Étude de l’excitabilité des neurones fluorescents à l’aide d’une pince à patch de cellules entières

Prenez une tranche coronaire de souris transfectée immobilisée dans une chambre d’enregistrement perfusée avec un LCR.

La tranche contient une population de neurones pyramidaux clairsemée exprimant une enzyme cible et une protéine fluorescente.

Assembler une pipette d’enregistrement composée d’une solution intracellulaire et d’une électrode reliée à un amplificateur pour la mesure des signaux neuronaux.

Identifiez au microscope la zone du tissu cible et localisez un neurone fluorescent.

Appliquez une pression positive sur la pipette pour éviter le colmatage et faites-la avancer vers le neurone cible.

La pression positive provoque une légère indentation sur la membrane neuronale au contact.

Relâchez la pression, formant un joint étanche entre la membrane et la pointe.

Réglez le potentiel de maintien à une valeur négative constante pour stabiliser le neurone.

Appliquez une brève pression négative pour rompre la membrane, en connectant le cytoplasme à l’intérieur de la pipette et en établissant une configuration de cellules entières.

Passez en mode pince de courant et appliquez des impulsions de courant positives, générant des potentiels d’action indiquant l’excitabilité neuronale.

Transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement à l’aide d’une pipette Pasteur ou d’un petit pinceau. Maintenez la tranche avec une harpe et perfusez-la avec de l’ACSF à raison de 2 millilitres par minute. Pour patcher un neurone GFP positif, localisez la zone d’intérêt au microscope à 10x. Ensuite, trouvez une cellule GFP positive à l’aide de l’objectif 60x.

Ensuite, remplissez l’électrode d’enregistrement avec une solution intracellulaire. Ensuite, placez une pipette en verre dans le porte-pipette. Ensuite, placez l’embout de la pipette dans le bain et concentrez-vous sur l’embout. Une fois la pipette dans le bain, appliquez une pression positive à travers le système de contrôle de la contre-pression.

Approchez-vous de la cellule d’intérêt sous guidage visuel tout en maintenant la contre-pression dans la pipette. À l’apparition d’une petite fossette à la surface de la cellule, relâchez la pression. À ce stade, un joint étanche avec une résistance supérieure à 1 gigaohm peut se former. Sinon, appliquez une légère pression négative pour faciliter cela.

Pendant que le joint est formé, amenez la pince de tension de maintien à moins 60 millivolts. Une fois que le joint gigaohm est formé, appliquez une impulsion d’aspiration pour rompre la membrane cellulaire et passer en mode cellule entière. Une fois qu’il est en mode cellule entière, passez du mode pince de tension au mode pince de courant et commencez l’enregistrement.