ARN-seq Analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires

L’objectif global de cette procédure est de présenter un processus complet et détaillé pour appliquer RNA-Seq, une puissante technologie de séquençage de l’ADN de nouvelle génération, pour profiler les transcriptomes. Pour ce faire, il suffit d’isoler d’abord l’ARN total des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines avec ou sans traitement à la thrombine et de vérifier la qualité de l’ARN. La deuxième étape consiste à construire des banques d’ADN à partir de ces échantillons d’ARN.

Simplifiez la génération de clusters à l’aide de l’instrument cbot et effectuez la tâche de séquençage de l’ADN sur le HighSeq 1000. Ensuite, l’analyse des données est effectuée pour identifier et afficher les transcrits de gènes exprimés de manière différentielle. La dernière étape consiste à valider les résultats RN aeq par RT TP CR. Le principal avantage de la CI par rapport aux méthodes existantes telles qu’une micropuce d’ADN pour l’analyse du transcriptome est que la CI peut profiler un transcriptome complet, fournir des données de type numérique et ne pas s’appuyer sur une génomique connue de l’expression génique dans les cellules.

Alors que la mesure du niveau d’ARM est un outil utile pour déterminer comment la transcription de la machinerie de la cellule est affectée par des signaux externes ou comment les cellules diffèrent entre un état de santé et un état pathologique. Dans ce protocole, nous démontrerons l’analyse IC des transcriptomes dans les trobins traités et les cellules microvasculaires indo-synvasculaires pulmonaires humaines témoins. Ce protocole est basé sur notre étude récemment publiée dans laquelle nous avons réalisé avec succès la première analyse complète du transcriptome de cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines traitées avec de la thrombine à l’aide de RNA-Seq sur le High SEQ 1000, une plate-forme de séquençage d’ADN de nouvelle génération populaire.

À l’aide du système VS seven R-T-P-C-R, le Dr Denova fera la démonstration du traitement par thrombine des cellules endothéliales pulmonaires humaines et microvasculaires et de l’isolement de l’ARN cellulaire total.

Et le Dr Dimitri Gregor fera une démonstration d’analyse de données pour commencer cette culture de protocole. Cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines à une confluence comprise entre 90 et 100 % dans six plaques de puits dans deux milieux EGM avec 5 % de facteurs de croissance FBS et antibiotiques. Remplacez le milieu par le milieu de famine 30 minutes avant le traitement par la thrombine.

Après 30 minutes, traitez les cellules avec 0,05 unité par millilitre, de la thrombine, ou laissez-les non traitées comme contrôle. Incuber les cellules pendant six heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après un traitement de six heures.

Isolez l’ARN total des cellules traitées et des cellules témoins à l’aide du kit Nirvana selon les instructions du fabricant. Évaluez la qualité de l’ARN à l’aide d’une puce d’ARN eucaryote de sens standard Experian selon le protocole standard de la station d’électrophorèse automatisée Experian. Enfin, quantifier l’ARN à l’aide d’une méthode spectrophotométrique standard pour la construction de bibliothèques.

Utilisez un microgramme d’ARN total de haute qualité par échantillon comme matériau de départ pour construire la banque. Suivez le protocole standard du fabricant. Dans ce protocole, deux tours de poly contenant des sélections de Mr.mRNA sont effectués.

Pour prélever notre ARN afin de minimiser notre séquençage de l’ARN, évaluez la qualité des banques à l’aide d’une puce Experian DNA one K. Selon le protocole standard de la station d’électrophorèse automatisée Experian. Quantifiez la bibliothèque à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel.

Abréviation Q-R-T-P-C-R telle que décrite dans le protocole écrit. En accompagnant cette vidéo, exécutez le Q-R-T-P-C-R selon le protocole cyber green MM et calculez la concentration de stock d’origine de chaque bibliothèque. Diluez les stocks de la bibliothèque à 10 nanomolaires et stockez-les à 20 degrés Celsius.

Lorsqu’il est prêt à regrouper une cellule d’écoulement, décongelez la plaque de réactif du cbot dans un bain-marie. CBOT est un instrument utilisé pour rationaliser le processus de génération de clusters. Après avoir lavé l’instrument cbot, dénaturez les bibliothèques en combinant d’abord 13 microlitres d’un XTE et six microlitres de 10 nanomolaires.

Bibliothèque Ensuite, sur le côté de chaque tube, ajoutez un microlitre d’hydroxyde de sodium normal, tourbillonnez les tubes vers le bas et incuberez-le à température ambiante pendant cinq minutes. Placez ensuite les bibliothèques dénaturées sur de la glace. Ensuite, diluez les banques dénaturées avec un tampon d’hybridation pré-réfrigéré en combinant 996 microlitres de tampon et 4,0 microlitres de bibliothèque dénaturée pour une concentration finale de 12 picomolaires.

Placez les bibliothèques diluées dénaturées. Ensuite, retournez chaque rangée de tubes de la plaque cbot, en vous assurant que tous les réactifs sont décongelés. Après avoir fait tourner la plaque, retirez le joint en aluminium de la rangée de tubes d’hydroxyde de sodium et chargez-le sur l’aliquote du cbot.

120 microlitres de bibliothèques dénaturées diluées dans un tube de bande étiqueté de un à huit. Ajoutez 1,2 microlitre de la bibliothèque de contrôle PHI X dénaturée diluée dans chaque tube en tant que pic de contrôle. Après avoir tourbillonné et tourné dans les tubes, chargez-les sur le cbot dans le bon sens avec le tube numéro un à droite.

Chargez une cellule d’écoulement et un collecteur sur le cbot. Terminez la vérification de flux et commencez l’exécution du clustering. Une fois l’exécution terminée, vérifiez la distribution des réactifs sur toutes les voies.

Notez toute anomalie. Démarrez immédiatement le séquençage ou stockez la cellule d’écoulement dans le tube fourni à quatre degrés Celsius. Pour commencer le séquençage.

Décongeler le séquençage par des réactifs de synthèse. Chargez les réactifs aux endroits appropriés sur les plateaux de réactifs, en veillant à ne pas toucher les autres réactifs. Après avoir touché le mélange de clivage, à l’aide d’une cellule d’écoulement sans séquençage, amorcez les lignes de réactifs à deux reprises, nettoyez soigneusement la cellule d’écoulement de séquençage avec de l’éthanol à 70 % et des lingettes Kim, puis avec de l’éthanol à 70 % et du papier pour lentilles.

Inspectez la cellule d’écoulement pour détecter toute traînée et nettoyez-la à nouveau si nécessaire. Chargez la cellule d’écoulement sur le séquenceur et effectuez un contrôle d’écoulement pour vous assurer que l’étanchéité entre les collecteurs et la cellule d’écoulement est étanche. Démarrez l’exécution de séquençage.

Évaluez les indicateurs de qualité dès qu’ils sont disponibles pendant l’exécution Surveillez l’intensité tout au long de l’exécution. Après 101 cycles sont terminés. Effectuez une chimie de rotation pour terminer la deuxième lecture.

Le premier père a apparié les réactifs, et le second a lu le tampon d’incorporation. Ensuite, chargez les réactifs, continuez le séquençage, exécutez l’évaluation. Deuxièmement, lisez l’intensité Q3 et d’autres mesures de qualité au fur et à mesure que la course progresse.

Pour commencer l’analyse des données, utilisez la dernière version de Cassava pour convertir les fichiers d’appels de base en fichiers FAST Q. Définition du nombre de clusters Q rapides sur zéro pour garantir la création d’un seul fichier Q rapide. Pour chaque échantillon, décompressez les fichiers Q rapides pour l’analyse en aval.

Effectuez des appariements et des alignements à l’aide de la dernière version de top hat, qui aligne les lectures RNA-Seq sur les génomes de taille de mammifère à l’aide des outils de lecture courte et SAM à très haut débit, qui implémentent divers utilitaires pour les alignements de post-traitement au format SAM. Le transcriptome humain de référence peut être téléchargé à partir de I génomes en cours d’exécution top hat tous les paramètres par défaut ont été utilisés, y compris l’option de type de bibliothèque en tant que fragment non échoué à l’aide du programme cuff diff partie du progiciel cufflinks. Comparez les cellules traitées à la thrombine aux cellules témoins.

Éliminer les transcrits géniques exprimés de manière différentielle dans les cellules traitées à la thrombine sur la base du transcriptome de référence humain. Utilisez ensuite une feuille de calcul pour visualiser le résultat sous forme de tableau. Dans ce cas, tous les paramètres par défaut ont été utilisés et les transcrits de gènes avec FPKM inférieur à 0,05 et p supérieur à 0,05 ont été filtrés pour détecter de nouvelles isoformes sans référence.

Transcriptome : comparez les fichiers de transcription de l’échantillon au génome de référence à l’aide de la comparaison de brassard. Testez l’expression différentielle avec le différentiel du ballonnet en utilisant les fichiers de transcription de thrombine combinés comme génome de référence pour une analyse et les fichiers de transcription de contrôle combinés comme génome de référence pour une deuxième analyse, encore une fois, utilisez une feuille de calcul pour visualiser le résultat sous forme de tableau. Comme précédemment, les transcrits de gènes avec FPKM inférieur à 0,05 et p supérieur à 0,05 ont été filtrés.

Après cette étape, les chercheurs peuvent choisir de télécharger une liste de transcrits nouvellement signalés sur le site Web du navigateur génomique de l’UC SC afin de vérifier leur validité par une inspection manuelle. Des listes de gènes exprimés de manière différentielle peuvent également être soumises à l’analyse des voies d’ingéniosité pour la caractérisation des gènes et des voies affectées par le traitement à la thrombine. Dans cette étape, les chercheurs peuvent choisir d’utiliser cummerbund, un package R conçu pour faciliter et simplifier la tâche d’analyse des sorties de l’aeq RN pour aider à gérer, visualiser et intégrer toutes les données produites par une analyse de différentiel de brassard.

La validation des résultats de l’aeq RN est ensuite effectuée par Q-R-T-P-C-R d’abord, effectuer l’isolement total de l’ARN à partir de cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines contrôlées et traitées à la thrombine, l’évaluation de la qualité de l’ARN et la quantification de l’ARN, comme démontré précédemment dans la vidéo. Générez ensuite de l’ADN complémentaire à partir d’un microgramme d’ARN total de chaque échantillon avec un système de synthèse à trois premiers brins en exposant rt en suivant les instructions du fabricant. Enfin, effectuez une analyse Q-R-T-P-C-R sur un système de PCR en temps réel VI à sept à l’aide du test TAC MAN sur les nucléotides conçus à la demande énumérés dans le protocole écrit accompagnant cette vidéo et mesurez la quantification comme décrit ici.

Le rapport 28 s/18 S est traditionnellement utilisé comme indicateur de la dégradation de l’ARN. Pour quantifier plus précisément la dégradation, le système d’expérience calcule un indicateur de qualité de l’ARN ou un nombre RQI. L’algorithme RQI compare l’électrophérogramme d’échantillons d’ARN aux données d’une série d’échantillons d’ARN dégradés standardisés et renvoie automatiquement un nombre compris entre 10 et un. L’échantillon d’ARN doit avoir un IQR d’au moins sept et idéalement supérieur à huit.

Ces résultats Experian indiquent un échantillon d’ARN de haute qualité avec un RQI de 8,4. Les bibliothèques doivent avoir une bande passante d’environ 250 à 300 paires de bases, comme le montre cette figure des résultats Experian pour une bibliothèque de haute qualité. Ici, les résultats Q-R-T-P-C-R d’échantillons de courbe standard et d’un échantillon inconnu sont présentés.

La progression et la qualité de l’exécution du séquençage doivent être observées en permanence tout au long de l’exécution. Cette figure montre la densité de cluster appropriée au cours de la première étape d’imagerie du cycle. C’est la première indication de la course.

Les grappes de qualité doivent être brillantes et ciblées. Un exemple du premier rapport de base généré après la fin du premier cycle est présenté. Il est important d’évaluer les niveaux d’intensité de densité de cluster estimés et la qualité de la focalisation à ce stade.

Le prochain point de contrôle de la qualité après le quatrième cycle est illustré ici. Cela indique la densité absolue de cluster pour chaque voie. La densité de l’amas ne doit pas dépasser 850 K par millimètre carré après le cycle 13.

Les statistiques de phasage et de pré-phasage sont calculées. Les nombres typiques sont compris entre 0,1 et 0,25. L’évaluation majeure de la qualité est possible après le cycle 24 lorsque plusieurs indicateurs de qualité sont calculés.

Le pourcentage de lectures au-dessus de Q3 est une mesure de la confiance dans la base. Appeler une lecture avec un score Q de trois signifie qu’il y a une chance sur 1000 que l’appel de base soit erroné. Les scores Q diminuent au fur et à mesure que l’exécution progresse, mais au début, plus de 95 % des lectures atteignent ou dépassent Q3. Les clusters passant filter ou pf sont les clusters à partir desquels les données de séquence réelles seront extraites.

Idéalement, cela devrait être supérieur à 85 %Le cluster pf est basé sur de nombreux facteurs, notamment le phasage, l’intensité du pré-phasage et Q3.It ne changera pas au fur et à mesure que le cycle progresse. Le pourcentage aligné est une mesure des lectures qui s’alignent en temps réel sur le génome FI x. Étant donné qu’environ 1 %FI x a été ajouté aux banques d’échantillons, le pourcentage aligné doit être compris entre 0,5 et un.

Cette statistique montre que le contenu de la bibliothèque est bien représenté par les grappes et qu’il n’y a pas de biais de génération de grappes. Notamment, environ 26 000 nouvelles isoformes ont été détectées, ce qui illustre la force de l’aeq RN. Il peut identifier des ARN inconnus.

Alternativement, des transcrits épissés et l’utilisation alternative de promoteurs, qui ne sont pas détectables par les techniques de microréseaux. RNA-Seq peut également mesurer les transcrits moins abondants qui sont inexacts, quantifiés ou non détectés par les microréseaux afin de valider les résultats du RNA-Seq à l’aide d’une approche alternative. L’expérience A-Q-R-T-P-C-R a été réalisée pour tester trois gènes différents dans les données RNA-Seq, TR un a été régulé à la hausse par 7,96 fois soi.

L’un a été régulé à la baisse de 1,16 fois et deux a été régulé à la baisse de 1,70 fois dans les données Q-R-T-P-C-R, ces nombres correspondants sont respectivement plus 7,25 fois moins 1,15 fois et moins 2,07 fois. Les résultats de ces trois gènes dosés par RNA-Seq et Q-R-T-P-C-R sont en bon accord, ce qui corrobore les résultats de RNA-Seq. Ce protocole est spécifique à la CI à un moment donné de la microvascularisation pulmonaire humaine traitée par trobin dans les cellules seniors, mais il pourrait facilement être adapté à une étude ponctuelle multi-temps ou à des études dans d’autres tissus cellulaires traités avec différents stimuli ou inhibiteurs ou à une comparaison des transcriptomes dans les cellules ou les tissus entre un état sain et l’état pathologique.

Bien qu’il soit spécifique au High SQ 1000, ce protocole est applicable à n’importe quel membre de la famille HighSeq ou à l’analyseur de génome. Deux instruments avec des modifications mineures des étapes de génération de cluster et des réactifs de séquençage. D’autres plateformes de séquençage d’ADN de nouvelle génération telles que la série solide.

Les systèmes GS, ainsi que certains systèmes émergents plus récents, sont également utilisés aux fins du RNA-Seq. Bien que leurs procédures de construction de bibliothèque et de séquençage puissent être légèrement différentes, les conseils de manipulation de l’ARN, les parties d’analyse des données et la validation par R-T-P-C-R présentés dans ce protocole peuvent être une valeur de référence pour leurs applications RNA-Seq.