Évaluation des interactions bactéries-cellules hôtes à l’aide de billes biomimétiques

Prenez une plaque multi-puits contenant une culture de cellules épithéliales de mammifères.

Dans les puits d’essai, ajoutez un agent pathogène bactérien ainsi que des billes de polymère couplées à des protéines de surface bactériennes.

Dans les puits témoins, ajoutez l’agent pathogène et les billes dépourvues de protéines bactériennes de surface. Couver.

Dans les puits d’essai, les billes imitent la surface bactérienne et rivalisent avec l’agent pathogène pour se lier à l’acide phosphatidique de la membrane cellulaire épithéliale, réduisant ainsi l’attachement bactérien.

Dans les puits de contrôle, les billes n’affectent pas la fixation bactérienne.

Retirez le support et lavez-le avec un tampon pour éliminer les composants non liés.

Incuber avec un détergent non ionique pour lyser les cellules, libérant ainsi les bactéries et les billes attachées à la membrane.

Pipeter le lysat pour créer une suspension homogène et diluer l’homogénat en série à l’aide d’un tampon.

Transférez les dilutions sur des plaques de gélose, incubez pour permettre la formation des colonies et comptez les colonies.

La plaque d’essai présente moins de colonies que les témoins, ce qui indique une réduction des interactions bactéries-hôte.

Préparez le milieu infectieux en diluant les cultures bactériennes dans du DMEM incolore sans additifs.

Préchauffé à 37 degrés Celsius contenant 10 % de suspension de billes volume à volume. Pour obtenir un MOI de 10, préparez un millilitre par puits et 10 à 20 % de volume excédentaire par échantillon. Retirez l’ancien milieu des puits et lavez les cellules HeLa cultivées en ajoutant à chaque puits un millilitre de PBS stérile préchauffé à 37 degrés Celsius. Retirez le PBS et ajoutez un millilitre de milieu d’infection par puits. Ajouter des solutions contenant des billes de contrôle et des bactéries comme témoins positifs et des billes d’adhérence et aucune bactérie comme témoins négatifs.

Ajouter du DMEM contenant 0,1 % de Triton X 100 comme témoins de lyse.

Incuber la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius pendant la durée souhaitée.

Les mesures de l’adhérence bactérienne sont effectuées une heure après l’infection. Retirez le milieu de la couche cellulaire et lavez-la soigneusement avec du PBS stérile préchauffé pour éliminer toutes les cellules non attachées. Lavez au moins trois à quatre fois avec un millilitre de PBS à chaque fois. Lyser les cellules hôtes en ajoutant à chaque puits un millilitre d’une solution stérile de Triton X 100 1 % volume à volume dans du PBS. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Pipetez chaque échantillon de haut en bas plusieurs fois avant de transférer le contenu de chaque puits dans des tubes séparés de 1,5 millilitre. Préparer des dilutions en série de dix fois les échantillons dans du PBS stérile. Plaquez 100 microlitres de chaque échantillon sur de la gélose marine LB et épandez-les à l’aide d’un épandeur de cellules. Optimisez la dilution à mettre en plaque en fonction des souches bactériennes et du point temporel.

Pour ce dispositif expérimental, une dilution de 10 à la quinte ou de 10 à la sixième fois donnera un nombre approprié d’UFC. Incuber les assiettes à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, dénombrez les bactéries en comptant les colonies.