Name: ARN-seq Analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de lhomme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: Apprenez le protocole RNA-seq pour profiler les transcriptomes de cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines traitées à la thrombine. Cette méthode permet d'identifier les gènes différentiellement exprimés et de valider les résultats par RT-PCR.

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Les auteurs tiennent à remercier le Dr Stephen Kingsmore et le Centre du génome pédiatrique Médecine des Hôpitaux de Mercy enfants et cliniques pour l&#39;utilisation de leurs grappes de calcul pour l&#39;analyse des données, Illumina équipe sur le terrain des services (Elizabeth Boyer, Scott Cook et Mark Cook) et technique équipe de consultants pour leurs réponses rapides et des suggestions utiles sur le fonctionnement de l&#39;instrument ADN séquençage de prochaine génération, HiScanSQ et analyse de la qualité des données. Ce travail a été financé en partie par les Instituts nationaux de la santé Grant HL080042 (à SQY) et le démarrage du fonds de dotation et des hôpitaux pour enfants Mercy et Cliniques, Université du Missouri à Kansas City (à SQY).

<html> Un organigramme décrivant ce protocole est affiché à la figure 1. 1. Le traitement des cellules avec de la thrombine, RNA, évaluation de la qualité et la quantification de l&#39;ARN <ol><li> Culture cellules humaines endothéliales microvasculaires pulmonaires (HMVEC-LBL) à 90-100% de confluence dans des plaques 6 puits en milieu EGM-2 avec 5% de FBS, des facteurs de croissance et des antibiotiques (Lonza, chat # CC-3202). </li><li> Changer médias pour les médias famine (0% de FBS) 30 min avant le traitement avec de la thrombine. </li><li> Traiter les cellules avec 0,05 U / ml de thrombine ou de quitter traitée comme un contrôle pendant 6 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Isoler l&#39;ARN total des cellules traitées et témoins en utilisant le kit Ambion mir Vana selon les instructions du fabricant. </li><li> Évaluer la qualité de l&#39;ARN avec une Experion eucaryote StdSense puce ARN selon le protocole standard sur la station Experion électrophorèse (Automated= &quot;_blank&quot;&gt; Www.bio-rad.com). </li><li> Quantifier l&#39;ARN en utilisant une méthode standard spectrophotométrique. </li></ol> 2. Construction Bibliothèque et de séquençage <ol><li> Utilisez 1 ug d&#39;ARN totaux de haute qualité par échantillon comme produit de départ. </li><li> Pour construire la bibliothèque, suivez la procédure standard d&#39;Illumina (protocole # 15008136 Rev A). Dans ce protocole, deux séries de poly (A) ARNm contenant les sélections sont effectuées pour enlever ARNr de minimiser le séquençage ARNr. </li><li> Évaluer la qualité des bibliothèques à l&#39;aide d&#39;une puce ADN Experion 1K selon le protocole standard sur la station Experion électrophorèse automatique ( <a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.com</a> ). </li><li> Quantifier la bibliothèque en utilisant qPCR: Utiliser une bibliothèque qui a déjà été séquencé par une courbe standard et des amorces spécifiques pour les adaptateurs ligaturés. Utiliser une gamme de dilutions des bibliothèques inconnus (c.-à 1:100, 1:500 et 1:1000). Exécutez l&#39;acco qPCRrding au protocole Sybergreen MM et calculer la concentration de matière d&#39;origine de chaque bibliothèque. </li><li> Diluer les stocks de bibliothèque à 10 nM et conserver à -20 ° C jusqu&#39;au moment de pôle une cellule d&#39;écoulement. </li><li> Lorsque vous êtes prêt à se regrouper une cellule d&#39;écoulement, dégeler la plaque réactif CBOT dans un bain d&#39;eau. CBOT est un instrument Illumina utilisée pour simplifier le processus de génération de cluster. </li><li> Laver l&#39;instrument CBOT. </li><li> Dénaturer les bibliothèques: Mélanger 13 ul 1x TE et 6 ul de 10 uM bibliothèque et, sur le côté du tube, ajouter 1 ul de NaOH 1 N (fourni par Illumina). Vortex, centrifuger et incuber à température ambiante pendant 5 min et placer les bibliothèques dénaturées sur la glace. </li><li> Diluer les bibliothèques: Diluer les bibliothèques dénaturés avec un tampon d&#39;hybridation pré-réfrigéré (HT1, fourni par Illumina) en combinant 996 ul HT1 et 4 pl dénaturé bibliothèque pour une concentration finale de 12 heures. Placez les bibliothèques dénaturées et dilué sur la glace. </li><li> Inverser chaque rangée de tubes de la plaque CBOT,faire en sorte que tous les réactifs sont décongelées. Centrifuger la plaque, enlever / percer les joints bandes et charger sur le CBOT. </li><li> Aliquote de 120 ul dilués et bibliothèques dénaturées à un tube de bande, étiqueté 1-8. Ajouter 1,2 ul diluée, bibliothèque dénaturé contrôle PhiX (à partir de Illumina) dans chaque tube comme un pic en contrôle. Vortex et centrifuger les tubes et les charger sur le CBOT dans le bon sens (tube n ° 1 à droite). </li><li> Chargez une cellule d&#39;écoulement et le collecteur sur le CBOT. </li><li> Terminer le flux de vérifier et de commencer la course de clustering. </li><li> Après la course est terminée, vérifiez distribution de réactifs à travers toutes les voies. Prenez note de toutes les anomalies. Soit commencer l&#39;exécution de séquençage immédiatement ou stocker la cellule d&#39;écoulement dans le tube muni à 4 ° C. </li><li> Décongeler le séquençage par synthèse (SBS, Illumina) réactifs. </li><li> Chargez les réactifs aux endroits appropriés sur les plateaux de réactifs, en veillant à ne pas toucher les autres réactifs après avoir touché le mélange clivage. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un pascellule d&#39;écoulement n-séquençage (celle qui a été séquencé précédemment), prime les lignes de réactifs à deux reprises. </li><li> Bien nettoyer la cellule d&#39;écoulement séquençage avec EtOH à 70% et Kimwipes, suivie d&#39;EtOH à 70% et du papier pour objectif. Inspectez la cellule d&#39;écoulement pour d&#39;éventuelles traces. Re-nettoyez-le si nécessaire. </li><li> Charger la cellule d&#39;écoulement sur le séquenceur et effectuer un écoulement de vérifier que l&#39;étanchéité entre le collecteur et la cuve à circulation est serré. </li><li> Lancer le cycle de séquençage. </li><li> Évaluer les mesures de qualité (par exemple, la densité du cluster, les grappes passent filtre, Q30, intensité) dès qu&#39;ils sont disponibles pendant la course. </li><li> Contrôler l&#39;intensité tout au long de la course. </li><li> Après 101 cycles sont terminés, effectuez la chimie de redressement pour terminer la deuxième lecture: Décongeler les réactifs finaux jumelés et le tampon seconde lecture Incorporation (ICB, une composante de l&#39;réactifs SBS, Illumina) et charger les réactifs. </li><li> Continuer le long de séquençage, l&#39;évaluation de 2 ème lecture d&#39;intensité, un Q30nd mesures de qualité d&#39;autres que l&#39;on avance l&#39;exécution. </li></ol> 3. Analyse des données <ol><li> Utilisez la dernière version de CASAVA (Illumina, actuellement 1.8.2) pour convertir les fichiers d&#39;appel de base (. Bcl) des fichiers à fichiers. Fastq, la mise en fastq-cluster-comptage à 0 pour assurer la création d&#39;un fichier unique fastq pour chaque échantillon . Décompressez les fichiers fastq pour l&#39;analyse en aval. </li><li> Effectuez un alignement fin jumelé avec les dernières versions de TopHat (1.4.1) 5, qui aligne ARN-seq lit de mammifères de taille des génomes en utilisant l&#39;ultra haut débit aligneur à court de lecture (Bowtie, 0.12.7) 6 et samtools (0,1. 17) 7. Samtools met en œuvre divers utilitaires pour le post-traitement des alignements au format SAM. Le transcriptome humain de référence peuvent être téléchargés à partir iGenomes ( <a href="http://www.illumina.com" target="_blank">www.illumina.com</a> ). En cours d&#39;exécution TopHat, nous avons utilisé tous les paramètres par défaut, y compris l&#39;option de type bibliothèque fr-unstranded (par défaut). </li><li> Noustion de la CuffDiff programme, une partie des boutons de manchette (1.3.0) 8 progiciel, comparez les cellules traitées par la thrombine dans les cellules contrôles pour éliminer les transcrits des gènes différentiellement exprimés dans l&#39;ancienne base de référence sur le transcriptome humain. Cette comparaison détecte l&#39;expression différentielle des transcrits connus. Utilisez Microsoft Excel pour visualiser le résultat sous forme de tableau. En exécutant le programme Boutons de manchette, nous avons utilisé tous les paramètres par défaut. Ces transcrits du gène avec FPKM &lt;0,05 et p&gt; 0,05 sont filtrés. </li><li> Pour détecter les nouvelles isoformes, exécutez Boutons de manchette sans transcriptome de référence. Comparer les fichiers de transcription échantillon de référence à l&#39;aide du génome Cuffcompare et tester l&#39;expression différentielle avec Cuffdiff combinées en utilisant les fichiers de transcription thrombine comme le génome de référence pour une analyse et les fichiers combinés de contrôle de transcription que le génome de référence pour une analyse secondes. Utilisez Microsoft Excel pour visualiser le résultat sous forme de tableau. Encore une fois, thostranscrits du gène électroniques avec FPKM &lt;0,05 et p&gt; 0,05 sont filtrés. Après cette étape, les enquêteurs peuvent choisir de télécharger une liste des transcriptions nouvellement signalés sur le site UCSC Genome Browser ( <a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/</a> ) pour vérifier leur validité par une inspection manuelle. </li><li> Présenter des listes de gènes différentiellement exprimés à Ingenuity Pathway Analysis (IPA, <a href="www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com</a> ) pour la caractérisation des gènes et les voies affectées par le traitement thrombine. Dans cette étape, les enquêteurs peuvent choisir d&#39;utiliser ceinture ( <a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">http://compbio.mit.edu/cummeRbund/</a> ), un package R qui est conçu pour faciliter et simplifier la tâche d&#39;analyser Boutons de manchette ARN-seq sortie, pour aider à gérer, visualiser et d&#39;intégrer toutes les données produites par une analyse Cuffdiff. </li></ol> 4. Validation des résultats par RNA-Seq quantitative en temps réel-PoChain Reaction lymerase (qRT-PCR) <ol><li> Effectuer totale isolement d&#39;ARN à partir de la thrombine et de contrôle traités par HMVEC-LBL cellules, l&#39;ARN et d&#39;évaluation de la qualité de quantification d&#39;ARN décrit dans les stades 1,4 à 1,6. </li><li> Générer ADN complémentaire de 1 ug d&#39;ARN totaux de chaque échantillon avec SuperScript III du premier volet Kits de synthèse RT système, suivant les instructions du fabricant (Invitrogen, 18080-051). </li><li> Effectuer qRT-PCR sur une analyse Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time System PCR en utilisant Taqman-on-Demand oligonucléotides conçus pour la détection des CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -associated factor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) et β-actine (ACTB, Hs99999903_m1). Chaque échantillon a eu un modèle équivalent à 5 ng d&#39;ARN total. Mesurer la quantification en utilisant la méthode DDCT et normaliser la β-actine. Chaque essai a été effectué sur au moins trois biologique répétitions. </li></ol>

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li>
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<li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat%3A+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25(2009).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li>
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<li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Working with RNA.</a> Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+and+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">De novo assembly and analysis of RNA-seq data.</a> Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).</li>
<li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li>
<li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transcriptome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les étapes clés Manipulation d&#39;ARN: RNases se dégrade, même les plus de haute qualité d&#39;ARN, donc il faut faire attention lors de l&#39;isolement, le stockage et l&#39;utilisation de l&#39;ARN 10. Les gants sont toujours portés afin de prévenir la contamination par des RNases trouvés sur les mains de l&#39;homme. Les gants doivent être changés souvent, surtout après la peau toucher, les poignées de porte ou d&#39;autres surfaces communes. Un ensemble de pipet...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> Réactifs ou équipements </td><td width="85"> Entreprise </td><td width="185"> Numéro de catalogue </td><td width="359"> Commentaires </td></tr><tr><td> Cellules humaines endothéliales microvasculaires pulmonaires </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, Kit Bullet </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> Contient EGM-2, FBS, des facteurs de croissance et des antibiotiques </td></tr><tr><td> La thrombine </td><td> Sigma </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion mir Vana Kit </td><td> Life Technologies </td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-Zap </td><td> Life Technologies </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens ARN </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> Préparation d&#39;ARN TruSeqTrousse </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Perles AMPureXP </td><td> Beckman Coulter </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> Superscript II de la transcriptase inverse </td><td> Life Technologies </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion ADN 1K </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect Sybergreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE Cluster Génération Kit </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX Kit de contrôle </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Cycle SBS Kit </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> machine à qPCR - Viia7 </td><td> Life Technologies </td><td> Modèle # VIIA7 / Equipement # 10631261 </td><td> Ou équivalent </td></tr><tr><td> Système Experion </td><td> Bio Rad </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer est un système alternatif </td></tr><tr><td> Spectrophotomètre </td><td> Bio-Tek </td><td> Spectrophotomètre pour microplaques Epoch </td><td> Ou équivalent </td></tr><tr><td> Centrifugeuse - Sorvall Legend XTR </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004521 </td><td> Ou équivalent </td></tr><tr><td> Support magnétique </td><td> Life Technologies </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96-bien thermocycleur </td><td> Fournisseur General Lab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 3. Liste des réactifs et des clés E Majorquipement. * Dans la vidéo, au lieu de HiSeq1000 HiScanSQ a été démontrée. </td></tr></tbody></table>

arn-seq analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

La caractérisation de l&#39;expression des gènes dans les cellules via la mesure des niveaux d&#39;ARNm est un outil utile pour déterminer comment la machinerie transcriptionnelle de la cellule est affectée par des signaux externes (traitement médicamenteux, par exemple), ou comment les cellules diffèrent entre un état ​​sain et un état ​​pathologique. Avec l&#39;avènement et le raffinement continu de la technologie de l&#39;ADN de la prochaine génération de séquençage, séquençage de l&#39;ARN (ARN-seq) est devenue une méthode de plus en plus populaire de l&#39;analyse du transcriptome de cataloguer toutes les espèces de transcriptions, de déterminer la structure de la transcription de tous les gènes exprimés et à quantifier les niveaux d&#39;expression de l&#39;évolution de l&#39;ensemble total de transcrits dans une cellule donnée 1,2, tissu ou organisme. ARN-seq remplace progressivement les puces à ADN comme une méthode pratique pour l&#39;analyse du transcriptome, car il a les avantages de profilage d&#39;un transcriptome complet, offrant une donnée de type numérique (nombre de copies de la transcription) et ne comptez sur aucune séquentielle génomique connueCe 3. Ici, nous présentons un protocole complète et détaillée à appliquer ARN-seq pour transcriptomes profil de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec ou sans traitement thrombine. Ce protocole est basé sur notre étude publiée récemment intitulé «RNA-seq révèle transcriptome Novel des gènes et de leurs isoformes de l&#39;homme dans les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traités par la thrombine,&quot; 4, dans lequel nous avons réussi a effectué la première analyse complète du transcriptome de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traité avec de la thrombine en utilisant l&#39;ARN-seq. Elle a abouti à des ressources sans précédent pour de nouvelles expérimentations afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la thrombine dysfonction endothéliale dans la pathogénie des maladies inflammatoires, le cancer, le diabète et les maladies coronariennes, et fournit de nouvelles pistes potentielles pour cibles thérapeutiques pour ces maladies. Le texte descriptif de ce protocoleest divisé en quatre parties. La première partie décrit le traitement de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec la thrombine et d&#39;isolement d&#39;ARN, analyse de la qualité et de quantification. La deuxième partie décrit la construction de bibliothèques et de séquençage. La troisième partie décrit l&#39;analyse des données. La quatrième partie décrit un essai de validation par RT-PCR. Les résultats représentatifs de plusieurs étapes clés sont affichés. Conseils utiles ou les précautions à stimuler le succès dans les étapes clés sont fournis dans la section Discussion. Bien que ce protocole utilise de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires traitées avec de la thrombine, elle peut être généralisée à transcriptomes de profil dans les deux cellules de mammifères et non mammifères et dans les tissus traités avec différents stimuli ou des inhibiteurs, ou pour comparer les transcriptomes dans des cellules ou des tissus entre un état de santé et un état de maladie.

Pour l&#39;étape 1: L&#39;28s: 18s rapport est traditionnellement utilisé comme un indicateur de la dégradation de l&#39;ARN. Idéalement, le pic 28s devrait avoir environ deux fois la surface de la bande 18 (un ratio de 2), mais cette proportion idéale n&#39;est pas souvent vu dans la pratique. En outre, 28s: 18s ratios obtenus à partir de méthodes spectrophotométriques peut sous-estimer l&#39;importance de la dégradation de l&#39;ARN. Pour plus de précision quantifier la dégradation, et donc la qualité...

Ce protocole présente une procédure complète et détaillée à appliquer ARN-seq, une puissante technologie de l&#39;ADN de la prochaine génération de séquençage, de transcriptomes profil de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires avec ou sans traitement thrombine. Ce protocole est généralisable à différentes cellules ou des tissus affectés par différents réactifs ou états pathologiques.

ARN-seq Analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de l&#39;homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

L’objectif global de cette procédure est de présenter un processus complet et détaillé pour appliquer RNA-Seq, une puissante technologie de séquençage de l’ADN de nouvelle génération, pour profiler les transcriptomes. Pour ce faire, il suffit d’isoler d’abord l’ARN total des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines avec ou sans traitement à la thrombine et de vérifier la qualité de l’ARN. La deuxième étape consiste à construire des banques d’ADN à partir de ces échantillons d’ARN.Simplifiez la génération de clusters à l’aide de l’instrument cbot et effectuez la tâche de séquençage de l’ADN sur le HighSeq 1000. Ensuite, l’analyse des données est effectuée pour identifier et afficher les transcrits de gènes exprimés de manière différentielle. La dernière étape consiste à valider les résultats RN aeq par RT TP CR. Le principal avantage de la CI par rapport aux méthodes existantes telles qu’une micropuce d’ADN pour l’analyse du transcriptome est que la CI peut profiler un transcriptome complet, fournir des données de type numérique et ne pas s’appuyer sur une génomique connue de l’expression génique dans les cellules.Alors que la mesure du niveau d’ARM est un outil

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Nous présentons une approche pour purifier l'ARNm ribosome-lié des cellules endothéliales vasculaires (ECs) directement dans le cerveau de souris, poumon et tissus cardiaques par l'intermédiaire de l'étiquette génétique EC-spécifique de la protéine verte améliorée de fluorescence (EGFP) dans des ribosomes en combination avec la purification d'ARN .

Traduire Ribosome Affinity Purification (TRAP) pour l'isolement de l'ARN des cellules endothéliales in vivo

Nous présentons un modèle in vitro de maladie vasculaire pour étudier des interactions de sang entier avec l’endothélium patient-dérivé. Ce système permet l’étude des propriétés thrombogéniques des cellules endothéliales primaires dans diverses circonstances. La méthode est particulièrement adaptée pour évaluer la thrombogénicité in situ et la thérapie anticoagulation pendant les différentes phases de la coagulation.

Modèle de maladie microfluidique in vitro pour étudier les interactions endoteléliales du sang entier et la dynamique des caillots sanguins en temps réel

Le protocole décrit l’isolement, la culture et le profilage des cellules endothéliales de l’artère mésentérique humaine. En outre, une méthode est fournie pour préparer l’artère humaine à la transcriptomique spatiale. La protéomique, la transcriptomique et les tests fonctionnels peuvent être effectués sur des cellules isolées. Ce protocole peut être réutilisé pour n’importe quelle artère de taille moyenne ou grande.

Isolement et profilage des cellules endothéliales artérielles mésentériques primaires humaines au niveau du transcriptome

Ce protocole décrit un flux de travail allant des cultures cellulaires ex vivo ou in vitro au prétraitement des données transcriptomiques pour un criblage rentable de médicaments basés sur le transcriptome.

Dépistage de drogues basé sur la transcriptomique rentable

Ce protocole inclut un flux de travail étape par étape pour les échantillons vasculaires calcifiés : manipulation tissulaire, décalcification, validation de l’ARN, détection des niveaux de calcification et stratégies de sélection des régions d’intérêt sur le Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). L’objectif est de présenter une méthode complète pour préserver la morphologie des tissus vasculaires et l’ARN afin d’une analyse transcriptomique spatiale fiable.

Préparation et traitement des artères calcifiées avec morphologie et ARN préservés pour le profilage spatial numérique

Ce travail décrit un test microfluidique qui utilise la contrainte de cisaillement pour déclencher la formation de thrombus dans le sang et caractérise le thrombus par plusieurs dimensions de lecture. Ce test peut mesurer la tendance prothrombotique des échantillons sanguins, et est donc utile pour le diagnostic des maladies, la découverte de médicaments, ainsi que pour les études mécanistes fondamentales liées à la thrombose.

Analyse de profilage de thrombus : une plateforme basée sur la microfluidique pour caractériser de manière exhaustive la thrombogenèse biomécanique

Apprenez le protocole RNA-seq pour profiler les transcriptomes de cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires humaines traitées à la thrombine. Cette méthode permet d'identifier les gènes différentiellement exprimés et de valider les résultats par RT-PCR.

ARN-seq Analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de lhomme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (Vidéo) | JoVE Journal

ARN-seq Analyse des transcriptomes de thrombine traitée et de contrôle de l'homme des cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires

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