के अंत पर माप क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करें जैसे कि सरकोमेर्स लंबवत रूप से चलते हैं। सुनिश्चित करें कि सरकोमेर्स फोकस में हैं। यदि सरकोमेरेस फोकस में हैं, तो टूलबार में एक एकल शिखर दिखाई देता है। संकुचन के दौरान, यह चोटी दाईं ओर चली जाएगी क्योंकि सरकोमेरे छोटा हो जाता है।
    नोट: प्रयोग शुरू करने से पहले बैंगनी माप क्षेत्र को समायोजित किया जा सकता है। एक उचित माप सुनिश्चित करने के लिए, ~ 20 सरकोमेरेस शामिल करें। यदि संकुचन के दौरान यह शिखर आकार बदलता है, तो यह संकेत दे सकता है कि संकुचन के दौरान सरकोमेरे अस्पष्ट या फोकस से बाहर है, जो शोर का परिचय देता है।
  9. टूलबार में स्टार्ट पर क्लिक करके प्रयोग शुरू करें। माप शुरू करने के लिए क्यू कुंजी दबाएं, और 10 संकुचन क्षणिकों को मापने के लिए प्रोग्राम की प्रतीक्षा करें। यदि चार से अधिक क्षणिक शोर-मुक्त दिखते हैं, तो जेड कुंजी दबाकर माप स्वीकार करें। यदि क्षणिकों में बहुत अधिक शोर है, तो एक्स कुंजी दबाकर माप को अस्वीकार करें।
  10. प्रति स्थिति 10 फाइबर और 20 फाइबर के बीच मापें। पहले से मापा फाइबर के स्थानों को बरकरार रखा गया है।
  11. वैकल्पिक: यौगिक ों को जोड़ें, जिसके बाद फाइबर को इस बिंदु पर फिर से मापा जा सकता है।
  12. प्रयोग समाप्त होने पर, सेल खोजक विंडो को बंद करने के लिए निचले टूलबार में स्टॉप बटन दबाएं। फ़ाइल सहेजें, और एक नई फ़ाइल प्रारंभ करें।
  13. डेटा का विश्लेषण करने के लिए, प्रोग्राम "साइटोसॉल्वर डेस्कटॉप" खोलें। आयात पर क्लिक करें, और विश्लेषण की जाने वाली फ़ाइल का चयन करें।
  14. कार्यक्रम के विश्लेषण समाप्त करने के बाद, नीले, लाल और भूरे रंग की चोटियों की तलाश करें। नीली चोटियां क्षणिक हैं जो कार्यक्रम द्वारा स्वीकार की जाती हैं। लाल चोटियां क्षणिक होती हैं जिन्हें प्रोग्राम द्वारा अस्वीकार कर दिया जाता है, और ग्रे चोटियां उपयोगकर्ता द्वारा अस्वीकार की जाती हैं।
    नोट: अस्वीकृति मानदंड विश्लेषण सॉफ्टवेयर में समायोजित किया जा सकता है। सामान्य तौर पर, मान अस्वीकार कर दिए जाते हैं यदि वे अधिकतम व्युत्पन्न सीमा से अधिक होते हैं, और क्षणिक को <0.95 के वक्र फिट आर2 मानों के आधार पर अस्वीकार कर दिया जाता है।
  15. निर्यात पर क्लिक करें। निम्न बॉक्स पर टिक करें: औसत क्षणिक डेटा और उत्कृष्टता के लिए निर्यात।
  16. समाप्त होने पर, सभी मशीनों को बंद कर दें। संस्कृति प्लेट को बाहर निकालें, और इसका निपटान करें। विआयनीकृत पानी और 70% इथेनॉल के साथ पेसर इलेक्ट्रोड को साफ करें।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एकल एफडीबी मांसपेशी फाइबर को अलग किया गया और हाइड्रोगेल में एम्बेडेड किया गया। मांसपेशी विच्छेदन प्रक्रिया का अवलोकन चित्रा 1 में दिखाया गया है। एफडीबी मांसपेशी बरकरार टेंडन के साथ उजागर होती है और प्रावरणी से ढीली हो जाती है। निर्धारण बिंदुओं के रूप में मांसपेशियों के टेंडन को बनाए रखना अलगाव प्रक्रिया के दौरान मांसपेशी फाइबर को संभावित नुकसान को कम करता है। मलबे और द्वितीयक सेल प्रकारों के विकास को कम करने के लिए अतिरिक्त संयोजी ऊतक को काट दिया जा सकता है। एक बार जब मांसपेशियों को पर्याप्त रूप से उत्पादित और साफ किया जाता है, तो मांसपेशियों को कोलेजनेस का उपयोग करके एंजाइमेटिक रूप से पचाया जाता है, और हाइड्रोगेल में पृथक कोशिकाओं को एम्बेड करने से पहले एकल मांसपेशी फाइबर को ट्राइट्यूरेशन द्वारा जारी किया जाता है। एफडीबी मांसपेशी फाइबर का अलगाव अपेक्षाकृत कम मांसपेशी फाइबर प्रदान करता है, जिसमें आसानी से हेरफेर होने का लाभ होता है। उनके आकार के कारण, एफडीबी मांसपेशी फाइबर को उलझन-प्रेरित क्षति के बिना सुरक्षित रूप से पाइप किया जा सकता है और आसानी से एक हाइड्रोगेल के भीतर एम्बेडेड होता है। चूंकि एकल मांसपेशी फाइबर संस्कृति प्लेटों का बहुत अच्छी तरह से पालन नहीं करते हैं, हाइड्रोगेल में फाइबर एम्बेड करना यह सुनिश्चित करता है कि फाइबर सेल कल्चर और सिकुड़ा हुआ माप के दौरान रहते हैं। इसके अलावा, फाइब्रिन जेल में एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के अलावा मांसपेशियों के तंतुओं और मैट्रिक्स के बीच बातचीत की अनुमति देता है, जो विवो वातावरण में मूल की नकल करता है। पृथक एकल मांसपेशी फाइबर को अलगाव के बाद कई दिनों तक संस्कृति में हेरफेर और बनाए रखा जा सकता है। चित्रा 2 में, एक हाइड्रोगेल मैट्रिक्स में एम्बेडेड पृथक एफडीबी फाइबर का एक उदाहरण दिखाया गया है। स्वस्थ तंतुओं में दृश्यमान सार्कोमेर्स होते हैं और सीधे (नीले तीर) तक फैले होते हैं, जबकि घुमावदार फाइबर आमतौर पर क्षतिग्रस्त या अव्यवहार्य (पीले तीर) होते हैं और उन्हें माप से बाहर रखा जाना चाहिए। हाइपरकॉन्ट्रैक्टेड फाइबर मैट्रिक्स (लाल तीर) में गहरे बॉल-अप ऑब्जेक्ट ्स के रूप में दिखाई देते हैं। यदि अलगाव प्रक्रिया सफल थी, तो स्वस्थ फाइबर का अनुपात ~ 75% होना चाहिए। हाइपरकॉन्ट्रैक्टेड फाइबर का एक बड़ा अनुपात आमतौर पर अलगाव प्रक्रिया के दौरान क्षति का संकेत देता है। मांसपेशियों के तंतुओं की झिल्ली या तो मांसपेशियों के अतिपाचन से क्षतिग्रस्त हो सकती है या ट्राइट्यूरेशन के दौरान तंतुओं को नुकसान पहुंचा सकती है। ट्राइट्यूरेशन क्षति मुख्य रूप से तब होती है जब मांसपेशी कम पच जाती है और इस प्रकार, आसानी से अलग नहीं होती है।

फाइबर कार्यक्षमता और व्यवहार्यता का मूल्यांकन प्रकाशिकी-आधारित, उच्च-थ्रूपुट सिकुड़ा हुआ माप प्रणाली का उपयोग करके मांसपेशी फाइबर के सिकुड़ा हुआ माप के माध्यम से किया गया था। सिस्टम कई मापदंडों को आउटपुट करता है, जैसे कि सरकोमेरे की लंबाई, सरकोमेरे शॉर्टनिंग का प्रतिशत, सिकुड़ा हुआ वेग और विश्राम वेग। सिकुड़ा हुआ माप प्रणाली का उपयोग करके, सरकोमेरे संकुचन को प्रति मांसपेशी फाइबर मापा जा सकता है। चित्रा 3 माप प्रणाली का उपयोग करके मापा गया मांसपेशी फाइबर संकुचन के उदाहरण दिखाता है। एकल संकुचन क्षणिक से, निम्नलिखित पैरामीटर प्राप्त किए जाते हैं: बेसलाइन पर सरकोमेरे की लंबाई, संकुचन अवधि, अधिकतम संकुचन पर सरकोमेरे की लंबाई, और विश्राम अवधि (चित्रा 3 ए)। इन मापदंडों का उपयोग सरकोमेरे शॉर्टनिंग, संकुचन और विश्राम वेगों के प्रतिशत की गणना करने के लिए किया जाता है। यदि आवश्यक हो, तो औसत वेग मूल्यों की गणना अवधि और पूर्ण शॉर्टनिंग मानों से भी की जा सकती है। एक वैध संकुचन माप में एक सीधी आधार रेखा होती है, जिसके बाद शिखर पर डुबकी आती है, और बेसलाइन पर वापसी होती है (चित्रा 3 ए)। शोर, अकेंद्रित सरकोमेरेस, या फाइबर की असामान्य गति माप क्षणिक (चित्रा 3 बी, सी) को प्रभावित कर सकती है, और इन मापों को मैन्युअल रूप से त्याग दिया जा सकता है या विश्लेषण कार्यक्रम द्वारा अस्वीकार कर दिया जाएगा। इस दृष्टिकोण में, संकुचन को मापने के लिए सरकोमेरेस का स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन महत्वपूर्ण है; इस प्रकार, कुछ भी जो सरकोमेर्स की दृश्यता को कम करता है, शोर पेश कर सकता है। यह तब हो सकता है जब संकुचन के दौरान फोकल प्लेन के बाहर सरकोमेरे की गति होती है। माप जिसमें संकुचन की एक श्रृंखला गति या गहराई में भिन्न होती है, उसे भी डेटासेट से बाहर रखा जाना चाहिए।

इस प्रणाली के साथ प्राप्त एकल मांसपेशी फाइबर के सिकुड़ा हुआ डेटा का उपयोग विभिन्न संस्कृति स्थितियों की तुलना करने के लिए किया जा सकता है। सिस्टम की प्रभावशीलता को चित्रा 4 में चित्रित किया गया है। यहां, हमने 2 डी (लैमिनिन-लेपित संस्कृति प्लेटों) और 3 डी (फाइब्रिन हाइड्रोगेल) संस्कृति प्रारूपों दोनों में एफडीबी मांसपेशी फाइबर के संकुचन को मापा। 3 डी में प्रयोग करने योग्य माप का एक उच्च प्रतिशत हासिल किया गया था, क्योंकि जेल में फाइबर एम्बेड करने से पार्श्व आंदोलन और अन्य आंदोलन कलाकृतियों को माप को प्रभावित करने से रोका गया था (चित्रा 4 ए)। फाइबर को एम्बेड करने से 2 डी-सुसंस्कृत फाइबर (चित्रा 4 बी) की तुलना में सरकोमेरे शॉर्टनिंग या अधिकतम संकुचन गति मूल्यों पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ा। यह समझाने के लिए कि विभिन्न मैट्रिक्स एफडीबी मांसपेशी फाइबर के संकुचन को कैसे प्रभावित करते हैं, हमने इस फाइब्रिन हाइड्रोगेल की तुलना शुद्ध तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (4 मिलीग्राम / एमएल) (चित्रा 4 सी) से भी की। शुद्ध तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में देखी गई कम सिकुड़न जेल की कठोरता या सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन में वृद्धि के कारण होने की संभावना थी। 7 मिलीग्राम / एमएल तक की फाइब्रिन सांद्रता का भी परीक्षण किया गया है, जिसमें सिकुड़ा हुआ गति और छोटा होने (अप्रकाशित डेटा) पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं है। इस फाइब्रिन-आधारित हाइड्रोगेल का उपयोग सिकुड़ा हुआ मापदंडों के साथ न्यूनतम हस्तक्षेप सुनिश्चित करता है।

Figure 1
चित्रा 1: एफडीबी मांसपेशी विच्छेदन प्रक्रिया का अवलोकन। (ए) पिछले अंग को टखने (लाल डैश्ड लाइन) के ऊपर काटा जाता है, और (बी) नीली डैश्ड लाइन के साथ पैर के शीर्ष के साथ काटकर त्वचा को हटा दिया जाता है। (सी) पैर को टखने के माध्यम से और त्वचा को पैर की उंगलियों के माध्यम से पिन किया जाता है। (डी) उजागर मांसपेशियों और उसके आसपास के संयोजी ऊतक का सूक्ष्म दृश्य। प्रावरणी एक सफेद अपारदर्शी परत के रूप में दिखाई देती है जिसके माध्यम से वाहिका चलती है। (ई) प्रावरणी को मांसपेशियों से हटा दिया जाता है, और कण्डरा को लाल डैश्ड लाइन के साथ काट दिया जाता है। (एफ) एफडीबी मांसपेशियों को मांसपेशियों के नीचे और साथ उठाकर और काटकर अंतर्निहित ऊतक से अलग किया जाता है। (जी) जब पैर की उंगलियों के टेंडन स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं, तो एफडीबी को लाल डैश्ड लाइन के साथ काट दिया जाता है। (एच) एफडीबी को कण्डरा द्वारा सुरक्षित किया जाता है, और चौथे पार्श्व कण्डरा और इसके तंतुओं को लाल डैश्ड लाइन के साथ काटकर हटाया जा सकता है। अतिरिक्त प्रावरणी को अब छंटनी की जा सकती है। (I) सफाई के बाद, FDB मांसपेशियों को कोलेजनेस समाधान में स्थानांतरित किया जाता है। स्केल सलाखों = (डी-आई) 2 मिमी। संक्षिप्त नाम: एफडीबी = फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: 24 घंटे की संस्कृति के बाद हाइड्रोगेल में एम्बेडेड एफडीबी मांसपेशी फाइबर की सूक्ष्म छवि। नीला तीर: एक व्यवहार्य एफडीबी मांसपेशी फाइबर का उदाहरण। पीला तीर: एक मुड़े हुए एफडीबी मांसपेशी फाइबर का उदाहरण। मुड़ी हुई मांसपेशी फाइबर ने व्यवहार्यता और बिगड़ा हुआ संकुचन कम कर दिया हो सकता है और इस प्रकार, माप से बाहर रखा जाना चाहिए। लाल तीर: एक हाइपरकॉन्ट्रैक्टेड एफडीबी मांसपेशी फाइबर का उदाहरण। अत्यधिक हाइपरकॉन्ट्रेक्शन तब होता है जब ट्राइट्यूरेशन बहुत सख्ती से किया जाता है या कोलेजनेस ओवरडाइजेशन या गैर-समतुल्य संस्कृति माध्यम के उपयोग के कारण हो सकता है। स्केल बार = 100 μm। संक्षिप्त नाम: एफडीबी = फ्लेक्सर डिजिटोरम ब्रेविस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रकाशिकी-आधारित, उच्च-थ्रूपुट सिकुड़ा हुआ प्रणाली का उपयोग करके मापा गया फाइबर संकुचन क्षणिकता का उदाहरण। (ए) एक सामान्य संकुचन क्षणिक का उदाहरण। यह क्षणिक निचले टूलबार में दिखाए गए बैंगनी वर्ग द्वारा संलग्न सरकोमेरेस से प्राप्त किया जाता है। क्षणिक में निम्नलिखित घटक होते हैं: बेसलाइन (हरे), संकुचन अवधि (नीले), अधिकतम संकुचन (बैंगनी) पर सरकोमेरे की लंबाई, और विश्राम अवधि (लाल)। इन मानों से वेग और संकुचन के प्रतिशत जैसे मापदंडों की गणना की जाती है। (बी) एक अपर्याप्त संकुचन क्षणिक का उदाहरण। ये माप तब होते हैं जब शोर के कारण सरकोमेरे सिग्नल नहीं उठाया जाता है (लाल तीर देखें)। (सी) एक संकुचन क्षणिक का उदाहरण जिसमें एक आंदोलन कलाकृति है (हरे तीर देखें)। आंदोलन कलाकृतियां तब होती हैं जब संकुचन के दौरान मांसपेशी फाइबर फोकस से बाहर चला जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: 2 डी बनाम 3 डी स्थितियों और विभिन्न हाइड्रोगेल की तुलना करते समय प्रकाशिकी-आधारित उच्च-थ्रूपुट सिकुड़ा हुआ सिस्टम का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि डेटा। (ए) 30 मापों के आधार पर 2 डी संस्कृति और 3 डी संस्कृति में डेटा विश्लेषण कार्यक्रम द्वारा पाए गए स्वीकृत और अस्वीकृत संकुचन माप का प्रतिशत। (बी) 24 घंटे की संस्कृति के बाद तीन चूहों से अलग किए गए 2 डी-सुसंस्कृत और 3 डी-सुसंस्कृत मांसपेशी फाइबर में अधिकतम संकुचन गति की तुलना। (सी) 24 घंटे की संस्कृति के बाद तीन चूहों से अलग किए गए 2 डी-सुसंस्कृत और 3 डी-सुसंस्कृत मांसपेशी फाइबर में सरकोमेरे शॉर्टनिंग की तुलना। (डी) कल्चर के 24 घंटे के बाद तीन चूहों से अलग शुद्ध तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (मैट्रीगेल) -एम्बेडेड और फाइब्रिन हाइड्रोगेल-एम्बेडेड मांसपेशी फाइबर की अधिकतम संकुचन गति की तुलना। (ई) 24 घंटे की संस्कृति के बाद तीन चूहों से अलग शुद्ध तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (मैट्रीगेल) -एम्बेडेड और फाइब्रिन हाइड्रोगेल-एम्बेडेड मांसपेशी फाइबर के सार्कोमेरे शॉर्टनिंग की तुलना। डेटा का विश्लेषण एक छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके किया गया था और इसे एसडी ± माध्य के रूप में दिखाया गया है। प्रत्येक डेटा बिंदु एक मांसपेशी फाइबर है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: मांसपेशियों को विच्छेदित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विच्छेदन माध्यम की संरचना, पृथक मांसपेशी तंतुओं को कल्चर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले फाइब्रिन कल्चर माध्यम और पृथक मांसपेशियों को एंजाइमेटिक रूप से पचाने के लिए उपयोग किए जाने वाले मांसपेशी पाचन माध्यम। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: हाइड्रोगेल को कास्ट करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सेल मिश्रण की संरचना और हाइड्रोगेल को डालने के लिए उपयोग किए जाने वाले मैट्रिक्स मिश्रण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

यहां, हम 3 डी संस्कृति प्रारूप में एफडीबी मांसपेशी फाइबर के एंजाइमेटिक अलगाव और संस्कृति को करने के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं, इसके बाद प्रकाशिकी-आधारित सिकुड़ा हुआ माप प्रणाली का उपयोग करके सिकुड़ा हुआ माप करते हैं। इस प्रोटोकॉल के कई फायदे हैं, जिनमें 1) एक ही मांसपेशी से कई बरकरार मांसपेशी फाइबर का सीधा-आगे और समय पर अलगाव शामिल है; 2) एक असमर्थ हाइड्रोगेल मैट्रिक्स में मांसपेशी फाइबर का एम्बेडिंग; 3) प्रकाशिकी-आधारित प्रणाली का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट अनुबंध माप का प्रदर्शन; और 4) एक हस्तक्षेप के बाद एक ही मांसपेशी फाइबर के बार-बार माप करने की क्षमता। एकल जीवित मांसपेशी फाइबर का अलगाव परिपक्व मांसपेशी कोशिकाएं प्रदान करता है जो उनके सिकुड़ा हुआ कार्य को बनाए रखते हैं। चूंकि माउस एफडीबी से प्राप्त मांसपेशी फाइबर अपेक्षाकृत छोटे होते हैं, इसलिए वे अलगाव के दौरान आसानी से हेरफेर होते हैं और अपने सीधे आकार को बनाए रखते हैं, जिससे डाउनस्ट्रीम सिकुड़ा हुआ माप की अनुमति मिलती है। यद्यपि प्रणाली मुख्य रूप से कार्डियोमायोसाइट्स संकुचन का अध्ययन करने के लिए विकसित की गई थी, कंकाल की मांसपेशी फाइबर में आसानी से अलग होने वाले सार्कोमेरे पैटर्निंग के साथ एक ही सिकुड़ा हुआ मशीनरी होता है और इस प्रकार,इस प्रणाली का उपयोग करके भी मापा जा सकता है। लाइव एक्स विवो मांसपेशी फाइबर संस्कृति के साथ एकल-कोशिका संकुचन शील माप का युग्मन विद्युत सक्रियण के जवाब में परिपक्व मांसपेशी फाइबर स्वास्थ्य और कार्य का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

विघटित मांसपेशी फाइबर का उपयोग करने की एक सीमा तंतुओं पर लागू बाहरी बलों (यानी, निष्क्रिय खिंचाव) की कमी है, जिसके परिणामस्वरूप विवो में पाए जाने वाले लोगों की तुलना में कम आराम करने वाले सार्कोमेरे की लंबाई कम होती है। यद्यपि 2.4-2.5 μm की एक सरकोमेरे लंबाई इष्टतम बल उत्पादन सुनिश्चित करती है, आराम करने वाली सरकोमेरे लंबाई33 में बहुत भिन्न हो सकती है। जबकि एफडीबी की विवो रेस्टिंग सरकोमेरे लंबाई का अभी तक वर्णन नहीं किया गया है, हमारे अपने अप्रकाशित डेटा 2.2 μm की औसत लंबाई का सुझाव देते हैं। वर्तमान परिणाम संस्कृति में 24 घंटे के बाद अनलोडेड एफडीबी फाइबर में ~ 1.95 μm की औसत आराम करने वाली सरकोमेरे लंबाई दिखाते हैं (चित्रा 3)। यद्यपि इस कम आराम करने वाले सरकोमेरे लंबाई के परिणामस्वरूप कम बल उत्पादन होगा, ~ 1.95 μm की लंबाई अभी भी अधिकतम बल34 का >90% उत्पादन करना चाहिए। जैसे, ये सार्कोमेरे लंबाई विभिन्न आनुवंशिक मॉडल या दवा उपचार के बाद फाइबर फ़ंक्शन में अंतर निर्धारित करने के लिए पर्याप्त होनी चाहिए। इसके अतिरिक्त, एक हाइड्रोगेल में फाइबर का एम्बेडिंग फ्री-फ्लोटिंग 2 डी सुसंस्कृत फाइबर की तुलना में आसंजन के लिए कई अतिरिक्त बिंदु प्रदान करता है, जो समय के साथ और अधिक सार्कोमेरे शॉर्टनिंग को सीमित करेगा।

इस मांसपेशी फाइबर अलगाव प्रोटोकॉल का एक लाभ अन्य मांसपेशियों की तुलना में अपेक्षाकृत छोटे मांसपेशी फाइबर से युक्त आसानी से विच्छेदित फास्ट-ट्विच मांसपेशी का उपयोग है, जैसे कि एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल)। उनका छोटा आकार मांसपेशियों के अलगाव को ट्राइट्यूरेशन आधारित-पृथक्करण के लिए अधिक उपयुक्त बनाता है, जिससे मांसपेशियों के तंतुओं को पिपेट- या टैंगल-प्रेरित क्षति की संभावना कम हो जाती है। एफडीबी मांसपेशियों के बाह्य मैट्रिक्स को आसानी से कोलेजनेज के साथ एंजाइमेटिक रूप से पचाया जा सकता है, जिससे थोड़े समय में सैकड़ों मांसपेशी फाइबर के अलगाव की अनुमति मिलती है। हालांकि, ओवरडाइजेशन से मांसपेशियों के तंतुओं को नुकसान हो सकता है। मांसपेशियों के तंतुओं के अतिपाचन को पहचाना जा सकता है जब मांसपेशियों को घुमाते समय मांसपेशी लगभग तुरंत अलग हो जाती है या जब सेल सीडिंग प्रक्रिया के दौरान सेल की मात्रा का एक बड़ा हिस्सा हाइपरकॉन्ट्रैक्ट हो जाता है। मांसपेशियों के अतिपाचन को रोकने के लिए, पाचन समय को प्रत्येक कोलेजनेस बैच के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। इसका परीक्षण करने के लिए, दो एफडीबी मांसपेशियों को उनके बीच 5 मिनट के क्रमबद्ध पाचन समय के साथ समानांतर में पचाया जाना चाहिए। व्यवहार्य मांसपेशी फाइबर की उच्चतम उपज के साथ पाचन समय चुना जाना चाहिए। इस अनुकूलन को फिर दूसरी बार किया जाना चाहिए, फिर से पाचन समय में 5 मिनट के पृथक्करण के साथ। उच्चतम व्यवहार्य मांसपेशी फाइबर देने वाले पाचन समय का उपयोग कोलेजनेस के वर्तमान बैच के लिए इष्टतम पाचन समय के रूप में किया जाना चाहिए। कोलेजनेस के बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता को सीमित करने का एक और तरीका स्टॉक समाधान के प्रति मिलीलीटर गतिविधि इकाइयों की सीधे गणना करना होगा और फिर बाद के कोलेजनेस बैचों को उसी मात्रा में पुनर्गठित करना होगा। अंत में, पाचन समय को विभिन्न माउस उपभेदों में अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है, उदाहरण के लिए, यदि वृद्ध या रोगग्रस्त जानवरों का अध्ययन किया जाता है जो बढ़े हुए बाह्य मैट्रिक्स जमाव35,36 का प्रदर्शन करते हैं।

व्यवहार्य पृथक मांसपेशी फाइबर को पाइप करने की संभावना विभिन्न संस्कृति स्थितियों में एफडीबी मांसपेशी फाइबर को कल्चर करने की संभावनाएं खोलती है। ऐसा ही एक विकल्प देशी ऊतक संस्कृति पर्यावरण की नकल करने के लिए हाइड्रोगेल में इन तंतुओं का संवर्धन है। यह एम्बेडिंग प्रोटोकॉल यह सुनिश्चित करता है कि सिकुड़ा हुआ माप के दौरान फाइबर जगह में रहें और फाइबर को जेल सेट से पहले प्लेट के नीचे तक बसने की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया है। हालांकि, थ्रोम्बिन और फाइब्रिनोजेन स्टॉक में अंतर को समायोजित करने के लिए इस प्रोटोकॉल को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। यदि थ्रोम्बिन गतिविधि बहुत अधिक है, तो जेल समय से पहले सेट हो जाएगा, और फाइबर माइक्रोस्कोप के फोकल प्लेन के बाहर उच्च स्थानों पर निलंबित रह सकते हैं। यदि ऐसा होता है, तो थ्रोम्बिन: फाइब्रिनोजेन अनुपात को समायोजित करने की आवश्यकता होती है। यह तेजी से कम थ्रोम्बिन सांद्रता में फाइबर चढ़ाकर परीक्षण किया जा सकता है और इस बात पर ध्यान दिया जा सकता है कि पोलीमराइजेशन में कितना समय लगता है। आमतौर पर, यह 30 मिनट से अधिक तेजी से नहीं होना चाहिए। हालांकि, थ्रोम्बिन एकाग्रता होने से जो बहुत कम है, पोलीमराइजेशन प्रक्रिया को भी खराब कर सकता है। फाइबर सही फोकल प्लेन में हैं, यह सुनिश्चित करने का एक और तरीका यह है कि पहले उन्हें 2 डी प्रोटोकॉल का उपयोग करके बीज दिया जाए और फिर कल्चर प्लेट का पालन करने के बाद फाइबर पर हाइड्रोगेल की एक परत जोड़ दी जाए। हालांकि, किसी को पता होना चाहिए कि फाइबर से माध्यम को हटाने से हाइपरकॉन्ट्रेक्शन हो सकता है, क्योंकि वे सूखने के प्रति संवेदनशील होते हैं। यह भी स्पष्ट नहीं है कि हाइड्रोगेल पूरी तरह से कल्चर प्लेट से जुड़ जाएगा, और यह अधिक आसानी से ढीला हो सकता है। इसलिए, यह एम्बेडिंग प्रक्रिया फाइबर को व्यवहार्य रखने और संकुचन माप के लिए बेहतर है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग परिपक्व मांसपेशी फाइबर एक्स विवो की सिकुड़ा हुआ गतिशीलता का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है और स्वस्थ चूहों और मांसपेशियों के रोगों के लिए आनुवंशिक उत्परिवर्तन वाले दोनों पर लागू किया जा सकता है। इसी तरह, यह परीक्षण करने में सक्षम बनाता है कि संस्कृति की स्थिति या यौगिकों के अलावा मांसपेशी फाइबर फ़ंक्शन को कैसे प्रभावित करते हैं। प्रकाशिकी-आधारित प्रणाली का उपयोग करके प्राप्त संकुचनशील डेटा जीवित एकल मांसपेशी फाइबर की सिकुड़ा हुआ क्षमता का संकेत देता है, और इस क्षमता में परिवर्तन को फाइबर स्वास्थ्य से सहसंबद्ध किया जा सकता है। ये डेटा अकेले, हालांकि, यह निर्धारित करने के लिए पर्याप्त नहीं हैं कि क्या ये परिवर्तन मांसपेशियों के संकुचन के एक्टिन-मायोसिन क्रॉस-ब्रिजिंग या कैल्शियम रिलीज चरणों में होते हैं। यद्यपि हम इस प्रोटोकॉल में कैल्शियम सिग्नलिंग को मापने के तरीकों का वर्णन नहीं करते हैं, यह सेटअप मांसपेशियों की कोशिकाओं को अनुबंधित करने में फ्यूरा-आधारित कैल्शियम क्षणिकताको मापने में भी सक्षम है। इस प्रणाली का एक दोष यह है कि एफडीबी मांसपेशियों में केवल तेज-ट्विच प्रकार आईआईए / आईआईएक्स मांसपेशी फाइबर होते हैं, और इस आकार के धीमी-ट्विच टाइप 1 फाइबर वाली मांसपेशियों को अभी तकवर्णित नहीं किया गया है। यह इस विधि का उपयोग करके फाइबर प्रकार-विशिष्ट कामकाज का अध्ययन करने की क्षमता को समाप्त करता है। यहां हम जिस प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करते हैं, उसे संभावित रूप से अन्य मांसपेशियों जैसे ईडीएल या तलवों के लिए फाइबर प्रकार के मतभेदों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उनके बड़े आकार के कारण, इस प्रोटोकॉल को इन मांसपेशियों के लिए और अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। गुरुत्वाकर्षण अवसादन चरण के दौरान लंबे फाइबर उलझ जाते हैं और पाइपिंग द्वारा हेरफेर किए जाने पर टूट जाएंगे, जिससे कम उपज होगी। पाइपिंग के साथ उनकी असंगति के कारण, लंबे फाइबर, इसलिए, जेल-एम्बेडिंग तकनीक के साथ भी कम संगत हैं। इन तंतुओं के माप अभी भी 2 डी संस्कृति प्रारूप में किए जा सकते हैं, लेकिन फाइबर अपने आकार के कारण संकुचन के दौरान अधिक घूम सकते हैं, इस प्रकार सिग्नल-टू-शोर अनुपात को प्रभावित कर सकते हैं। इस प्रणाली की एक और सीमा सिकुड़ा हुआ माप के साथ बल माप करने में असमर्थता है, जैसे कि वे बल माप जिन्हें अन्य बरकरार मांसपेशी फाइबर तैयारी28 का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, मांसपेशी फाइबर द्वारा उत्पन्न बल का अनुमान लगाकर इस सीमा को दरकिनार किया जा सकता है। मांसपेशियों के तंतुओं के उत्पन्न बल का अनुमान लगाया जा सकता है यदि अनुबंधित और शिथिल अवस्थाओं के दौरान मांसपेशी फाइबर आकार के साथ-साथ मैट्रिक्स के यंग के मापांकको 25 जाना जाता है। बहरहाल, यह ऑप्टिक-आधारित प्रणाली मांसपेशियों के सिकुड़ा हुआ कार्य का अध्ययन करने के लिए एक आसान-से-उपयोग, उच्च-थ्रूपुट दृष्टिकोण प्रदान करती है और आनुवंशिक मांसपेशी रोगों और चिकित्सीय हस्तक्षेपों का अध्ययन करने के लिए नई संभावनाओं की एक श्रृंखला खोलती है।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में मदद करने में उनकी तकनीकी विशेषज्ञता के लिए सिल्विया बोगार्ड्स, सना लुइजक्स, वैलेंटाइन जेनसन, मिचिएल हेल्म्स और एमी मैंडर्स को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को मस्कुलर डिस्ट्रॉफी एसोसिएशन (टीजेके MDA603238 विकास पुरस्कार), डच कार्डियोवैस्कुलर एलायंस (टीजेके को प्रतिभा अनुदान), और राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (एनएचएमआरसी, ऑस्ट्रेलिया) के पुरस्कारों द्वारा समर्थित किया गया था; फैलोशिप APP1121651 एम.वाई.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aprotinin, from Bovine Lung Thermo Scientific AAJ63039MC 100 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C.  Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Collagenase type 2 Worthington 77336 10% (w/v) stock solution can be stored at -20 °C. Weighing collagenase should be done in a safety cabinet as inhalation is dangerous.
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fibrinogen from Bovine Plasma Sigma Aldrich 50-176-5054 20 mg/mL stock solution in PBS can be stored at -80 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher A1413201 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C.
Gibco MEM High glucose + pyruvate Thermo Fisher 11095080
Horse serum Thermo Fisher H1270
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning CB-40230 4 mg/mL stock solution is prepared in MEM and stored at -20 °C.
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich P4333
Serum Replacement 2 (50x) Sigma Aldrich S9388
Thrombin, Bovine Plasma Thermo Scientific AAJ63383EXP 125 U/mL stock in PBS can be stored at -20 °C. Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Tranexamic Acid Thermo Scientific AC228042500 80 mM stock solution in PBS can be stored at -20 °C.  Sterilize stock solution using a 0.22 µm filter.
Equipment
24-well electrical stimulator IonOptix N/a
Dumont #55 Forceps Fine Science Tools 11295-51
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
MultiCell Cytocypher IonOptix N/a
MyoCam-S3 IonOptix N/a
MyoPacer IonOptix N/a
SYLGARD 184 silicone elastomer, Base & Curing Agent  Dow corning  N/a
Vannas Spring Scissor - 25 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15002-08
Software
CytoSolver IonOptix N/a
IonWizard IonOptix N/a

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References

  1. Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connective Tissue Research. 61 (3-4), 248-261 (2020).
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Vonk, L. A., Esen, O., Yuen, M., Kirby, T. J. High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System. J. Vis. Exp. (195), e65103, doi:10.3791/65103 (2023).

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