Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em meios sólidos

Para medir a expectativa de vida em C. Elgan, uma população sincronizada com idades é gerada usando um lang de ovo cronometrado de forma reprodutiva. Vermes hermafroditas adultos ativos são transferidos para placas de meio de crescimento nematoides semeadas com E. coli morta por UV, deixados para depositar ovos por seis a oito horas e, em seguida, removidos nos dois dias seguintes; os vermes eclodem desses ovos e crescem até o estágio larval L 4. Os L quatro vermes são transferidos para novas placas NGM contendo ampicilina para prevenir contaminação bacteriana viva e FUDR para evitar a reprodução, sendo permitidos para se desenvolver em adultos.

A partir desse ponto, os vermes adultos são observados a cada dois a três dias até que todos morram. A cada ponto temporal, minhocas mortas são removidas da placa e o número de vermes vivos e mortos é registrado. Sou George Seton, do laboratório de Matt Capline, do Departamento de Patologia da Universidade de Washington.

Hoje vamos mostrar como medir a expectativa de vida e ver nossa elegância diante da hepatite. Usamos esse procedimento em nosso laboratório para estudar a genética do envelhecimento. Então vamos começar.

Um experimento básico de vida útil requer dois tipos de placas: placas NGM padrão, que não contêm aditivos, e placas AMP FUDR, que contêm tanto ampicilina quanto fluoro-desoxidina adicionadas à NGM. Ambos os tipos de placas são fixadas com bactérias E. coli OP 50, que são posteriormente eliminadas pela exposição aos raios UV. Comece preparando 10 mililitros de solução NGM.

Por placa de Petri de 60 milímetros, derrete completamente o NGM sólido ao micro-ondas em alta em pulsos 32. Faça um redemoinho entre os pulsos para evitar o acúmulo de bolhas de gás pressurizado, coloque o NGM líquido em um banho-maria a 55 graus Celsius ou na bancada para permitir que o meio esfrie. Depois que o substrato esfriar para 55 graus Celsius, momento em que você deve conseguir segurar confortavelmente o recipiente de vidro com as mãos nuas, ele está pronto para receber a adição de medicamentos.

E para despejar os pratos com medicamentos, adicione 33 microlitros de FUDR de 150 milimolares e 100 microlitros de 100 miligramas por mililitro. Ampicilina por 100 mililitros NGM e redemoinho para misturar ampicilina é usada para evitar contaminação bacteriana estranha e FUDR para evitar a eclosão dos ovos. Portanto, as minhocas não precisarão ser transferidas a cada poucos dias para separá-las das larvas em crescimento.

Agora despeje o substrato e deixe as placas secarem na bancada por dois dias no dia anterior à secagem da cultura LB líquida da semente com uma única colônia de uma faixa fresca de E. coli. OP 50 bactérias no salim LB. Prepare pelo menos 0,5 mililitro de cultura por placa de 60 milímetros.

Coloque a cultura OP 50 em um shaker a 37 graus Celsius e deixe as bactérias crescerem durante a noite. No dia seguinte, faça pellets na bactéria OP 50 com 3.500 g de força centrífuga por 10 minutos. Decante o suficiente do supernadante para ressuspender a bactéria em uma concentração de 10 vezes.

Agora inocule cada placa com 100 microlitros da cultura concentrada. Evite tocar a ponta da pipeta na superfície do NGM, pois falhas na superfície do meio permitirão que as minhocas escavem as placas do redemoinho até que as bactérias cubram a área central da NMN sem se aproximar das paredes das placas, deixando as placas secar na bancada por 24 horas. Quando seca, expõe a superfície das placas a uma dose de UV forte o suficiente para impedir o crescimento bacteriano; usamos um gene de estrato UV straddle linker 2, 400.

Comece carregando as placas no straddle linker sem as tampas. Agora pressione energia. Digite 9 9 9 9 no teclado e pressione start.

As placas serão expostas à luz UV por aproximadamente cinco minutos. Placas com bactérias mortas pelo UV podem ser armazenadas de cabeça para baixo a quatro graus Celsius por até um mês. Esta seção descreve como gerar uma população de minhocas com data comum de eclosão.

Comece transferindo aproximadamente 20 vermes jovens adultos para uma nova placa NGM sem medicamentos. Deixe o prato a 25 graus Celsius por aproximadamente uma semana para permitir que os vermes se propaguem e consumam todo o alimento bacteriano em uma semana. Vermes recém-eclodidos no estágio de dote com crescimento interrompido devem aparecer, transferidos de 20 a 30 larvas para uma placa NGM fresca sem medicamentos e incubá-las a 25 graus Celsius na presença de alimento.

As larvas do dote se tornam adultos reprodutivamente ativos em dois dias e permanecem reprodutivamente ativos por alguns dias depois. Agora transfira de 10 a 15 adultos reprodutivamente ativos para uma nova placa NGM sem medicamentos. Essa placa é chamada de placa de postura cronometrada ou placa TEL.

Deixe a placa TEL a 25 graus Celsius para que as minhocas possam botar ovos. Os animais que nascerem desses ovos serão os experimentais e terão sua expectativa de vida marcada após seis horas. Inspecione a placa TEL para ver se há ovos.

Se ainda não houver ovos suficientes, deixe a placa TEL a 25 graus Celsius por até 24 horas no total. Checando periodicamente se há ovos. Quando um número suficiente de ovos tiver sido posto, retire-se os adultos da placa TEL.

Um experimento típico de longevidade exigirá de 30 a 90 ovos por grupo experimental, mas várias centenas de ovos podem ser gerados em uma única placa TEL. Aproximadamente 150 ovos serão postos por 10 a 15 adultos reprodutivamente ativos em seis a oito horas. Ao comparar grupos experimentais, é possível alcançar significância estatística para grandes diferenças de expectativa de vida com apenas 30 animais.

Mais animais devem ser usados para distinguir diferenças mais modestas. Agora coloque a placa TEL sem adultos a 20 graus Celsius até que os ovos eclodam e as minhocas tenham se desenvolvido para o estágio larval L 4. Isso geralmente leva dois dias para elegância tipo C selvagem, mas pode levar mais tempo para cepas com fenótipos de desenvolvimento lento.

Esta seção descreve como acompanhar a vida de uma população sincronizada com idades. Primeiro, transfira a larva L quatro da placa TEL para placas AMP FUDR assentadas. Para cada cepa ou condição testada, é comum montar duas a três placas com 25 a 30 minhocas por placa.

Incube as placas AMP FUDR a 20 graus Celsius por 24 horas. E então avalie visualmente os vermes, o meio e as bactérias transferem vermes para placas frescas de AMP FUDR. Se as minhocas já comeram a maior parte do alimento bacteriano, isso normalmente ocorre uma ou duas vezes por semana.

No início do experimento, se um número significativo de larvas estiver presente, isso geralmente indica que os vermes foram transferidos para as placas AMP FUDR como jovens adultos, em vez de como L fours. Jovens adultos podem botar ovos antes que a FUDR faça efeito, e ocasionalmente as larvas escapam dos efeitos da FUDR e crescem até se tornarem adultas. Essas larvas vão confundir o experimento nessa situação, transferir os vermes adultos para placas frescas e descartar as placas antigas que contêm as larvas.

Minhocas também devem ser transferidas para placas frescas se bactérias vivas e crescendo forem observadas. Geralmente, a combinação de AMP e UV elimina o experimento para que nenhuma bactéria viva contamine o experimento, mas ocasionalmente isso acontece. Além disso, transfira as minhocas.

Se o crescimento fúngico for observado no meio. Se for detectado cedo o suficiente, o fungo pode ser removido usando a ponta de uma pipeta ou espátula. Quando cresce e fica maior que alguns milímetros de diâmetro, geralmente é mais fácil transferir as minhocas para uma nova placa.

Marque todos os vermes quanto à longevidade a cada dois a três dias. Usando um endoscópio de dissecação. Determine se cada verme está vivo ou morto.

Bata suavemente no prato. A minhoca está viva se se mover em resposta ao bater no rosto. Se o verme não responder ao bater na placa, dê um zoom na região da cabeça, toque suavemente a cabeça do verme com uma palheta-transferência platina.

Marque o verme como morto. Se não responder movendo a cabeça, remova o verme morto da placa. Depois de checar todos os vermes, registre a data e o número de vermes vivos e mortos.

Minhocas mantidas em meio sólido ocasionalmente escapam da superfície da placa cavando ou subindo pela parede. Vermes que fogem são completamente omitidos do estudo. Quando terminar, retorne as placas à incubadora a 20 graus Celsius.

Espere mais dois a três dias e depois verifique as placas novamente. Continue esse regime até que todos os vermes morram. O número de minhocas que morrem a cada dia é tipicamente invertido para calcular a proporção de minhocas vivas em cada dia; esses dados são graficamente representados como uma curva de sobrevivência considerando o dia da postura cronometrada.

Dia zero. A expectativa média típica de vida para N dois. A cepa selvagem do tipo Sea elgan mantida com bactérias que matam UV a 20 graus Celsius é aproximadamente 25 dias, conforme medida a partir do ovo.

Acabamos de mostrar como medir a longevidade e ver elegância. Você pode modificar esse procedimento básico para testar uma variedade de condições ambientais, incluindo restrição alimentar e interferência de RNA, que é discutido no texto de apoio. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.