Étude de l’accumulation d’alpha-synucléine dans les neurones dopaminergiques embryonnaires primaires de souris

Prenez des cultures micro-insulaires de neurones dopaminergiques embryonnaires primaires de souris dans une plaque multipuits contenant du milieu.

Ces neurones sont prétraités avec des fibrilles préformées (PFF) - des formes mal repliées et agrégées de la protéine alpha-synucléine.

Les PFF agissent comme des graines, déclenchant un repliement et une oligomérisation supplémentaires de l’alpha-synucléine endogène, formant des fibrilles d’alpha-synucléine phosphorylées. Ces fibrilles finissent par former des corps de Lewy.

Remplacer le support par un fixateur pour préserver la morphologie cellulaire.

Lavez les cellules avec un tampon.

Introduisez un tampon contenant un détergent pour perméabiliser les membranes cellulaires.

Ajoutez une solution bloquante pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques.

Ajouter des anticorps primaires ciblant l’alpha-synucléine phosphorylée et une protéine de référence omniprésente dans les neurones dopaminergiques.

Laver pour éliminer les anticorps non liés.

Introduire des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores ciblant les anticorps primaires respectifs.

Lavez à nouveau pour éliminer les anticorps non liés.

Ajoutez un colorant de liaison à l’ADN pour colorer les noyaux.

À l’aide d’un scanner à plaques de fluorescence, quantifiez les neurones dopaminergiques contenant des agrégats d’alpha-synucléine cytoplasmique.

Ajoutez 3,75 microlitres de 100 microgrammes par millilitre de fibrilles préformées dans chaque puits expérimental, et 3,75 microlitres de PBS dans chaque puits témoin.

Lorsque vous travaillez avec des PFF, soyez prudent quant à la contamination indésirable des protéines et nettoyez ensuite le capot et tous les instruments associés aux PFF avec 1 % de SDS et 70 % d’éthanol.

Au point final expérimental approprié, après la coloration des marqueurs d’intérêt, chargez la plaque de culture à 96 puits sur un scanner à plaques à haut contenu, équipé d’un objectif 10x. Ajustez les paramètres en fonction des spécifications de la plaque à 96 puits, telles que le type de plaque, le fabricant, la taille, la distance entre les puits, ainsi que le type et le volume du fluide.

Sélectionnez la zone d’imagerie des puits pour couvrir toutes les cellules de chaque micro-îlot, et utilisez un puits pour ajuster la mise au point automatique sur l’expression DAPI. Calibrer le temps d’acquisition pour chaque canal fluorescent, en fonction de l’intensité de la coloration dans les puits de contrôle, et ajuster les paramètres de sorte que les cellules dopaminergiques dans les puits de contrôle préformés traités aux fibrilles, hébergeant les agrégats de phosphosérine 129 alpha synucléine dans le soma cellulaire, soient clairement distinguées, permettant une quantification sans ambiguïté des cellules positives et négatives de la phosphosérine alpha synucléine.

Ensuite, imagez tous les puits sélectionnés simultanément dans tous les canaux, en utilisant exactement les mêmes paramètres pour chaque puits.