Microscopie holographique à deux photons pour étudier l’activité neuronale et la connectivité dans un modèle murin

Commencez avec une souris éveillée placée sous un microscope holographique à deux photons intégré à des modulateurs de lumière spatiaux ou SLM.

La souris tient une plaque de tête pré-implantée.

Dans le cerveau de la souris, les neurones expriment des canaux sensibles à la lumière rouge et des indicateurs de calcium fluorescents verts qui se lient aux ions calcium.

Pour étudier l’activité neuronale et la connectivité, définissez les paramètres d’imagerie.

Utilisez un laser de 920 nanomètres pour exciter les indicateurs liés au calcium dans les neurones. Capturez l’image de fluorescence du neurone avec un minimum de photodommages.

Réinitialisez les paramètres d’imagerie et faites la mise au point d’un faisceau laser proche infrarouge.

Les SLM façonnent le faisceau laser en motifs holographiques précis qui permettent une focalisation sélective sur les neurones cibles en plusieurs points.

Cela stimule les canaux sensibles à la lumière, provoque un afflux d’ions calcium et améliore la fluorescence des neurones cibles.

Les neurones cibles activés transmettent des signaux aux neurones connectés et augmentent la fluorescence du neurone connecté.

Encore une fois, capturez une image à deux photons. Une fluorescence accrue dans les neurones cibles et connectés confirme l’activité neuronale et la connectivité.

Après avoir placé la souris sous le microscope et effectué l’imagerie à deux photons, ouvrez le logiciel d’imagerie commercial. En mode d’imagerie en direct, ajustez la tension du détecteur d’image et la puissance du laser d’imagerie, afin d’optimiser la luminosité des neurones exprimant GCaMP6m-P2A-ChRmine. Capturez des images des neurones exprimant ces protéines, puis éclairez les neurones spécifiques en suivant la procédure décrite précédemment.

Pour étudier la connectivité fonctionnelle au sein des neurones des couches 2 et 3, utilisez un modulateur de lumière spatial pour générer des modèles holographiques de stimulation optogénétique. Et combinez-le avec l’imagerie calcique à deux photons. Réglez l’intensité du laser d’imagerie à 920 nanomètres à 10 à 20 milliwatts et le champ de vision à 256 micromètres par 256 micromètres. Mesuré à une profondeur de 100 à 150 micromètres de la surface corticale.

Réglez le temps de séjour des pixels à 1,5 microseconde pour 2 Hertz ou 100 nanosecondes pour 30 Hertz. Utilisez à la fois 2 Hertz et 30 Hertz comme fréquence d’images d’imagerie pour voir si un seul stimulus holographique a provoqué une réponse calcique dans les neurones. Réglez l’intensité du laser de stimulation holographique qui stimule un seul neurone à 10 milliwatts, ce qui est suffisant pour induire une activité neuronale.

Simultanément, imagez la réponse des ions calcium à 920 nanomètres, avec 10 stimuli holographiques à 1 040 nanomètres et des intervalles de huit secondes pour une durée de 50 millisecondes après une période de base de 10 secondes.