Visualisation des réponses toxine bactérienne induite en utilisant direct microscopie de fluorescence cellulaire

L'objectif de cette procédure est de visualiser les réponses des cellules immunitaires aux toxines bactériennes. Tout d'abord, la toxine est exprimée dans des cellules BL 21 gold et purifiée à partir de celles-ci. Une fois l'activité et la concentration de la toxine confirmées, celle-ci est administrée à des cellules immunitaires.

Une micro-injection et une microscopie en temps réel à grande vitesse sur cellules vivantes sont réalisées. L'analyse des images obtenues révèle la cinétique en temps réel des réponses des cellules immunitaires à la toxine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, telles que le mécanisme d'activation de l'inflammasome.

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les réponses des cellules immunitaires médiées par des toxines, elle peut également être appliquée à d'autres stimuli, notamment les agents chimiotactiques. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en étudiant l'interaction entre des bactéries et des cellules immunitaires en culture, et nous avons observé des interactions très variables entre les bactéries et les cellules immunitaires. Commencez la purification de la streptolysine O ou SLO à partir d'une culture de cellules BL 21 gold contenant le plasmide PAG trois SLO.

Le plasmide a été cultivé jusqu'à une DO d'environ 0,6. Pour induire l'expression protéique, ajouter cinq millilitres de 20 % d'OSes à la culture et agiter à 225 tr/min à température ambiante pendant trois heures. Ensuite, transférer les bactéries dans un flacon de centrifugeuse de 500 millilitres.

Ensuite, centrifuger la culture à 12 000 ×g pendant 12 minutes à 4 degrés Celsius ; après la centrifugation, décantez. Conservez le culot à −80 degrés Celsius pendant la nuit ou plus longtemps si nécessaire. Pour purifier la SLO exprimée, ajoutez 10 millilitres de tampon de lavage ly complété par du Triton X-100, de la lysozyme et du fluorure de phénylméthylsulfonyle au culot congelé, puis pipetez de haut en bas pendant environ 15 minutes.

Pour la resuspension, suspendre le culot en gardant l'échantillon sur glace. Transférer le culot resuspendu dans un tube polypropylène rond de 50 millilitres de type Oak Ridge. Soniquer le lysat à l'aide d'une sonde à 40 % de puissance, cinq fois pendant 30 secondes chacune, avec des intervalles de 30 secondes et 30 secondes sur glace entre chaque cycle.

Ensuite, centrifuger le lysat soniqué à 39 000 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, ajouter le surnageant bactérien à un millilitre de billes de nickel NTA lavées. Incuber les billes de nickel NTA et le lysat ensemble pendant 2,5 heures à quatre degrés Celsius avec un léger agitation. Après l'incubation.

Centrifuger les billes à 400 × g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Remarquez que tous les lavages et l'élution suivants sont effectués avec ces paramètres de centrifugation, sauf indication contraire. Après la centrifugation.

Combiner 30 microlitres du surnageant avec 10 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS quatre fois concentré dans un tube de microcentrifugeuse et conserver le mélange sur de la glace pour l'analyse de pureté. Ensuite, jeter le reste de l'agent surnageant et laver les billes quatre fois avec du tampon de lavage pour poux, ainsi qu'une fois avec du tampon de sel d'intérêt, en centrifugeant entre chaque lavage. À partir de ce moment, veiller à garder l'échantillon sur de la glace en permanence.

La SLO est une protéine très sensible au redox et perd rapidement son activité si elle est chauffée à 37 degrés Celsius, même pendant une courte période. Pour éluer la protéine SLO, ajoutez un millilitre de tampon d'élution et cinq microlitres de DTT à une molaire sur les billes, incubez sur de la glace pendant 10 minutes. Puis centrifugez et récupérez le surnageant dans un tube à centrifuger étiqueté avec le numéro d'élution.

Répétez ce processus trois fois, puis, afin d'éliminer l'endotoxine de la protéine SLO, ajoutez 200 microlitres de billes agro conjuguées poly-mélangées lavées, suspendues dans un tampon res salt, à l'échantillon et agitez à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez à 10 000 ×g pendant une minute à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, récupérez le surnageant dans de nouvelles tubes microcentrifuge étiquetées.

Combinez 30 microlitres de chaque élution avec 10 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS quatre fois. Pour l'analyse par électrophorèse SDS, conservez les solutions SLO sur de la glace. Déterminez les concentrations en protéines et l'activité hémolytique ; si celle-ci est satisfaisante, récupérez le SLOE en fractions de cinq à 10 microlitres, puis congélez sur de la glace sèche et stockez à moins 80 degrés Celsius.

Ensuite, déterminez la lyse spécifique Reese. Suspendez les cellules à tester à deux concentrations. Centrez six cellules par millilitre dans le tampon RB contenant 20 microgrammes par millilitre.

Iodure de propidium. Ici, les cellules T 27 A sont testées. Ajouter 100 microlitres de cellules dans chaque puits d'une plaque de 96 puits en V fond dans des tubes microcentrifugeés séparés.

Effectuez une dilution sérielle de la SLO à deux fois la concentration finale dans le tampon rb. Ajoutez ensuite soit 100 microlitres de toxine, soit 100 microlitres de tampon RB aux cellules et incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Les concentrations finales typiques varient de 2000 unités par millilitre à 31,25 unités par millilitre.

Faites passer les cellules sur un cytomètre en flux et collectez les données à l’aide de filtres pour fi, cethrin ou pe. Un décalage d’un logarithme représente les cellules transitoirement perméables, tandis qu’un décalage de trois logarithmes indique les cellules mortes. Calculez la lyse spécifique des cellules en soustrayant le pourcentage de cellules mortes dans le témoin de celui obtenu dans l’expérience, à l’aide de l’équation indiquée ici, un jour avant de mettre en place les expériences, centrez deux fois les cinq macrophages sur du verre recouvert de collagène.

Plaques de 35 millimètres inférieures. Le microscope utilisé pour l'administration du toxine doit être équipé d'un objectif inversé, d'un plateau chauffant, des cubes de filtres d'excitation et d'émission appropriés, et, si possible, d'un objectif de Bertrand. La partie la plus délicate de cette procédure consiste à faire descendre l'aiguille intacte jusqu'aux cellules.

Pour assurer le succès, nous utilisons un objectif de Bertrand, normalement destiné à l'alignement, afin de visualiser l'aiguille lors de son passage à travers les plans focaux. Le microscope doit être relié à un micro-injecteur et contrôlé par un ordinateur disposant d'une mémoire suffisante pour collecter et stocker les données, allumer le microscope et le micro-injecteur, et permettre à la platine chauffante de monter à 37 degrés Celsius pendant l'attente du réchauffage. Marquez les cellules avec un colorant pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

En fonction du test, le marquage peut être effectué avec cinq microlitres, quatre ou 2:00 AM dans un millilitre de HBSS, ou deux microlitres de calcium am dans un millilitre de milieu complet ici, quatre ou deux est utilisé. Retirez le milieu cellulaire et lavez les cellules une fois avec du PBS. Aspirez le PBS et remplacez-le par un millilitre de RPMI supplémenté avec deux millimolaire de chlorure de calcium.

Montez la boîte sur le microscope, mettez les cellules au point avec le champ clair, puis ajustez la mise au point légèrement au-dessus des cellules. Ensuite, mélangez un microlitre de toxine SLO avec quatre microlitres de DEXTRA 5 55 à 10 milligrammes par millilitre et six microlitres d'eau. Puis centrifugez à 20 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Le dextran est utilisé pour vérifier que la pointe femto n'est pas obstruée par du G. Utilisez un microchargeur pour charger deux microlitres de toxine diluée dans la pointe femto par l'arrière. Placez la pointe femto sur le microinjecteur.

Ensuite, ajustez l'angle de l'injecteur de manière à ce que la pointe soit positionnée au centre des cellules, avec suffisamment d'espace pour se déplacer librement dans toutes les directions, puis effacez les paramètres précédents de la limite Z, qui détermine jusqu'où la pointe de l'injecteur microscopique peut descendre. Réglez l'injecteur microscopique pour injecter pendant 0,5 seconde à 120 PSI avec une pression arrière de 20 PSI. Abaissez ensuite la pointe jusqu'à ce qu'elle pénètre dans le milieu.

À l'aide de l'objectif Bertrand, centrez la pointe et suivez-la lorsqu'elle est abaissée vers les cellules. Dès que l'aiguille sort du champ de netteté, revenez à l'optique normale.

L'ombre de l'aiguille doit être visible dans le champ. Mettez au point au-dessus des cellules puis abaissez l'aiguille jusqu'à ce qu'elle soit nette. Ramenez ensuite les cellules au point et approchez délicatement l'aiguille à proximité d'une cellule.

Après avoir défini la limite Z pour l'injection, commencez l'acquisition d'images et injectez la toxine. Ensuite, relevez l'aiguille et déplacez-vous vers une nouvelle région de cellules. Injectez une quantité supplémentaire de toxine et poursuivez l'acquisition d'images après l'injection.

Déplacez l'aiguille en position initiale pour éviter toute fuite indésirable de toxine, en utilisant la méthode décrite dans cette vidéo, de 107 à 108 unités par millilitre. L'SLO est généralement obtenu avec une concentration en protéines de quatre milligrammes par millilitre. Ce gel de PAGE-SDS montre des échantillons bactériens avant et après induction de la toxine, suivie de purification, et chacune des trois colorations au bleu de kamasi d'Ellucian révèle que l'SLO induit a été correctement purifié.

SLO correspond à la bande de 69 kilodaltons permettant de déterminer la quantité de toxine nécessaire à la lyse des cellules T 27 A ou D deux. Les cellules ont été exposées à diverses concentrations de SLO pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius en présence d'iodure de propidium, puis analysées par cytométrie en flux. La lyse spécifique a été déterminée comme illustrée ici.

250 unités par millilitre. La SLO provoque une lyse à 50 % des cellules T 27 A et D deux. Une dose sous-lytique de 10 % de lyse serait de 62,5 unités par millilitre.

Ces valeurs sont importantes pour établir une référence de l'activité toxique afin d'évaluer la mort cellulaire après exposition à la toxine. Des fibroblastes dermiques humains ont été incubés avec du calcium et un homodimère d'athérium à l'aide d'un kit vivant-mort fourni par Life Technologies. Après une exposition localisée à la toxine bactérienne, l'anthrolysinne O. Sur cette image, le calcium est représenté en vert et le bromure d'athérium en rouge ; les régions proches du microbiome montrent une mort cellulaire caractérisée par une perte de calcium et une absorption de l'homodimère d'athé, tandis que les régions situées plus loin de l'extrémité ne présenteront aucun dommage.

L'administration microscopique de la toxine permet également l'examen d'événements en temps réel, tels que le flux de calcium. Ces DC humaines chargées à 4:02 AM ont été exposées à la SLO à un débit constant, avec une imagerie en direct simultanée montrant un passage du vert au bleu. La pseudo-couleur indique une augmentation des concentrations de calcium cytosolique.

SLO induit une augmentation rapide du calcium cytosolique, qui se propage dans la région de la boîte en raison de l'administration localisée. Toutefois, seules les cellules proches de l'extrémité du micro-injecteur entrent en contact avec la toxine et réagissent à celle-ci. Cela illustre à la fois la réaction cellulaire à la toxine et la zone spatialement restreinte d'administration de la toxine, permettant de résoudre les événements selon la dimension zdi.

La microdistribution a été combinée à une microscopie confocale 3D à grande vitesse. Ce jeu d'images montre des cellules dendritiques après l'injection d'une toxine. Elles ont été préincubées avec un anticorps anti-CD11c conjugué à un PC, représenté en vert, afin de marquer la membrane plasmique.

Comme on peut le voir ici, des microvésicules sont libérées suite à l'administration de la toxine. Dans le cadre du processus de réparation cellulaire, les molécules de toxine s'accumulent sur les bourgeons membranaires, qui sont ensuite éliminés pour expulser la toxine. Une fois maîtrisée, la microscopie peut être réalisée en 45 minutes.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir la toxine au froid avant de la mélanger aux cellules et de tester son activité hémolytique. Bien. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mesurer en temps réel la cinétique des réponses des cellules immunitaires aux toxines bactériennes à l’aide de la microscopie sur cellules vivantes.