Néonatale électroporation zone sous-ventriculaire

Le but de cette procédure est de marquer génétiquement et de manipuler les constituants moléculaires des cellules souches neurales de la zone sous-ventriculaire. Ceci est accompli en insérant d’abord une pipette en verre chargée d’ADN dans le ventricule latéral d’un P zéro P.La deuxième étape consiste à expulser l’ADN dans le liquide céphalo-rachidien du ventricule latéral. Le courant suivant est appliqué au P.Cela permet le transfert de l’ADN vers les cellules souches neurales qui tapissent les ventricules latéraux.

En fin de compte, une combinaison de techniques moléculaires, notamment l’immunohistochimie, la biologie moléculaire, la microscopie et l’électrophysiologie, est utilisée pour visualiser les changements de destin, de prolifération, de migration et de maturation des cellules souches neurologiques de la zone sous-ventriculaire. L’électroporation de la zone sous-ventriculaire néonatale peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la neurogenèse, telles que les voies moléculaires responsables de la régulation de la prolifération, de la différenciation, de la migration et de la maturation des cellules souches neuronales et de leur descendance. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les souris transgéniques, est qu’elle permet le marquage rapide et robuste des cellules souches neuronales de la SVZ de manière efficace et rentable.

Tout d’abord, assurez-vous que l’ADN de l’électropurate est d’une pureté et d’une concentration élevées et qu’il est exempt d’endotoxines. Tirez des tubes capillaires en verre de silice BO poli au feu de 10 centimètres dans des pipettes. Un extracteur de pipette PP huit 30 ghhi PC 10 réglé pour tirer une traction lestée en un pas à 70,5 degrés Celsius est utilisé ici Après avoir tiré la pipette, utilisez une pince circulaire pour casser la pointe.

Ensuite, inspectez la pipette sous un microscope à dissection pour vous assurer qu’il n’y a pas de bords déchiquetés. Si nécessaire, la pointe peut être biseautée à l’aide d’une meule. Placez ensuite les pipettes coulées sous une lampe UV pendant 15 minutes.

Une fois les 15 minutes écoulées, marquez la pipette à deux millimètres du bord de la pointe avec un marqueur à pointe fine. Enfin, préparez une solution verte rapide de 0,1 poids par volume en mélangeant une solution saline stérile filtrée à 0,9 % avec un anesthésique vert sec et rapide. Un chiot âgé de zéro à un jour, une boîte de Pétri en verre pré-refroidie à quatre degrés Celsius et placée sur de la glace ouest Après environ cinq minutes, déterminez l’état d’anesthésie en utilisant la réponse de pincement du pied.

Si aucun mouvement ne se produit, commencez l’injection intraventriculaire. Combinez la solution verte rapide avec la solution d’ADN et aliquote un à deux microlitres sur le biofilm. Il est important de le faire juste avant l’injection, car la combinaison d’une solution verte rapide et d’ADN peut entraîner une évaporation et une cristallisation rapides avec le blocage ultérieur des pipettes en verre, aspirer tout le volume de l’aliquote avec une seringue à microfilm et charger la pipette en verre sur un injecteur à air comprimé

Maintenant, saisissez et tenez doucement la tête du chiot entre le pouce et l’index de la dernière main dominante. Allumez ensuite la lampe et tenez la tête du chiot juste à l’extérieur du faisceau lumineux. Si les ventricules ne sont pas clairement visibles, humidifiez la tête avec une solution saline stérile pour aider à réduire la quantité de lumière réfléchie par le cuir chevelu.

Ensuite, à l’aide de la main dominante, insérez l’aiguille dans le ventricule latéral du côté proche. Le site d’injection doit être à peu près équidistant de la suture de l’OID et de l’œil, et à deux millimètres latéralement de la suture sagittale. Insérez la pipette tirée jusqu’à la marque des deux millimètres pour un pop P zéro, ce qui devrait assurer la pénétration dans le ventricule latéral.

Le remplissage du LCR dans la pipette peut se produire en raison de la libération de la pression intracrânienne. Si cela se produit, desserrez la prise sur la tête du POP pour réduire la pression et aider à l’injection du plasmide. Une fois la pipette insérée de manière optimale, injectez environ 0,5 microlitre de plasmide dans le ventricule latéral.

Réglez la tension du générateur d’électro-fonctionnement sur cinq impulsions carrées, 50 millisecondes par impulsion et 100 volts avec des intervalles de 50 millisecondes. La spécificité spatiale du fonctionnement de l’électrolyse plasma est donnée par la direction du transfert de charge, de sorte qu’il faut tenir compte de l’emplacement des électrodes compte tenu de la diversité des cellules de la SVZ. Des personnes ont signalé des changements en termes de destin cellulaire et de prolifération dans les emplacements dorsaux ventraux à l’UAC.

Après l’injection du trempage plasmidique, la pince à épiler s’électrode dans le PBS pour maximiser le transfert de charge et aider à prévenir les brûlures causées par la résistivité. Ensuite, placez l’électrode positive sur la paroi latérale dorsale du crâne près de l’oreille et plongez la latérale à l’injection de cytoplasme. Placez ensuite l’électrode négative sur l’hémisphère controlatéral ventral latéral au museau pop.

Cette figure montre l’orientation correcte des électrodes négatives et positives par rapport aux axes x, y, Z sur le petit injecté. Initiez le transfert de courant en appuyant sur la pédale de commutation à impulsions et balayez les électrodes de la dorsale à la latérale en utilisant des intervalles d’angle d’environ 25 degrés. Une fois l’électroporation terminée, placez tous les chiots électroporés sur un coussin chauffant pendant cinq minutes.

Faites pivoter doucement les chiots toutes les 30 secondes avec une légère stimulation. Cette image montre le ventricule latéral d’une souris néonatale 24 heures après l’électroporation d’un vecteur codant pour l’EGFP. Les cellules électro-notées deviennent fluorescentes en vert.

Ici, nous voyons le ventricule latéral marqué LV 28 jours après l’électroporation de la Cree Recombinase et de la GFP codant pour les plasmides chez les souris portant un code d’arrêt en amont de la tomate TD La recombinaison induit l’expression de la tomate TD observée en rouge, la dilution successive du plasmide résultant en quelques cellules SVZ EGFP positives restantes ou la tomate TD exprimée génomiquement est exprimée en permanence. La dilution du plasmide, l’ADN montré en vert est apparente étant donné que plus de cellules dans la couche cellulaire granulaire du bulbe olfactif étiqueté OB, exprimaient le marqueur génomique TD tomate montré en rouge. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de marquer et de manipuler les cellules souches de la SVZ.