Trans-vivo de type hypersensibilité retardée test pour le règlement spécifique de l'antigène

Nous décrivons un test de diagnostic précieux qui pourrait être utilisé pour décider du retrait de l'immunosuppression après transplantation sans risque élevé de rejet du greffon. Le test utilise les principes de type hypersensibilité retardée et fournit une évaluation précise de ces deux réponses immunitaires effectrices et réglementaires spécifiques donneur supporté par les bénéficiaires.

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser le test DTH trans vivo pour surveiller les réponses spécifiques de l’antigène pro et anti-inflammatoire chez les sujets humains. Tout d’abord, isolez les cellules mononucléées du sang périphérique du sujet humain. Mélangez ensuite la préparation PBMC avec du PBS.

Antigène de rappel : antigène de test et antigène de test plus antigène de rappel. Procédez aux mesures préliminaires du coussinet plantaire et injectez les mélanges préparés dans les souris à patins. Les repose-pieds répètent les mesures 24 heures plus tard. Trois.

Les modèles définitifs de réponses DTH sont possibles, réglementaires, non réglementaires et sensibilisés. Le test d’hypersensibilité de type retardé trans vivo peut être appliqué pour déterminer des paramètres cliniques tels que les réponses allo-réagisses où la source de l’antigène est les cellules du donneur de greffe. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes in vitro existantes est qu’elle permet de détecter facilement les réponses pro-inflammatoires et régulatrices aux allo-antigènes, aux auto-antigènes ou aux antigènes tumoraux à l’aide d’un seul système de dosage.

Egon, un chercheur de mon laboratoire, va maintenant faire la démonstration de la procédure en utilisant du sang périphérique humain frais recueilli dans des tubes de citrate et de dextrose acide pour éviter l’activation plaquettaire. Isolez les PBMC à l’aide d’un milieu de séparation des lymphocytes selon les méthodes standard. Lavez la préparation PBMC avec du PBS pour éliminer les plaquettes contaminantes.

S’il y a une contamination notable des globules rouges, effectuez la lyse des globules rouges à l’aide d’un tampon de lyse CK. Effectuez ensuite deux autres lavages avec PBS Resus. Suspendre la PBMC dans le PBS à une concentration de 10 millions de PBMC par millilitre pour l’allo antigène.

Commencez par les BMC P, isolés du sang périphérique du donneur en utilisant la procédure décrite précédemment. Puis réanimation. Suspendez les cellules du donneur dans le PBS à une concentration de 120 millions de cellules par millilitre et ajoutez une micromolaire de PMSF pour empêcher la dégradation des protéines.

Maintenant, sonisez la suspension cellulaire à l’aide de sept impulsions d’une seconde avec une sonique sonique de deux millimètres. À l’aide d’un hémocytomètre. Vérifiez la perturbation de plus de 90 % des cellules.

Ensuite, centrifugez le mélange à 14 000 tr/min à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Transférez soigneusement le surnageant dans un tube à deux verrous sûrs et déterminez la concentration en protéines par des méthodes standard pour chaque injection. Aliquote sept fois 10 puissance six P BMC en deux millilitres.

Des tubes de verrouillage sûrs granulent les cellules par centrifugation. Tout d’abord, préparez la suspension de contrôle négatif de PBMC dans 35 microlitres de PBS. Ensuite, pour le contrôle positif, ajoutez 25 microlitres d’un antigène de rappel, tétanos, anatoxine, diphtérie, anatoxine, et ajustez le volume d’injection à 35 microlitres avec PBS.

Selon le plan expérimental d’évaluation de la réponse spécifique du donneur, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 microlitres d’antigène du donneur plus 25 microlitres de PBS pour un volume total de 35 microlitres. Pour évaluer la régulation expérimentale spécifique de l’antigène du donneur, resus suspend la pastille cellulaire dans 35 microlitres en ajoutant 10 microlitres d’antigène du donneur et 25 microlitres d’antigène TT DT de rappel. Après l’anesthésie, la souris à patins avec isof fluorine place un pied à coulisse à ressort au centre d’un repose-pieds avec un bord touchant le dernier coussinet de marche du pied pour fournir une référence pour maintenir le site de mesure cohérent lorsque la lecture de la jauge s’est stabilisée.

Enregistrez l’épaisseur de base du coussinet plantaire pour l’injection du coussinet plantaire. Placez la seringue avec l’aiguille pointée vers les orteils et le biseau vers le haut. Commencez maintenant les injections sous-cutanées de chaque suspension cellulaire dans les coussinets arrière de la souris.

Tout d’abord, injectez lentement le coussinet du pied droit avec la préparation du contrôle négatif. Ensuite, injectez le coussinet du pied gauche avec le contrôle positif de PBMC plus TT dt. Remettez maintenant la souris dans sa cage pour souris.

Deuxièmement, injectez dans le coussinet plantaire droit le PBMC plus l’allo antigène et le repose-pieds gauche avec le PBMC plus l’allo antigène plus TT dt. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite environ 18 à 24 heures après l’injection. Anesthésie chaque souris avec de l’isof fluorine et répète la mesure de l’enflure des coussinets plantaires.

Soustrayez l’épaisseur de chaque coussinet plantaire avant l’injection de la valeur post-injection pour obtenir la valeur de gonflement du coussinet plantaire. Calculez ensuite le gonflement net spécifique de l’antigène en soustrayant la valeur de gonflement des coussinets de contrôle des valeurs de gonflement des coussinets obtenus à partir des traitements. Vérifiez que le témoin positif indique une réponse de contrôle positif pour rappeler l’antigène TT DT supérieur ou égal à 25 fois 10 puissance moins quatre pouces au-dessus.

Une réponse de fond au PBS est nécessaire pour que le test soit considéré comme valide. Ensuite, déterminez l’inhibition des réponses de rappel en présence d’antigènes donneurs. Cette expérience évalue la réponse spécifique de l’antigène du donneur chez les receveurs transplantés rénaux, ainsi que leur régulation.

Il existe trois principaux modèles d’hypersensibilité de type retardé chez les receveurs de greffe : réglementaire, non réglementaire et sensibilisé. Tous les patients ont fortement répondu au contrôle positif de l’antigène de rappel tt. Le patient numéro 62 présente un modèle régulateur caractérisé par une faible réponse à l’antigène du donneur et une suppression liée marquée à la réponse de l’antigène de rappel en présence de l’antigène du donneur.

C’est le modèle qui s’est avéré être associé à la tolérance à l’allogreffe d’organe. Le patient numéro 48 présente un modèle non régulateur, qui présente la caractéristique d’une réponse faible au donneur, mais pas de suppression associée. Ce schéma a été fréquemment observé chez les patients prenant des médicaments immunosuppresseurs.

Le patient numéro huit présente le profil sensibilisé du donneur, caractérisé par une réponse élevée à l’antigène du donneur et aucune suppression associée. Cette réponse est associée au rejet du greffon. Dans des études de cas cliniques, les BMC P de sujets inscrits à un essai observationnel ont été analysés pour la voie indirecte spécifique du donneur, l’effecteur T et les réponses régulatrices T afin d’évaluer le rôle de la régulation spécifique du donneur dans la tolérance clinique.

Les réponses indirectes de tector aux antigènes du donneur révèlent un spectre distinct entre les groupes d’inscription. L’enflure des coussinets plantaires augmente à mesure que l’état clinique du patient passe de ceux qui sont tolérants à ceux qui rejettent chroniquement. Ici, le test de suppression liée mesure la voie indirecte anti-donneur de la réponse régulatrice T.

Ces données montrent une diminution des réponses régulatrices sur la gamme des patients les plus tolérants aux patients présentant un rejet chronique intermédiaire à moins tolérant. Pris ensemble. La régulation immunitaire mesurée par le test DTH trans vivo semble être un mécanisme important pour l’acceptation de l’allogreffe rénale.

Un domaine prometteur est l’application du test TDTH dans la surveillance de l’auto-immunité. Notre étude du rôle du collagène de type cinq dans le processus pathologique de la bronchiolite syndrome OBL a révélé que le risque relatif le plus élevé de développement du BOS était observé chez les patients présentant une réponse positive au collagène. Cinq pbmc provenant de receveurs de greffe de poumon, mais pas de témoins sains ou de collagène.

Quatre réactifs Syndrome du bon pâturage Les patients après une greffe rénale étaient fréquemment collagène cinq réactifs. Le test TDTH peut également être utilisé pour tester la réactivité de la pbmc chez les patients cancéreux envers des antigènes spécifiques de la tumeur. Par exemple, la présence de cellules T régulatrices spécifiques de PAP chez les patients atteints de cancer de la prostate peut limiter la réponse à la vaccination avec l’antigène PAP.

Le test TRANSVAAL DTH est un nouveau test de diagnostic ayant une application clinique dans l’évaluation des réponses immunitaires à médiation cellulaire chez les patients atteints de cancer et auto-immuns en greffe. Il est précieux car il est non seulement utile pour surveiller les réponses de rappel des effecteurs, mais il peut également être utilisé pour détecter les réponses régulatrices T car il ne repose pas sur une mesure de cytokine particulière pour détecter l’effet ou les cellules T régulatrices. Il est très souple et largement applicable.