Name: Visualisation des réponses toxine bactérienne induite en utilisant direct microscopie de fluorescence cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Découvrez la visualisation des réponses immunitaires à la streptolysine O par microscopie à fluorescence en cellules vivantes. Cette méthode permet d'étudier la cinétique des changements cellulaires et l'activation de l'inflammasome.

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Les auteurs tiennent à remercier Richard Reste pour le don généreux de anthrolysin O, Michael Caparon pour le don généreux des Francs SLO plasmide et Jonathon d&#39;assistance technique. Ce travail a été financé par des subventions du NIH T32CA82084 (PAK), et R01AI072083 (RDS).

1. Purification de streptolysine O (SLO) <ol><li> Inoculer 20 ml de culture de nuit de cellules BL21 contenant le plasmide GOLD pBADgIII-SLOhis 9 dans 0,5 L de bouillon LB et ajouter 500 ul de 50 mg / ml d&#39;ampicilline. Secouez la culture à 225 rpm à 37 ° C jusqu&#39;à DO600 = 0,6, habituellement ~ 1,5 h. Centrifuger 1 ml (bactéries considérées T 0) à 10.000 xg 5 min, dissoudre le culot dans tampon 140 pi d&#39;échantillon SDS 1x / 1 OD et soniquer à l&#39;ADN de cisaillement pour l&#39;analyse de pureté des protéines. </li><li> Provoquer des bactéries avec l&#39;addition de 5 ml arabinose 20% à la culture, secouez à 225 rpm à température ambiante pendant 3 heures. Prélever 1 ml de bactéries par centrifugation et dissous dans un tampon d&#39;échantillon SDS 1x comme ci-dessus pour le point de temps T 3 pour l&#39;analyse de pureté. </li><li> Recueillir des bactéries restantes dans 500 ml bouteille centrifugeuse, tourner 12.000 xg pendant 12 min à 4 ° C (8.500 rpm Sorvall GS-3 du rotor). Décanter le surnageant, réserve de granulés à -80 ° C pendant la nuit ou plus si nécessaire. </li><li> Reprendre le frozen granulés sur la glace dans 10 ml Lyse / tampon de lavage (50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8,0) additionné de 400 ul de 25% de Triton X-100, 100 pl 100 mg / ml de lysozyme, 50 pl 200 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF). Transférer le culot remis en suspension à tube de 50 ml d&#39;Oak Ridge. </li><li> Soniquer lysat 5 fois pendant 30 secondes sur la glace avec des intervalles de 30 sec. Spin soniqué lysat dans un tube Oak Ridge à 39000 xg pendant 20 min à 4 ° C (18.000 rpm Sorvall rotor SS-34). </li><li> Alors que le lysat est en rotation, laver 1 ml de Ni-NTA agarose avec 10 ml Lyse / tampon de lavage et un essorage à 1200 rpm pendant 5 min à 4 ° C. (Tous les autres lavages / ELUTIONS utiliser centrifugation dans ces conditions). Aspirer laver. </li><li> Ajouter surnageant bactérien de l&#39;étape de 1,5 à Ni-NTA agarose, agiter doucement pendant 2,5 heures à 4 ° C. Spin pour ramasser le surnageant. Mélanger 30 ul de surnageant avec 10 μ tampon d&#39;échantillon SDS 4x et d&#39;économiser pour l&#39;analyse de la pureté. Laver les billes 4 fois dans Lyse / tampon de lavage et surce du Tris / sel tampon (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0). </li><li> Éluer 3 fois en ajoutant 1 ml de tampon d&#39;élution (250 mM d&#39;imidazole dans du Tris / sel tampon) et 5 pi 1 M dithiothréitol (DTT) à des billes, l&#39;incubation sur de la glace pendant 10 min, filature et recueillir le surnageant. SLO est une protéine très redox-sensible, et doit être conservé sur de la glace en tout temps. Une fois réduit, la protéine perdra rapidement son activité si chauffé à 37 ° C, même pour une courte période de temps. </li><li> Lavez 500 pi polymixine conjugué agarose dans un tampon d&#39;élution, spin à 10.000 xg pendant 1 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 500 ul. Pour décharger endotoxine, ajouter 200 ul de perles à chaque élution et secouez 4 ° C pendant 30 min. Spin à 10.000 xg pendant 1 min à 4 ° C, puis enregistrez le surnageant. Mélanger 30 ul de chaque élution avec 10 pi de tampon d&#39;échantillon SDS 4x pour analyse SDS-PAGE. </li><li> Tester la pureté de élutions par SDS-PAGE. Faire bouillir les échantillons enregistrés pour analyse sur gel à 95 ° C pendant 5 min et la charge de 10 pi sur un gel à 10%. Stain gel de Coomassie pour visualiser la protéine (figure 2A). SLO est de 69 kDa. Effectuer un test de Bradford afin de déterminer la concentration de protéines (rendement typique est de 4 mg / ml pour les deux premières élutions, mais peut varier selon la souche bactérienne et le plasmide utilisé). </li><li> Tester l&#39;activité hémolytique de chaque élution (voir ci-dessous). Élutions piscine où l&#39;activité pureté, la concentration et hémolytiques sont satisfaisants. SLO aliquote à usage unique aliquotes (ul typiquement 5-10), de geler sur glace sèche et conserver à -80 ° C. </li></ol> 2. Dosage hémolytique <ol><li> Laver globules rouges de mouton (globules rouges) dans RBC dosage tampon (0,3% de sérumalbumine bovine (BSA), 2 mM de CaCl2, 10 mM de HEPES, pH 7,4), spin à 1200 rpm pendant 5 min, et remettre en suspension les globules rouges à 2,5% en 10 ml de tampon de dosage RBC. </li><li> Ajouter 10 ul de tampon d&#39;analyse RBC / puits dans 96 puits à fond en V plat sur la glace. Diluer en série chaque élution en double exemplaire. Gammes de dilutions typiques sont 1:1,000 à 1:512,000. Inclure les 3 puits avec aucune toxine et 3 puits avec 10pi 2% de Triton X-100 comme puits minimale et maximale, respectivement. </li><li> Couvrir la plaque et incuber à 37 ° C 30 min. Centrifuger à 1200 rpm pendant 5 min. Transfert 70 pi de surnageant dans un fond plat plaque de 96 puits. Lire A 405. Une unité est la dilution de la toxine requis pour la lyse de 50% des globules rouges. Activité de la toxine est de 1 unité de dilution * factor/0.01 ml. </li></ol> 3. Essai cellule lytique <ol><li> Cellules de récolte, de comptage, de spin. Remettre en suspension à 2x10 6 / ml dans un tampon R / B (RPMI avec 2 mM de CaCl2, 0,5% de BSA) et 20 pg / ml d&#39;iodure de propidium. Ajouter 100 ul de cellules à un 96-V et plaque à fond. </li><li> Diluer en série SLO 2x concentration finale dans le tampon R / B, ajouter 100 ul toxine ou 100 pi de tampon R / B pour les cellules. Incuber 5 min à 37 ° C. Portée typique concentrations finales de 2.000 U / ml à 31,25 U / ml. </li><li> Exécuter sur les cellules cytomètre de flux et de recueillir des données avec des filtres pour la phycoérythrine (PE). Un décalage d&#39;une cel journal représente transitoirement perméabiliséesls tandis qu&#39;un changement de 3 log indique les cellules mortes 4. Calculer la lyse spécifique des cellules en soustrayant le pourcentage de cellules mortes dans le contrôle (PI% haute ctl) de la (PI exp% élevé) expérimental, comme suit: lyse spécifique = (PI% exp haute -% PI haute ctl) / (100 -% PI haute ctl) * 100 </li></ol> 4. Micropipette de livraison de la toxine aux cellules dans des boîtes de culture <ol><li> Un jour avant l&#39;expérience, les macrophages plaque 2x10 5 sur un revêtue de collagène à fond de verre boîte de 35 mm. </li><li> Allumez le microscope et microinjecteur. Prévoyez du temps Platine chauffante pour réchauffer à 37 ° C. Le choix d&#39;un microscope dépend généralement de ce qui est disponible localement. Le microscope inversé a besoin d&#39;un stade, un stade capable de chauffer les plats à 37 ° C, blocs de filtres d&#39;excitation / émission appropriées pour le colorant choisi, et l&#39;espace pour connecter physiquement le micro-injecteur. Lentille de Bertrandest utile pour la micro-injection, mais pas obligatoire. L&#39;ordinateur de conduite du microscope a besoin de mémoire suffisant pour recueillir et stocker des données. </li><li> Marquer les cellules pendant 30 min avec de la teinture à 37 ° C. Selon le dosage, l&#39;étiquetage peut être fait avec 5 pl Fura2 AM dans 1 ml de PBS ou 2 pi calcéine AM dans 1 ml de milieu complet. Pour Fura2, excitation / émission est recueillie pour 340/510 nm et 380/510 nm, et le rapport de 340/380 signaux détermine le flux de calcium. Pour calcéine, excitation / émission est 495/515 nm tandis que l&#39;éthidium homodimère est 525/620 nm et APC est 650/660 nm. D&#39;autres marqueurs peuvent être choisis aussi bien. </li><li> Laver les cellules avec du PBS et placer dans 1 ml de RPMI supplémenté avec 2 mM de CaCl 2. Montez le microscope. </li><li> Diluer la toxine et le dextrane dans l&#39;eau, et centrifugation à 20.000 xg pendant 10 min 4 ° C. Typiquement, 1 pl SLO et 4 pl 10 mg / ml de dextran-555 est dilué dans 6 pl d&#39;eau. Dextrane ou un autre fluide fluorescent en phase molécule est utilisé pour vérifier que le femto-pointe n&#39;est pas bouché, et injects comme vous le souhaitez. </li><li> Chargez femto-pointe de l&#39;arrière avec 0,07 l de toxine diluée à l&#39;aide d&#39;un Microloader. </li><li> Chargez femto-pointe sur microinjecteur. Ajustez l&#39;angle de l&#39;injecteur de sorte que la pointe sera assis sur le centre des cellules avec espace pour se déplacer dans toutes les directions. Effacer z-limite. Paramètres d&#39;injection doivent être injecter plus de 0,5 seconde à 120 psi à 20 psi pression. Abaissez la pointe jusqu&#39;à ce qu&#39;elle entre dans le milieu. </li><li> En utilisant la lentille de Bertrand, centre de la pointe et la pointe suivre lorsqu&#39;il est abaissé au plus près des cellules. Une fois que vous perdre le focus, revenez à l&#39;optique normales. L&#39;ombre aiguille doit être visible sur le terrain. Concentrez-dessus des cellules et abaisser l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit mise au point. Concentrer arrière sur les cellules et soigneusement amener l&#39;aiguille adjacente à une cellule. Réglez le z-limite pour l&#39;injection. Commencer imagerie, déplacer la pointe à la position désirée, injecter pour libérer la toxine à l&#39;instant souhaité. Relevez l&#39;aiguille, passer à une nouvelle région de cellules et injecter. Déplacer l&#39;aiguille en position initiale pour éviter toute indésirablefuite de l&#39;aiguille de la toxine. </li></ol>

<ol><li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+regulates+IL-1+beta+processing+via+calcium-independent+phospholipase+A2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2.</a> J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).</li>
<li>Scolding, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+removal+by+oligodendrocytes+of+membrane+attack+complexes+formed+by+activated+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement.</a> Nature. 339, 620-622 (1989).</li>
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<li>Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical+IL-1+beta+secretion+stimulated+by+P2X7+receptors+is+dependent+on+inflammasome+activation+and+correlated+with+exosome+release+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages.</a> J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).</li>
<li>Andrei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipases+C+and+A2+control+lysosome-mediated+IL-1+beta+secretion%3A+Implications+for+inflammatory+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).</li>
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<li>Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thiol-activated+toxin+streptolysin+O+does+not+require+a+thiol+group+for+cytolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity.</a> Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).</li>
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<li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li>
<li>Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anthrolysin+O%2C+the+Bacillus+anthracis+cholesterol-dependent+cytolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin.</a> Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les techniques décrites ici permettent l&#39;examen des réponses des cellules immunitaires à des toxines bactériennes. L&#39;étape la plus critique est la manipulation et le dosage de la toxine. Activité de la toxine peut être extrêmement variable, même entre différentes aliquotes de la même préparation, en raison de sa fragilité. Cela nécessite soit l&#39;essai de chaque aliquote de la toxine contre une lignée cellulaire de référence ou globules rouges ou en utilisant des gradients de toxines. Gradients de toxines, tel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 </td><td></td></tr><tr><td> polymixine-agarose </td><td> Sigma </td><td> P1411-5ML </td><td></td></tr><tr><td> Zeba dessaler Spin col </td><td> Pêcheur </td><td> PI-89891 </td><td></td></tr><tr><td> hématies de mouton </td><td> Pêcheur </td><td> 50-415-688 </td><td></td></tr><tr><td> pBADgIII-SLO </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> voir ref 9 </td></tr><tr><td> Cy5 colorant monoréactif </td><td> GE Healthcare </td><td> PA25001 </td><td></td></tr><tr><td> Fura2-AM </td><td> Life Technologies </td><td> F1221 </td><td></td></tr><tr><td> Calcéine AM / Ethidium homodimère </td><td> Life Technologies </td><td> L3224 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD11c-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 550261 </td><td></td></tr><tr><td> revêtu de collagène à fond de verre plat </td><td> Mattek </td><td> P35GCol-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> femto-tip II </td><td> Pêcheur </td><td> E5242957000 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Pêcheur </td><td> E5242956003 </td><td></td></tr><tr><td> dextrane Alexa 555 </td><td> Life Technologies </td><td> D34679 </td><td></td></tr><tr><td> InjectMan NI 2 </td><td> Eppendorf </td><td> 920000029 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet </td><td> Eppendorf </td><td> 5247 000.013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Liste et source de réactifs spécifiques et des équipement nécessaire. Equipements spécifiques et les réactifs utilisés dans ce protocole, ainsi que la société et le numéro de catalogue sont répertoriés. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Tampon </td><td> Composition </td><td> Étape usagé </td></tr><tr><td> Lyse / Wash </td><td> 50 mM de NaH 2 PO 4 300 mM NaCl 10 mM d&#39;imidazole, pH 8,0 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> Tris / sel </td><td> Tris 50 mM, pH 8,0 300 mM NaCl </td><td> 1,7 </td></tr><tr><td> Tampon d&#39;élution </td><td> Tris 50 mM, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM d&#39;imidazole </td><td> 1,8 </td></tr><tr><td> Tampon de dosage RBC </td><td> 0,3% de BSA 2 mM de CaCl2 HEPES 10 mM, pH 7,4 </td><td> 2,1 </td></tr><tr><td> tampon R / B </td><td> Milieu de culture RPMI cellule 2 mM de CaCl2 0,5% de BSA </td><td&gt; 3,1 </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 2. Liste des tampons utilisés dans ce protocole. Les tampons utilisés, leur composition et de la première étape au cours de laquelle ils sont utilisés dans le protocole sont énumérés. </td></tr></tbody></table>

visualisation des réponses toxine bactérienne induite en utilisant direct microscopie de fluorescence cellulaire

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Toxines bactériennes se lier au cholestérol dans les membranes, en formant des pores qui permettent une fuite du contenu cellulaire et l&#39;afflux de matériaux provenant de l&#39;environnement extérieur. La cellule peut soit se remettre de cette insulte, ce qui nécessite actifs des processus de réparation des membranes, ou mourir en fonction de la quantité d&#39;exposition aux toxines et 1 type de cellule. En outre, ces toxines induisent de fortes réactions inflammatoires chez les hôtes infectés par l&#39;activation des cellules immunitaires, dont les macrophages, qui produisent une gamme de cytokines pro-inflammatoires 2. De nombreuses bactéries Gram-positives produisent des toxines cholestérol contraignants qui ont été montrés pour contribuer à leur virulence en grande partie grâce à des mécanismes non caractérisés. Des changements morphologiques dans la membrane plasmique des cellules exposées à ces toxines comprennent leur séquestration dans les protubérances de surface cholestérol enrichis, qui peuvent être versées dans l&#39;espace extracellulaire, ce qui suggère une défense cellulaire intrinsèqueMécanisme 3,4. Ce processus se produit sur ​​toutes les cellules en l&#39;absence de l&#39;activité métabolique, et peuvent être visualisées à l&#39;aide EM au bout de 4 fixation chimique. Dans les cellules immunitaires comme les macrophages, qui interviennent dans l&#39;inflammation en réponse à l&#39;exposition aux toxines, des vésicules membranaires induits sont suggérées pour contenir cytokines de la famille IL-1 et peut être responsable à la fois pour l&#39;excrétion des toxines et la diffusion de ces cytokines pro-inflammatoires 5,6,7. Un lien entre l&#39;IL-1β libération et un type spécifique de mort cellulaire, appelée pyroptosis a été suggéré, car les deux sont des processus caspase-1 dépendantes 8. Pour démêler les complexités de cette réponse des macrophages, ce qui inclut la liaison toxine, l&#39;excrétion de vésicules membranaires, la libération de cytokines et la mort cellulaire potentiellement, nous avons développé des techniques d&#39;étiquetage et les méthodes de microscopie par fluorescence qui permettent de visualiser en temps réel des toxines cellulaires des interactions, y compris mesures de dysfonctionnement et la mort (figure 1). Utiliserd&#39;imagerie des cellules vivantes est nécessaire en raison des limitations dans d&#39;autres techniques. Approches biochimiques ne peut pas résoudre effets qui se produisent dans des cellules individuelles, tout en cytométrie en flux n&#39;offre pas de haute résolution, visualisation en temps réel des cellules individuelles. Les méthodes décrites ici peuvent être appliqués à l&#39;analyse cinétique des réactions induites par des stimuli complexes impliquant d&#39;autres changements phénotypiques dans les cellules.

Typiquement 10 7 -10 8 U / ml SLO peut être obtenue avec une concentration en protéines de 4 mg / ml. La quantité de toxine nécessaire pour la lyse des cellules varie selon le type cellulaire, mais elle est généralement de 125 à 500 U / ml SLO (figure 2B). Types de cellules comme les macrophages peuvent être plus résistantes (4000 U / ml) alors que d&#39;autres (en particulier des lignées de cellules T) sont plus sensibles. Ces sensibilités correspondre avec SLO disponible dans le ...

Méthodes de purification du cholestérol contraignant toxine streptolysine O de recombinaison<em&gt; E. coli</em&gt; Et la visualisation de liaison de la toxine à vivre cellules eucaryotes sont décrits. Application locale de la toxine induit des changements rapides et complexes dans les cellules ciblées révélant de nouveaux aspects de la biologie toxine.

Visualisation des réponses toxine bactérienne induite en utilisant direct microscopie de fluorescence cellulaire

Les toxines bactériennes se lient au cholestérol des membranes, formant des pores qui permettent la fuite du contenu cellulaire et l'influx de substances provenant du milieu extérieur...

L'objectif de cette procédure est de visualiser les réponses des cellules immunitaires aux toxines bactériennes. Tout d'abord, la toxine est exprimée dans des cellules BL 21 gold et purifiée à partir de celles-ci. Une fois l'activité et la concentration de la toxine confirmées, celle-ci est administrée à des cellules immunitaires.Une micro-injection et une microscopie en temps réel à grande vitesse sur cellules vivantes sont réalisées. L'analyse des images obtenues révèle la cinétique en temps réel des réponses des cellules immunitaires à la toxine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunologie, telles que le mécanisme d'activation de l'inflammasome.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les réponses des cellules immunitaires médiées par des toxines, elle peut également être appliquée à d'autres stimuli, notamment les agents chimiotactiques. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode en étudiant l'interaction entre des bactéries et des cellules immunitaires en culture, et nous avons observé des interactions très variables entre les bactéries et les cellules immunitaires. Commencez la purification de la streptolysine O ou SLO à partir d'une culture de cellules BL 21 gold contenant le plasmide PAG trois SLO.Le plasmide a été cultivé jusqu'à une DO d'environ 0,6. Pour induire l'expression protéique, ajouter cinq millilitres de 20 % d'OSes à la culture et agiter à 225 tr/min à température ambiante pendant trois heures. Ensuite, transférer les bactéries dans un flacon de centrifugeuse de 500 millilitres.Ensuite, centrifuger la culture à 12 000 ×g pendant 12 minutes à 4 degrés Celsius ; après la centrifugation, décantez. Conservez le culot à −80 degrés Celsius pendant la nuit ou plus longtemps si nécessaire. Pour purifier la SLO exprimée, ajoutez 10 millilitres de tampon de lavage ly complété par du Triton X-100, de la lysozyme et du fluorure de phénylméthylsulfonyle au culot congelé, puis pipetez de haut en bas pendant environ 15 minutes.Pour la resuspension, suspendre le culot en gardant l'échantillon sur glace. Transférer le culot resuspendu dans un tube polypropylène rond de 50 millilitres de type Oak Ridge. Soniquer le lysat à l'aide d'une sonde à 40 % de puissance, cinq fois pendant 30 secondes chacune, avec des intervalles de 30 secondes et 30 secondes sur glace entre chaque cycle.Ensuite, centrifuger le lysat soniqué à 39 000 ×g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, ajouter le surnageant bactérien à un millilitre de billes de nickel NTA lavées. Incuber les billes de nickel NTA et le lysat ensemble pendant 2,5 heures à quatre degrés Celsius avec un léger agitation. Après l'incubation.Centrifuger les billes à 400 × g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Remarquez que tous les lavages et l'élution suivants sont effectués avec ces paramètres de centrifugation, sauf indication contraire. Après la centrifugation.Combiner 30 microlitres du surnageant avec 10 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS quatre fois concentré dans un tube de microcentrifugeuse et conserver le mélange sur de la glace pour l'analyse de pureté. Ensuite, jeter le reste de l'agent surnageant et laver les billes quatre fois avec du tampon de lavage pour poux, ainsi qu'une fois avec du tampon de sel d'intérêt, en centrifugeant entre chaque lavage. À partir de ce moment, veiller à garder l'échantillon sur de la glace en permanence.La SLO est une protéine très sensible au redox et perd rapidement son activité si elle est chauffée à 37 degrés Celsius, même pendant une courte période. Pour éluer la protéine SLO, ajoutez un millilitre de tampon d'élution et cinq microlitres de DTT à une molaire sur les billes, incubez sur de la glace pendant 10 minutes. Puis centrifugez et récupérez le surnageant dans un tube à centrifuger étiqueté avec le numéro d'élution.Répétez ce processus trois fois, puis, afin d'éliminer l'endotoxine de la protéine SLO, ajoutez 200 microlitres de billes agro conjuguées poly-mélangées lavées, suspendues dans un tampon res salt, à l'échantillon et agitez à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, centrifugez à 10 000 ×g pendant une minute à quatre degrés Celsius. Après la centrifugation, récupérez le surnageant dans de nouvelles tubes microcentrifuge étiquetées.Combinez 30 microlitres de chaque élution avec 10 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS quatre fois. Pour l'analyse par électrophorèse SDS, conservez les solutions SLO sur de la glace. Déterminez les concentrations en protéines et l'activité hémolytique ; si celle-ci est satisfaisante, récupérez le SLOE en fractions de cinq à 10 microlitres, puis congélez sur de la glace sèche et stockez à moins 80 degrés Celsius.Ensuite, déterminez la lyse spécifique Reese. Suspendez les cellules à tester à deux concentrations. Centrez six cellules par millilitre dans le tampon RB contenant 20 microgrammes par millilitre.Iodure de propidium. Ici, les cellules T 27 A sont testées. Ajouter 100 microlitres de cellules dans chaque puits d'une plaque de 96 puits en V fond dans des tubes microcentrifugeés séparés.Effectuez une dilution sérielle de la SLO à deux fois la concentration finale dans le tampon rb. Ajoutez ensuite soit 100 microlitres de toxine, soit 100 microlitres de tampon RB aux cellules et incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Les concentrations finales typiques varient de 2000 unités par millilitre à 31,25 unités par millilitre.Faites passer les cellules sur un cytomètre en flux et collectez les données à l’aide de filtres pour fi, cethrin ou pe. Un décalage d’un logarithme représente les cellules transitoirement perméables, tandis qu’un décalage de trois logarithmes indique les cellules mortes. Calculez la lyse spécifique des cellules en soustrayant le pourcentage de cellules mortes dans le témoin de celui obtenu dans l’expérience, à l’aide de l’équation indiquée ici, un jour avant de mettre en place les expériences, centrez deux fois les cinq macrophages sur du verre recouvert de collagène.Plaques de 35 millimètres inférieures. Le microscope utilisé pour l'administration du toxine doit être équipé d'un objectif inversé, d'un plateau chauffant, des cubes de filtres d'excitation et d'émission appropriés, et, si possible, d'un objectif de Bertrand. La partie la plus délicate de cette procédure consiste à faire descendre l'aiguille intacte jusqu'aux cellules.Pour assurer le succès, nous utilisons un objectif de Bertrand, normalement destiné à l'alignement, afin de visualiser l'aiguille lors de son passage à travers les plans focaux. Le microscope doit être relié à un micro-injecteur et contrôlé par un ordinateur disposant d'une mémoire suffisante pour collecter et stocker les données, allumer le microscope et le micro-injecteur, et permettre à la platine chauffante de monter à 37 degrés Celsius pendant l'attente du réchauffage. Marquez les cellules avec un colorant pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.En fonction du test, le marquage peut être effectué avec cinq microlitres, quatre ou 2:00 AM dans un millilitre de HBSS, ou deux microlitres de calcium am dans un millilitre de milieu complet ici, quatre ou deux est utilisé. Retirez le milieu cellulaire et lavez les cellules une fois avec du PBS. Aspirez le PBS et remplacez-le par un millilitre de RPMI supplémenté avec deux millimolaire de chlorure de calcium.Montez la boîte sur le microscope, mettez les cellules au point avec le champ clair, puis ajustez la mise au point légèrement au-dessus des cellules. Ensuite, mélangez un microlitre de toxine SLO avec quatre microlitres de DEXTRA 5 55 à 10 milligrammes par millilitre et six microlitres d'eau. Puis centrifugez à 20 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.Le dextran est utilisé pour vérifier que la pointe femto n'est pas obstruée par du G. Utilisez un microchargeur pour charger deux microlitres de toxine diluée dans la pointe femto par l'arrière. Placez la pointe femto sur le microinjecteur.Ensuite, ajustez l'angle de l'injecteur de manière à ce que la pointe soit positionnée au centre des cellules, avec suffisamment d'espace pour se déplacer librement dans toutes les directions, puis effacez les paramètres précédents de la limite Z, qui détermine jusqu'où la pointe de l'injecteur microscopique peut descendre. Réglez l'injecteur microscopique pour injecter pendant 0,5 seconde à 120 PSI avec une pression arrière de 20 PSI. Abaissez ensuite la pointe jusqu'à ce qu'elle pénètre dans le milieu.À l'aide de l'objectif Bertrand, centrez la pointe et suivez-la lorsqu'elle est abaissée vers les cellules. Dès que l'aiguille sort du champ de netteté, revenez à l'optique normale.L'ombre de l'aiguille doit être visible dans le champ. Mettez au point au-dessus des cellules puis abaissez l'aiguille jusqu'à ce qu'elle soit nette. Ramenez ensuite les cellules au point et approchez délicatement l'aiguille à proximité d'une cellule.Après avoir défini la limite Z pour l'injection, commencez l'acquisition d'images et injectez la toxine. Ensuite, relevez l'aiguille et déplacez-vous vers une nouvelle région de cellules. Injectez une quantité supplémentaire de toxine et poursuivez l'acquisition d'images après l'injection.Déplacez l'aiguille en position initiale pour éviter toute fuite indésirable de toxine, en utilisant la méthode décrite dans cette vidéo, de 107 à 108 unités par millilitre. L'SLO est généralement obtenu avec une concentration en protéines de quatre milligrammes par millilitre. Ce gel de PAGE-SDS montre des échantillons bactériens avant et après induction de la toxine, suivie de purification, et chacune des trois colorations au bleu de kamasi d'Ellucian révèle que l'SLO induit a été correctement purifié.SLO correspond à la bande de 69 kilodaltons permettant de déterminer la quantité de toxine nécessaire à la lyse des cellules T 27 A ou D deux. Les cellules ont été exposées à diverses concentrations de SLO pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius en présence d'iodure de propidium, puis analysées par cytométrie en flux. La lyse spécifique a été déterminée comme illustrée ici.250 unités par millilitre. La SLO provoque une lyse à 50 % des cellules T 27 A et D deux. Une dose sous-lytique de 10 % de lyse serait de 62,5 unités par millilitre.Ces valeurs sont importantes pour établir une référence de l'activité toxique afin d'évaluer la mort cellulaire après exposition à la toxine. Des fibroblastes dermiques humains ont été incubés avec du calcium et un homodimère d'athérium à l'aide d'un kit vivant-mort fourni par Life Technologies. Après une exposition localisée à la toxine bactérienne, l'anthrolysinne O. Sur cette image, le calcium est représenté en vert et le bromure d'athérium en rouge ; les régions proches du microbiome montrent une mort cellulaire caractérisée par une perte de calcium et une absorption de l'homodimère d'athé, tandis que les régions situées plus loin de l'extrémité ne présenteront aucun dommage.L'administration microscopique de la toxine permet également l'examen d'événements en temps réel, tels que le flux de calcium. Ces DC humaines chargées à 4:02 AM ont été exposées à la SLO à un débit constant, avec une imagerie en direct simultanée montrant un passage du vert au bleu. La pseudo-couleur indique une augmentation des concentrations de calcium cytosolique.SLO induit une augmentation rapide du calcium cytosolique, qui se propage dans la région de la boîte en raison de l'administration localisée. Toutefois, seules les cellules proches de l'extrémité du micro-injecteur entrent en contact avec la toxine et réagissent à celle-ci. Cela illustre à la fois la réaction cellulaire à la toxine et la zone spatialement restreinte d'administration de la toxine, permettant de résoudre les événements selon la dimension zdi.La microdistribution a été combinée à une microscopie confocale 3D à grande vitesse. Ce jeu d'images montre des cellules dendritiques après l'injection d'une toxine. Elles ont été préincubées avec un anticorps anti-CD11c conjugué à un PC, représenté en vert, afin de marquer la membrane plasmique.Comme on peut le voir ici, des microvésicules sont libérées suite à l'administration de la toxine. Dans le cadre du processus de réparation cellulaire, les molécules de toxine s'accumulent sur les bourgeons membranaires, qui sont ensuite éliminés pour expulser la toxine. Une fois maîtrisée, la microscopie peut être réalisée en 45 minutes.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir la toxine au froid avant de la mélanger aux cellules et de tester son activité hémolytique. Bien. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mesurer en temps réel la cinétique des réponses des cellules immunitaires aux toxines bactériennes à l’aide de la microscopie sur cellules vivantes.

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