Amplification linéaire d'une PCR - Localisation des éléments génétiques et caractérisation de Unknown ADN flanquant

L’objectif global de l’expérience suivante est d’identifier les positions exactes de l’intégration des vecteurs viraux dans le génome. Ceci est réalisé par une réaction PCR linéaire initiale avec des amorces biotinylées pour enrichir les séquences de jonction du génome du vecteur à partir de l’ADN génomique en phase solide dans une série de réactions, de l’ADN double brin avec des séquences d’ADN connues aux deux extrémités du produit sont générés, ce qui permet une amplification exponentielle des jonctions du génome du vecteur. Ensuite, des adaptateurs de séquençage sont incorporés aux produits PCR d’agneau.

Afin de séquencer et de caractériser l’ADN flanquant inconnu avec un séquençage profond, ces fragments révèlent les positions exactes des intégrations de vecteurs. Le résultat est une diversité de jonctions amplifiées observées par électrophorèse sur gel. Cette méthode donne un aperçu de la distribution des sites d’intégration du vecteur viral chez les patients atteints de thérapie génique clinique.

Il peut également être appliqué à d’autres études telles que l’insertion, la mutagénèse, les dépistages, l’infection virale, le cancer et la clonalité des cellules souches ou la diversité des cellules T. La procédure sera démontrée par ina RA, un technicien de mon laboratoire. Pour cette procédure, préparez d’abord les cassettes de liaison et mélangez 40 microlitres de chacun des deux Legos LCO avec 110 microlitres de chlorhydrate de tris et 10 microlitres de chlorure de magnésium dans un tube de micro-centrifugeuse. Ensuite, réglez le mélange pour qu’il incube sur un bloc de chaleur de 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez lentement à température ambiante pendant la nuit.

Le lendemain, ajoutez 300 microlitres d’eau dans l’ADN et filtrez-les sur un tube de micro-centrifugation. Faites tourner le filtre pour collecter l’ADN de liaison concentré dans l’ouit. Ensuite, récupérez l’ouit du filtre.

Ajouter 80 microlitres d’eau dans l’ouit et pipeter. 10 microlitres d’aliquotes dans des tubes PCR. Utilisez la PCR pour préamplifier les jonctions du génome du vecteur dans des tubes de réaction de 50 microlitres pour l’agneau.

Ajouter entre un nanogramme et un microgramme d’ADN d’échantillon par réaction de 50 microlitres. Pour l’agneau NR, utilisez au moins 100 nanogrammes d’ADN. N’ajoutez pas plus de 25 microlitres d’exécuter le PCR selon le tableau deux dans le texte.

Et une fois terminé, ajoutez 0,5 microlitre supplémentaire de technologie à chaque réaction et exécutez le programme PCR une deuxième fois. Tout d’abord, préparez les billes magnétiques. Ajoutez 20 microlitres de billes magnétiques recouvertes d’ENC streptect dans un tube de 1,5 millilitre et placez-les sur le séparateur de billes magnétiques pendant une minute à température ambiante.

Ensuite, jetez la relance surnageante. Suspendez les billes dans 40 microlitres de PBS avec BSA et remettez les billes sur le séparateur pendant une minute supplémentaire. Remplacez le surnageant par un lavage de 20 microlitres d’une solution de chlorure de lithium à trois molaires.

Et encore une fois, mettez les perles sur le séparateur pendant une minute. Terminez en remplaçant le surnageant par 50 microlitres de solution de chlorure de lithium à six molaires. Ajoutez maintenant le mélange de billes magnétiques au produit de la réaction PCR et laissez ce mélange incuber pendant deux heures à toute la nuit à température ambiante en secouant doucement.

L’ADN biotinylé et les talles de tava et enrobées formeront des complexes qui peuvent être stockés à quatre degrés Celsius jusqu’à quatre jours. Procéder avec de l’agneau ou de l’agneau NR En raison de sa grande sensibilité. L-A-M-P-C-R est sujet à la contamination s’il est exécuté attentivement.

Il s’agit d’un environnement de qualité PCR. Et une attention particulière à la propreté de la plus haute importance. Pour réussir à amplifier l’ADN flanquant inconnu sans contaminer les échantillons, exposez d’abord les complexes au séparateur pendant une minute et suspendez à nouveau les billes d’ADN dans 100 microlitres d’eau.

Ensuite, exposez les complexes au séparateur pendant une minute. Et cette fois, mettez en suspension les complexes de billes d’ADN dans un mélange avec 8,25 microlitres d’eau. Un microlitre de tampon nucléotidique HEXA, un quart de microlitre de D DN NTP et un demi-microlitre de cano polymérase.

Incuber ce mélange à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ajoutez ensuite 90 microlitres d’eau et exposez la réaction au séparateur pendant une minute supplémentaire. Ensuite, mettez en suspension les complexes de billes d’ADN dans un lavage d’eau de 100 microlitres.

Utilisez le séparateur pendant encore une minute et préparez la réaction de l’enzyme de restriction. Après avoir retiré le surnageant. Ajoutez 8,5 microlitres d’eau, un microlitre de tampon d’enzyme de restriction et un demi-microlitre d’enzyme de restriction.

Lors de la sélection de l’enzyme de restriction, assurez-vous qu’elle n’a pas de sites à l’intérieur ou en aval du site de liaison primaire utilisé dans la réaction d’amplification du preem. Après avoir laissé les enzymes réagir pendant une heure à la température idéale, ajoutez 90 microlitres d’eau. Utilisez un séparateur pendant une minute et remettez en suspension les complexes BDNA dans un lavage de 100 microlitres d’eau.

Répétez la séparation et préparez la réaction de ligature. Ajoutez aux billes cinq microlitres d’eau, un microlitre de 10 x tampon de liaison rapide. Un microlitre d’un TP, un microlitre d’ADN ligase à liaison rapide et un microlitre de la cassette de liaison fabriquée au début de la procédure.

Laissez cette réaction fonctionner pendant cinq minutes à température ambiante. Terminez la réaction en ajoutant 90 microlitres d’eau et en séparant les billes, puis en les lavant dans 100 microlitres d’eau. Et puis une autre séparation pour dénaturer l’ADN synthétisé : remettre les billes en suspension dans cinq microlitres d’hydroxyde de sodium normal 0,1, et laisser le mélange agiter pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, séparez les complexes pendant une minute et collectez la natine SUP, qui contient la jonction génomique du vecteur amplifié preem. Procédez immédiatement à l’amplification exponentielle ou stockez-la à moins 20 degrés Celsius. Commencez par exposer les complexes au séparateur pendant une minute.

Et resus en suspendant les billes d’ADN dans 100 microlitres d’eau. Et séparez-les à nouveau et retirez le surnageant. Pour la réaction de ligature, ajoutez 6,5 microlitres d’eau, un microlitre de circ Ligase, 10 x tampon de réaction.

Un demi-microlitre de chlorure de magnésium, un demi-microlitre de TP, un microlitre d’oligos de liaison SS et un demi-microlitre de cir ligase. Après une heure à 60 degrés Celsius, terminez la réaction avec 90 microlitres d’eau à l’aide du séparateur de billes Resus en suspendant les billes dans 100 autres microlitres d’un, en utilisant à nouveau le séparateur et en recueillant les complexes de lavage dans 10 microlitres d’eau. Commencez par préparer un mélange maître PCR comme décrit dans le tableau trois du texte.

Ajoutez 48 microlitres de mélange principal à deux microlitres de produits d’agneau ou d’agneau NR dans des tubes PCR de 200 microlitres et exécutez la PCR comme décrit dans le texte comme précédemment, préparez plus de billes et mettez-les en suspension dans six molaires de chlorure de lithium. Utilisez 20 microlitres pour l’agneau ou 50 microlitres pour l’agneau NR. Ajoutez ensuite des billes au même volume de produits de réaction PCR et incubez-les sur un agitateur à 300 tr/min pendant deux heures à toute la nuit à température ambiante, collectez le complexe de billes d’ADN et lavez-le avec 100 microlitres d’eau comme démontré précédemment.

Maintenant, suspendez le complexe dans de l’hydroxyde de sodium normal 0,1 et incubez les billes pendant 10 minutes à température ambiante sur un shaker. Ensuite, exposez les billes au séparateur pendant une minute et recueillez le surnageant contenant l’ADN amplifié dans un nouveau tube. En utilisant l’ADN amplifié comme modèle, utilisez deux microlitres de celui-ci pour effectuer une PCR comme décrit dans le tableau quatre du texte.

Visualiser les produits par électrophorèse sur gel pour purifier les produits. Mélangez 40 microlitres d’entre eux avec 44 microlitres de perles magnétiques XP pures à température ambiante, et incubez-les pendant cinq minutes. Séparez ensuite les perles pendant deux minutes sur l’aimant.

Après avoir retiré le surnageant, lavez les billes deux fois avec 200 microlitres d’éthanol à 70 %, puis remettez en suspension les billes et 30 microlitres d’eau à l’aide de 40 nanogrammes d’amorce de fusion d’ADNA. La PCR peut être utilisée pour ajouter des adaptateurs spécifiques au séquençage. On trouvera des précisions dans le tableau cinq.

Vérifiez les produits sur un gel. La visualisation des résultats de la PCR de l’agneau par électrophorèse sur gel à haute résolution est le meilleur choix d’analyse diagnostique en comparaison. Bien que 2 %aros fonctionne également, il ne fonctionne pas aussi bien.

Clonalité de l’agneau NR, les produits PCR ne peuvent pas être diagnostiqués visuellement. Un gel 2 %agros est cependant parfaitement suffisant pour déterminer le succès du protocole. Après le séquençage des produits de PCR, l’emplacement des vecteurs peut être trouvé dans le génome de l’hôte.

À partir de ces données, il est possible d’enregistrer les emplacements des sites d’insertion dans les régions de codage et à proximité des sites de début de transcription après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la thérapie génique pour explorer la biosécurité des vecteurs de transfert de gènes dans des modèles précliniques ainsi que dans des essais cliniques de thérapie génique.