C. elegans Dissection de blastomères : procédé d’extraction de la coquille d’œuf et de dissociation de cellules embryonnaires

- Pour cette dissection, utilisez deux micropipettes : l’une avec une ouverture à peu près de la même largeur qu’un œuf et l’autre deux fois plus large, et une série de solutions organisées en puits pour faciliter un transfert rapide entre elles.

Tout d’abord, placez les hermaphrodites adultes dans une solution de sel d’œuf, qui est osmotiquement équilibrée pour empêcher les embryons d’éclater. Coupez les vers en deux pour libérer les embryons en développement.

Ensuite, identifiez les embryons au stade de deux cellules. Ces cellules sont les blastomères formés par la division de l’ovule fécondé. Utilisez la micropipette avec la plus grande ouverture pour transférer un embryon dans une solution d’hypochlorite, de l’eau de Javel, qui commencera à décomposer la coquille protectrice de l’œuf.

Après seulement 40 à 55 secondes, transférez l’embryon dans le milieu de croissance de Shelton, ou SGM. Lavez brièvement chaque embryon dans deux puits de SGM pour éliminer toute trace d’eau de Javel avant de les placer dans un troisième puits.

Maintenant, utilisez la micropipette plus petite pour pipeter à plusieurs reprises l’embryon en fournissant la force mécanique pour retirer la coquille de l’œuf et exposer les blastomères. Continuez doucement à pipeter l’embryon pour séparer les cellules individuelles des blastomères. Dans le protocole suivant, nous verrons cette technique en action.

- Tenez chaque extrémité d’un microcapillaire à une capacité de 10 microlitres avec la main droite et la main gauche. Tirez le microcapillaire vers les deux extrémités pour appliquer une tension et amenez le centre du capillaire au-dessus d’un brûleur pour former deux capillaires tirés à la main.

Sous le microscope de dissection, coupez les extrémités des capillaires tirés à la main avec une pince. Faites en sorte que les deux ouvertures d’extrémité aient environ deux fois et une fois la longueur de l’axe court des embryons de C. elegans pour le transfert d’embryons et l’enlèvement de la coquille d’œuf, respectivement.

Fixez le capillaire tiré dans un appareil de pipetage buccal. Pipeter 45 microlitres de solution saline d’œuf sur un puits d’une lame multi-puits.

Placez 5 à 10 C. elegans adultes sur le puits. Pour obtenir des embryons précoces de C. elegans, coupez les adultes en morceaux en positionnant deux aiguilles à droite et à gauche du corps de C. elegans et en faisant glisser les aiguilles l’une à côté de l’autre.

Pipette 45 microlitres de solution d’hypochlorite dans un puits à côté du puits contenant la solution de sel d’œuf, et pipette 45 microlitres de milieu de croissance de Shelton dans les trois puits suivants. Transférez les embryons au stade unicellulaire et au stade précoce à deux cellules dans la solution d’hypochorite à l’aide d’une pipette buccale avec une ouverture de plus grande taille et attendez 40 à 55 secondes.

Lavez les embryons en les transférant dans les trois puits suivants avec le milieu de croissance de Shelton avec 1 à 2 secondes dans chacun des deux premiers puits. À l’aide du capillaire dessiné à la main avec une ouverture de plus petite taille, répétez soigneusement le pipetage de l’embryon pour l’élimination de la coquille de l’œuf.

Après cela, pipetez en continu avec le capillaire dessiné à la main pour séparer les blastomères embryonnaires au stade bicellulaire.

- Après l’enlèvement de la coquille de l’œuf, minimisez la force de pipetage des embryons de haut en bas pour éviter l’éclatement.