Visualisation des réponses toxine bactérienne induite en utilisant direct microscopie de fluorescence cellulaire

Le but de cette procédure est de visualiser les réponses des cellules immunitaires aux toxines bactériennes. Tout d’abord, la toxine est exprimée et purifiée à partir de cellules d’or BL 21. Une fois que l’activité et la concentration de la toxine sont confirmées, la toxine est délivrée aux cellules immunitaires.

À l’aide d’un micro-injecteur et d’une microscopie à cellules vivantes à grande vitesse, on effectue une microscopie. L’analyse des images résultantes révèle la cinétique en temps réel des réponses des cellules immunitaires à la toxine. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que le mécanisme d’activation de l’inflammasome.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des réponses des cellules immunitaires médiées par les toxines, elle peut également être appliquée à d’autres stimuli, y compris les tracteurs chimiotactiques. Nous avons d’abord l’idée de cette méthode en étudiant l’interaction des bactéries avec les cellules immunitaires cultivées et en observant des interactions très variables entre les bactéries et les cellules immunitaires. Commencer la purification de la streptococcémie lysine O ou SLO avec une culture de cellules d’or BL 21 contenant du PAG trois SLO.

Son plasmide a atteint une DO d’environ 0,6. Pour induire l’expression des protéines, ajoutez cinq millilitres de 20 % de systèmes d’exploitation à la culture et agitez à 2 25 tr/min à température ambiante pendant trois heures. Ensuite, transférez les bactéries dans une bouteille à centrifuger de 500 millilitres.

Ensuite, faites tourner la culture à 12 000 fois G pendant 12 minutes de quatre degrés Celsius après la décantation de centrifugation. Le supinate stocke les granulés à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit ou plus longtemps si nécessaire. Pour purifier le SLO exprimé, ajoutez 10 millilitres de tampon de lavage complété par du lysozyme Triton X 100 et du fluorure de phénylméthylsulfuryle dans la pipette à granulés congelés de haut en bas pendant environ 15 minutes.

Pour Resus, suspendez la pastille en maintenant l’échantillon sur de la glace. Transférez la pastille remise en suspension dans un tube en polypropylène à fond rond de 50 millilitres de chêne. Soniquez le lysat à l’aide d’une sonde à 40 % de sortie cinq fois pendant 30 secondes à des intervalles de 30 secondes avec 30 secondes sur la glace entre les deux.

Ensuite, faites tourner le lysat de sonicate à 39 000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Après l’essorage, ajoutez le supinate bactérien à un millilitre de nickel NTA aros lavé. Incuber le nickel NTA aros et le lysat ensemble pendant 2,5 heures à quatre degrés Celsius en secouant doucement après l’incubation.

Granulez les perles en les tournant à 400 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Notez que tous les lavages et élutions ultérieurs sont effectués avec ces réglages de centrifugation et moins d’indication contraire. Après la centrifugation.

Combinez 30 microlitres de supinate avec 10 microlitres de tampon d’échantillon quatre fois SDS dans un microtube à centrifuger et conservez-le sur de la glace pour l’analyse de la pureté. Ensuite, jetez le reste de l’agent couché et lavez les perles quatre fois dans un tampon anti-poux. Et une fois que l’intérêt est la centrifugation du tampon de sel entre chaque lavage À partir de ce moment, assurez-vous de garder l’échantillon sur de la glace à tout moment.

SLO est une protéine très sensible à l’oxydoréduction et elle perdra rapidement son activité si elle atteint 37 degrés centigrades, même si c’est pour une courte période de temps. Pour éluer la protéine SLO, ajoutez un millilitre de tampon d’élution et cinq microlitres d’une molaire de DTT aux billes, incubez sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez et collectez le supinate dans un tube de fuge étiqueté avec le numéro Elucian.

Répétez ce processus trois fois, puis pour épuiser l’endotoxine de la protéine SLO, ajoutez 200 microlitres de billes agro conjuguées en poly mélange lavé, un tampon de sel en suspension à l’échantillon et secouez à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, tournez à 10 000 fois G pendant une minute à quatre degrés Celsius. Après l’essorage, collectez le surnageant dans de nouveaux microtubes à centrifuger étiquetés.

Combinez 30 microlitres de chaque élution avec 10 microlitres, quatre fois le tampon d’échantillon SDS. Pour l’analyse des pages SDS, stockez les solutions SLO sur la glace. Déterminez les concentrations de protéines et l’activité hémolytique si elles sont satisfaisantes, tirez le SLOE en quats de cinq à 10 microlitres, puis congelez-le sur de la glace sèche et stockez-le à moins 80 degrés Celsius.

Déterminez ensuite la lyse spécifique. Reese. Suspendez les cellules à tester à deux reprises. Centrez les six cellules par millilitre dans le tampon RB avec 20 microgrammes par millilitre.

Iodure de propidium. Ici, les cellules T 27 A sont testées. Ajoutez 100 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque inférieure en V de 96 puits dans des micro-tubes de centrifugation séparés.

Diluer en série SLO à deux fois la concentration finale dans le tampon rb. Ajoutez ensuite soit 100 microlitres de toxine, soit 100 microlitres de tampon RB aux cellules et incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Les concentrations finales typiques varient de 2000 unités par millilitre à 31,25 unités par millilitre.

Exécutez des cellules sur un cytomètre en flux et collectez des données avec des filtres pour fi, céthrine ou pe. Un décalage d’un log représente des cellules perméables transitoirement, tandis qu’un décalage de trois logarithmes indique des cellules mortes. Calculez la lyse spécifique des cellules en soustrayant le pourcentage de cellules mortes dans le contrôle de l’expérience à l’aide de l’équation montrée ici un jour avant la plaque d’expérience, centrez deux fois les cinq macrophages sur du verre recouvert de collagène.

Fond des plats de 35 millimètres. Le microscope utilisé pour l’administration des toxines doit être équipé d’une platine inversée, d’une platine chauffée, des cubes de filtre d’émission d’excitation appropriés et, si disponible, d’une lentille Bertand. La partie la plus difficile de cette procédure est de ramener l’aiguille intacte dans les cellules.

Pour assurer le succès, nous utilisons une lentille de Bertrand, qui est normalement utilisée pour l’alignement afin de visualiser l’aiguille lorsque nous l’amenons à travers les plans focaux. Le microscope doit être connecté à un micro-injecteur et doit être contrôlé par un ordinateur doté d’une mémoire suffisante pour collecter et stocker des données, allumer le microscope et le micro-injecteur et laisser le temps de chauffer la platine chauffée à 37 degrés Celsius en attendant que la platine chauffe. Étiquetez les cellules pendant 30 minutes avec un colorant à 37 degrés Celsius.

Selon le test, l’étiquetage peut être fait avec cinq microlitres, quatre ou 2h00 du matin dans un millilitre, HBSS ou deux microlitres de calcium dans un millilitre de milieu complet ici, quatre ou deux sont utilisés. Retirez le milieu cellulaire et lavez-les une fois avec du PBS. Aspirez le PBS et remplacez-le par un millilitre de RPMI complété par deux millimolaires de chlorure de calcium.

Montez la parabole sur le microscope, faites la mise au point sur les cellules à l’aide d’un fond clair, puis ajustez-la pour faire la mise au point légèrement au-dessus des cellules. Ensuite, combinez un microlitre de toxine SLO, quatre microlitres, 10 milligrammes par millilitre, DEXTRA 5 55 et six microlitres d’eau. Ensuite, centrifugez vos 20 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Le dextran est utilisé pour vérifier que la pointe femto n’est pas obstruée par G. Utilisez un micro-chargeur pour charger deux microlitres de toxine diluée dans la pointe femto par l’arrière. Chargez l’embout femto sur le micro-injecteur.

Ajustez ensuite l’angle de l’injecteur de sorte que l’embout se trouve au centre des cellules avec de la place pour se déplacer dans toutes les directions, effacez les paramètres précédents pour la limite Z, qui limite la hauteur de l’embout du micro-injecteur. Réglez le micro-injecteur pour qu’il injecte pendant 0,5 seconde à 120 PSI avec une contre-pression de 20 PSI. Abaissez ensuite la pointe jusqu’à ce qu’elle pénètre dans le milieu.

Utilisation de l’objectif de Bertrand. Centrez la pointe et suivez la pointe lorsqu’elle est abaissée plus près des cellules. Une fois que l’aiguille est hors de portée, revenez à l’optique normale.

L’ombre de l’aiguille doit être apparente sur le terrain. Concentrez-vous au-dessus des cellules et abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle devienne nette. Ensuite, faites la mise au point sur les cellules et amenez soigneusement l’aiguille adjacente à une cellule.

Après avoir défini la limite Z pour l’injection, commencez l’imagerie et injectez la toxine. Ensuite, soulevez l’aiguille et déplacez-vous vers une nouvelle région de cellules. Injectez de la toxine supplémentaire et poursuivez l’imagerie après l’injection.

Déplacez l’aiguille vers la position d’origine pour éviter toute fuite indésirable de toxine de l’aiguille en utilisant la méthode décrite dans cette vidéo, 10 à sept à 10 à huit unités par millilitre. Le SLO est généralement obtenu avec une concentration en protéines de quatre milligrammes par millilitre. Ce gel de page SDS montre des échantillons bactériens avant et après l’induction de toxines après la purification, et chacune des trois coloration au bleu kamasi elluciiennes révèle que le SLO induit a été purifié avec succès.

SLO est la bande à 69 kilodaltons pour déterminer la quantité de toxine nécessaire à la lyse de T 27 A ou D deux cellules. Les cellules ont été testées avec diverses concentrations de SLO pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius en présence d’iodure de propidium et examinées par cytométrie en flux. La lyse spécifique a été déterminée, comme le montre le présent document.

250 unités par millilitre. SLO donne une lyse de 50 % des deux cellules T 27 A et D. Une dose sublitique de 10 % de toxine serait de 62,5 unités par millilitre.

Ces valeurs sont importantes pour l’activité de référence des toxines afin d’évaluer la mort cellulaire après l’exposition aux toxines. Des fibroblastes dermiques humains ont été incubés avec de l’homodimère de calcium et d’atérium à l’aide d’un kit de morts vivants de Life Technologies. Après une exposition localisée à la toxine bactérienne, l’anthrolysine O.In cette image, le calcium est représenté en vert et le bromure d’athérie dans les régions rouges proches du microbiome, montrent la mort cellulaire caractérisée par la perte de calcium et l’absorption de l’homodimère, tandis que les régions plus éloignées de l’extrémité ne montreront aucun dommage.

La micro-livraison de la toxine permet également d’examiner des événements en temps réel tels que le flux de calcium. Ces dcs humains chargés avec 4:02 AM ont été exposés à SLO à un débit constant avec un décalage simultané de l’imagerie en direct du vert au bleu. La pseudo-couleur indique une augmentation des niveaux de calcium cytosolique.

SLO induit une augmentation rapide du calcium cytosolique, qui se propage dans la région de la boîte en raison de l’administration localisée. Cependant, seules les cellules proches de l’extrémité du micro-injecteur rencontrent la toxine du réacteur. Cela démontre à la fois une réaction cellulaire à la toxine et la zone spatialement restreinte de livraison de la toxine pour résoudre les événements dans la dimension zdi.

La micro-administration a été combinée à la microscopie confocale 3D à grande vitesse. Cet ensemble d’images montre des cellules dendritiques suite à l’injection de toxine. Ils ont été pré-incubés avec de l’anti-CD 11 C conjugué à un PC représenté en vert pour marquer la membrane plasmique.

Comme on peut le voir ici, les microvésicules sont libérées après l’administration de toxines. Dans le cadre du processus de réparation cellulaire, les molécules de toxine sont concentrées sur les bulles, qui sont éliminées pour éliminer la toxine. Une fois maître, la microscopie peut être réalisée en 45 minutes.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder la toxine froide avant de la mélanger aux cellules et de tester l’activité hémolytique. Bon. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer en temps réel la cinétique des réponses des cellules immunitaires aux toxines bactériennes à l’aide de la microscopie à cellules vivantes.