Détection des agents pathogènes des poissons à l’aide de l’analyse par répétition en tandem à nombre variable (VNTR)

Commencez par une plaque PCR contenant une solution dénaturante à base de formamide.

Ajoutez les amplicons PCR dilués dérivés d’une bactérie pathogène des poissons dans chaque puits.

Ces amplicons contiennent des répétitions en tandem à nombre variable (VNTR) marquées par fluorescent, des séquences courtes et répétitives utilisées comme marqueurs génétiques pour l’identification bactérienne.

Scellez la plaque et la centrifugeuse pour éliminer les bulles d’air.

Chauffez la plaque dans un cycleur thermique pour dénaturer les VNTR à double brin.

La formamide améliore la séparation des brins et inhibe le re-recuit.

Refroidissez rapidement la plaque pour stabiliser l’ADN simple brin.

Centrifugeuse pour collecter le volume de l’échantillon.

Retirez le joint et fixez la plaque avec un cadre.

Placez le tube capillaire et effectuez l’électrophorèse capillaire.

Lors de l’électrophorèse, les fragments de VNTR migrent à travers le capillaire sous un champ électrique et se séparent par taille.

Un laser excite les balises fluorescentes sur chaque fragment, produisant des signaux codés par couleur.

L’électrophérogramme résultant montre des schémas de pic VNTR correspondant à la bactérie pathogène.

Après confirmation des amplicons PCR, utilisez de nouvelles bandes ou plaques PCR pour diluer les produits PCR de 1 à 10 dans de l’eau purifiée. Vortex et centrifugeuse brièvement. Pendant le travail dans une armoire à fumée, préparez un mélange maître dans un tube centrifugeuse composé de formamide et d’une solution standard de taille de référence.

Selon le nombre de produits PCR à analyser, utilisez les volumes de réactifs tels que détaillés dans le manuscrit. Prévoyez un volume excédentaire de 10 %. Vortex brièvement et distribuer 9,5 microlitres dans des puits individuels sur une plaque PCR adaptée au système d’électrophorèse capillaire disponible.

Ensuite, ajoutez 0,5 microlitres de produit PCR dilué. Scellez et centrifugez brièvement. Ensuite, chargez la plaque contenant les échantillons dans un thermocycleur PCR et dénaturez les échantillons à 95 degrés Celsius pendant trois minutes avant de refroidir à 4 degrés Celsius indéfiniment.

Centrifugez à 1000 g pendant une minute, retirez soigneusement le joint, puis chargez la plaque sur un système d’électrophorèse capillaire calibré selon les instructions du fabricant. Effectuer une analyse capillaire des fragments, en utilisant des réactifs appropriés pour l’appareil de prédilection, et ajuster les conditions de fonctionnement selon la description du manuscrit.