Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Start de procedure door een verdoofde volwassen vis op een stapel absorberend papier te plaatsen. Gebruik nu een steriel scheermesje om de staartvin te snijden en breng de vis snel over naar een tank met vers water voor herstel. Breng de staartklem over naar een schone buis met een lysisbuffer. De lysisbuffer bevat niet-ionische detergenten, die het plasmamembraan en het nucleaire membraan van een cel solubiliseren. De buffer bevat ook een enzym genaamd proteïnase K dat eiwitten afbreekt en de afgifte mogelijk maakt. spijsvertering.
Laat nu de buizen met staartclips 's nachts in een incubator om het weefsel bij 55 graden Celsius volledig af te breken met continue rotatie. Verwarm vervolgens de buis gedurende 15 minuten op 95 graden Celsius om proteïnase K te inactiveren. Centrifugeer de buis om onverteerd materiaal te pelleteren en breng het supernatant met DNA over naar een andere buis. Voeg alcohol toe om het DNA te precipitaten en centrifugeer opnieuw om het DNA in een pellet te verzamelen.
- Voeg op de dag van het DNA-preparaat verse proteïnase K toe aan de lysisbuffer bij een concentratie van 1 milligram per milliliter. Weefsel kan worden verzameld bij een volwassen vis met behulp van een vinklem of bij een embryonale vis.
Verdoof eerst de vis in tricaine-oplossing. Wacht tot de kieuw langzaam gaat. Leg de vis vervolgens op een stapel tissues en snijd met een steriel scheermesje een klein stukje van de staartvin van ongeveer 2 tot 3 millimeter lang af. Plaats de vis snel in een gelabelde tank met vers water voor herstel.
Pak de vinklem op met een steriele pipetpunt en breng deze over in een buis gevuld met honderd microliters DNA-lysisbuffer. Zorg ervoor dat u zowel de tank van het dier als de buis labelt. Incubeer alle verzamelde weefsels gedurende ten minste vier uur en tot 's nachts bij 55 graden Celsius.
Na de incubatie, inactiveren van de proteïnase K door het verwarmen van de buizen op 95 graden Celsius gedurende 15 minuten. Deze monsters moeten onmiddellijk worden gebruikt voor PCR, maar kunnen ook worden bewaard bij min 20 graden Celsius voor maximaal drie maanden.
