Trans-vivo de type hypersensibilité retardée test pour le règlement spécifique de l'antigène

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser le test DTH trans vivo pour surveiller à la fois les réponses spécifiques aux antigènes pro- et anti-inflammatoires chez des sujets humains. Tout d'abord, isoler les cellules mononucléées du sang périphérique à partir du sang périphérique du sujet humain. Ensuite, mélanger la préparation de PBMC avec du PBS.

Antigène de rappel, antigène de test et antigène de test plus antigène de rappel. Effectuez les mesures préliminaires des coussinets plantaires et injectez les mélanges préparés dans des souris. Répétez les mesures des coussinets plantaires 24 heures plus tard. Trois.

Des profils définis de réponses DTH peuvent être régulatrices, non régulatrices ou sensibilisatrices. Le test de l’hypersensibilité retardée trans vivo peut être utilisé pour déterminer des paramètres cliniques tels que les réponses allo-réactives, où la source de l’antigène est constituée des cellules du donneur de greffe. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes in vitro existantes réside dans la possibilité de détecter facilement, à l’aide d’un seul système d’essai, à la fois les réponses pro-inflammatoires et régulatrices dirigées contre des allo-antigènes, des auto-antigènes ou des antigènes tumoraux.

Egon, un chercheur de mon laboratoire, va maintenant démontrer la procédure en utilisant du sang périphérique humain frais recueilli dans des tubes contenant du citrate-citrate de dextrose pour éviter l'activation des plaquettes. Isoler les PBMC à l’aide de milieu de séparation des lymphocytes selon les méthodes standard. Laver la préparation de PBMC avec du PBS pour éliminer les plaquettes contaminantes.

Si une contamination par des globules rouges est notable, procéder à la lyse des cellules rouges à l'aide d'un tampon de lyse CK. Effectuer ensuite deux autres lavages avec du PBS Resus. Suspendre les PBMC dans du PBS à une concentration de 10 millions de PBMC par millilitre pour l'antigène allogénique.

Commencez par les BMC provenant du sang périphérique du donneur, isolés à l'aide de la procédure décrite précédemment. Ensuite, resuspendez les cellules du donneur dans du PBS à une concentration de 120 millions de cellules par millilitre et ajoutez un micromolaire de PMSF afin de prévenir la dégradation des protéines.

Effectuez maintenant la sonication de la suspension cellulaire en utilisant sept impulsions d'une seconde avec une sonde de deux millimètres. À l’aide d’un hémocytomètre, vérifiez la rupture de plus de 90 % des cellules.

Ensuite, centrifuger le mélange à 14 000 tr/min à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Transférer soigneusement le surnageant dans deux tubes à verrouillage sécurisé et déterminer la concentration en protéines par des méthodes standard pour chaque injection. Répartir sept fois 10 à la puissance six PBMC dans deux millilitres.

Les tubes Safe Lock pelletent les cellules par centrifugation. Préparez d'abord une suspension témoin négative de PBMC dans 35 microlitres de PBS. Ensuite, pour le témoin positif, ajoutez 25 microlitres d'un antigène de rappel, toxine tétanique, toxoïde diphtérique, et ajustez le volume d'injection à 35 microlitres avec du PBS.

Conformément au plan expérimental visant à évaluer la réponse spécifique au donneur, resuspendre le culot cellulaire dans 10 microlitres d'antigène du donneur plus 25 microlitres de PBS, pour un volume total de 35 microlitres. Pour évaluer la régulation spécifique à l'antigène du donneur dans le cadre de l'expérience, resuspendre le culot cellulaire dans 35 microlitres en ajoutant 10 microlitres d'antigène du donneur et 25 microlitres d'antigène de rappel TT DT. Après anesthésie, placer un pied à coulisse à ressort au centre d'une coussinette plantaire chez la souris anesthésiée à l'isoflurane, une extrémité touchant la dernière coussinette de marche du pied, afin d'établir un repère permettant de maintenir constant le site de mesure une fois la lecture du dispositif stabilisée.

Enregistrez l'épaisseur de base de la plante du pied pour l'injection dans la plante du pied. Placez la seringue de manière à ce que l'aiguille soit orientée vers les orteils et que le tranchant soit dirigé vers le haut. Procédez maintenant à des injections sous-cutanées de chaque suspension cellulaire dans les plantes des pieds postérieurs de la souris.

Numéro un, injecter lentement la coussinette du pied droit avec la préparation témoin négative. Ensuite, injecter la coussinette du pied gauche avec le témoin positif constitué des PBMC plus le TT dt. Remettre ensuite la souris dans sa cage.

Deuxièmement, injecter le coussinet plantaire droit avec des PBMC associés à un antigène allogénique et le coussinet plantaire gauche avec des PBMC associés à un antigène allogénique et au TT dt. S'assurer qu'il n'y a pas de fuite 18 à 24 heures après l'injection. Anesthésier chaque souris à l'isoflurane et répéter la mesure du gonflement du coussinet plantaire.

Soustrayez l'épaisseur de chaque patte avant l'injection de la valeur post-injection afin d'obtenir la valeur d'œdème de la patte. Calculez ensuite l'œdème net spécifique à l'antigène en soustrayant la valeur d'œdème de la patte témoin des valeurs d'œdème des pattes obtenues après les traitements. Vérifiez la lecture du témoin positif en recherchant une réponse du témoin positif à l'antigène de rappel TT DT supérieure ou égale à 25 fois 10 à la puissance moins quatre pouces.

Une réponse de fond au PBS est requise pour que le test soit considéré comme valide. Ensuite, déterminer l'inhibition des réponses de rappel en présence d'antigènes donneurs. Cette expérience évalue les receveurs de greffe rénale pour la réponse spécifique aux antigènes donneurs et pour la régulation.

Il existe trois principaux profils d'hypersensibilité de type retardé chez les receveurs de greffe : régulateur, non régulateur et sensibilisé. Tous les patients ont réagi fortement à l'antigène de rappel tt utilisé comme contrôle positif. Le patient numéro 62 présente le profil régulateur, caractérisé par une faible réponse à l'antigène donneur et une suppression liée marquée de la réponse à l'antigène de rappel en présence de l'antigène donneur.

Ce schéma est celui qui a été associé à la tolérance aux greffes d'organes allogéniques. Le patient numéro 48 présente un schéma non régulateur, caractérisé par une réponse faible à l'égard du donneur, mais sans suppression liée. Ce schéma a été fréquemment observé chez des patients sous traitement immunosuppresseur.

Le patient numéro huit présente un profil de sensibilisation au donneur caractérisé par une forte réponse à l'antigène du donneur et l'absence de suppression liée. Cette réponse est associée au rejet de la greffe. Dans des études de cas cliniques, les CBC du donneur provenant de sujets inclus dans un essai observationnel ont été analysés pour évaluer les réponses spécifiques au donneur par voie indirecte, les réponses des lymphocytes T effecteurs et régulateurs T, afin de déterminer le rôle de la régulation spécifique au donneur dans la tolérance clinique.

Les réponses tectorielles indirectes aux antigènes du donneur révèlent un spectre distinct parmi les groupes inclus. L'œdème de la pulpe augmente au fur et à mesure que l'état clinique du patient évolue de la tolérance vers le rejet chronique. Ici, le test de suppression liée mesure la voie indirecte anti-donneur de la réponse des lymphocytes T régulateurs.

Ces données montrent une diminution des réponses régulatrices au fur et à mesure que l'on passe des patients les plus tolérants aux patients chroniquement rejetants les moins tolérants, en passant par les sujets intermédiaires. Pris ensemble, la régulation immunitaire mesurée par le test de DTH trans vivo semble constituer un mécanisme important d'acceptation du greffon rénal.

Un domaine prometteur est l'application du test TDTH dans la surveillance de l'auto-immunité. Notre étude sur le rôle du collagène de type cinq dans le processus pathologique du syndrome de bronchiolite oblitérante (BOS) a révélé que le risque relatif le plus élevé de développement du BOS était observé chez les patients présentant une réponse positive au collagène. Cinq pbmc provenant de receveurs de greffe pulmonaire, mais pas de témoins sains ou du collagène.

Quatre patients atteints du syndrome du bon pasteur réactifs après une greffe rénale étaient fréquemment réactifs au collagène V. Le test TDTH peut également être utilisé pour évaluer la réactivité des PBMC provenant de patients cancéreux face à des antigènes spécifiques de tumeur. Par exemple, la présence de cellules T régulatrices spécifiques de l'antigène PAP chez des patients atteints d'un cancer de la prostate pourrait limiter la réponse à une vaccination avec l'antigène PAP.

Le test DTH TRANSVAAL est un nouveau test diagnostique ayant une application clinique pour l'évaluation des réponses immunitaires à médiation cellulaire chez les patients transplantés, atteints de cancer ou d'affections auto-immunes. Il est précieux car il permet non seulement de surveiller les réponses de rappel des lymphocytes T effecteurs, mais aussi de détecter les réponses des lymphocytes T régulateurs, puisqu'il ne repose pas sur la mesure d'une cytokine particulière pour identifier les lymphocytes T effecteurs ou régulateurs. Ce test est très souple et largement applicable.