Amplification linéaire d'une PCR - Localisation des éléments génétiques et caractérisation de Unknown ADN flanquant

L'objectif général de l'expérience suivante est d'identifier les positions exactes d'intégration des vecteurs viraux dans le génome. Cette identification est réalisée par une réaction initiale de PCR linéaire utilisant des amorces biotinylées afin d'enrichir les séquences de jonction entre le vecteur et le génome à partir d'ADN génomique, en phase solide, au cours d'une série de réactions. Des ADN double brin possédant des séquences connues aux deux extrémités du produit sont ainsi générés, permettant l'amplification exponentielle des jonctions entre le vecteur et le génome. Ensuite, des adaptateurs de séquençage sont incorporés aux produits de PCR lamb.

Afin de séquencer et de caractériser l'ADN flanquant inconnu par séquençage profond, ces fragments révèlent les positions exactes des intégrations du vecteur. Le résultat est une diversité de jonctions amplifiées, visible par électrophorèse sur gel. Cette méthode permet d'obtenir des informations sur la distribution des sites d'intégration du vecteur viral chez les patients bénéficiant d'une thérapie génique clinique.

Il peut également être appliqué à d'autres études, telles que les analyses d'insertion, de mutagenèse, d'infection virale, de cancer, de clonalité des cellules souches ou de diversité des lymphocytes T. La procédure sera démontrée par Ina RA, une technicienne de mon laboratoire. Pour cette procédure, préparez d'abord le mélange des cassettes d'adaptateurs : mélangez 40 microlitres de chacun des deux LCO Legos avec 110 microlitres de chlorure de tris et 10 microlitres de chlorure de magnésium dans un tube de microcentrifugeuse. Ensuite, placez le mélange à incuber sur un bloc chauffant à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis laissez refroidir lentement à température ambiante toute la nuit.

Le jour suivant, ajoutez 300 microlitres d'eau au brin double préparé de linker, d'ADN, et filtrez-les dans un tube de microcentrifugeuse. Faites centrifuger le filtre pour recueillir l'ADN linker concentré dans l'ouit. Ensuite, récupérez l'ouit à partir du filtre.

Ajouter 80 microlitres d'eau dans le ouit et prélever des aliquotes de 10 microlitres à l'aide d'une pipette dans des tubes PCR. Utiliser la PCR pour pré-amplifier les jonctions du génome vecteur dans des tubes à réaction de 50 microlitres pour l'agneau.

Ajoutez entre un nanogramme et un microgramme d'ADN d'échantillon par réaction de 50 microlitres. Pour l'ADN de l'agneau NR, utilisez au moins 100 nanogrammes d'ADN. N'ajoutez pas plus de 25 microlitres d'exécutez la PCR selon le tableau deux du texte.

Et une fois terminé, ajouter 0,5 microlitre supplémentaire de tech à chaque réaction et exécuter le programme de PCR une deuxième fois. Préparer d'abord les billes magnétiques. Ajouter 20 microlitres de billes magnétiques revêtues de strept ENC dans un tube de 1,5 millilitre et les placer sur le séparateur de billes magnétiques pendant une minute à température ambiante.

Ensuite, jetez le surnageant. Resuspendez les billes dans 40 microlitres de PBS avec du BSA et replacez les billes sur le séparateur pendant une minute supplémentaire. Remplacez le surnageant par une solution de lavage de 20 microlitres de chlorure de lithium à trois molaire.

Et à nouveau, placez les billes sur le séparateur pendant une minute. Terminez en remplaçant le surnageant par 50 microlitres de solution de chlorure de lithium à six molaire. Ajoutez maintenant le mélange de billes magnétiques au produit de la réaction PCR et laissez ce mélange incuber de deux heures à toute la nuit à température ambiante avec un agitation douce.

Les ADN biotinylés, les bandes et les billes revêtues formeront des complexes qui peuvent être conservés à quatre degrés Celsius pendant jusqu'à quatre jours. Poursuivre avec LAMP ou NR-LAMP en raison de sa grande sensibilité. La PCR par amplification médiée par boucle (LAMP) est sensible à la contamination si elle est réalisée sans attention.

C'est un environnement de qualité PCR. Une attention particulière à la propreté est d'une importance capitale. Afin d'amplifier avec succès l'ADN inconnu flanquant sans contaminer les échantillons, exposez d'abord les complexes au séparateur pendant une minute et resuspendez les billes d'ADN dans 100 microlitres d'eau.

Ensuite, exposez les complexes au séparateur pendant une minute. Cette fois, remettez en suspension les complexes d'ADN liés aux billes dans un mélange contenant 8,25 microlitres d'eau, 1 microlitre de tampon HEXA nucléotidique, un quart de microlitre de D DN NTPs et un demi-microlitre de cano polymérase.

Incuber ce mélange à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, ajouter 90 microlitres d'eau et exposer la réaction au séparateur pendant une minute supplémentaire. Puis, resuspendre les complexes de billes à ADN dans 100 microlitres d'eau de lavage.

Utilisez le séparateur pendant une minute supplémentaire et préparez la réaction avec l'enzyme de restriction. Après avoir retiré le surnageant, ajoutez 8,5 µL d'eau, 1 µL de tampon pour enzyme de restriction et 0,5 µL de l'enzyme de restriction.

Lors du choix de l'enzyme de restriction, assurez-vous qu'elle ne possède aucun site dans ou en aval du site de liaison de l'amorce utilisé lors de la réaction de préamplification. Après avoir laissé les enzymes réagir pendant une heure à la température idéale, ajoutez 90 microlitres d'eau. Utilisez un séparateur pendant une minute et remettez en suspension les complexes ADN dans un lavage de 100 microlitres d'eau.

Répétez la séparation et préparez la réaction de ligation. Ajoutez aux billes cinq microlitres d'eau, un microlitre de tampon 10 x fast link, un microlitre de TP, un microlitre de ligase DNA fast link et un microlitre du cassette d'adaptateur préparé au début de la procédure.

Laisser cette réaction se dérouler pendant cinq minutes à température ambiante. Mettre fin à la réaction en ajoutant 90 microlitres d'eau et en séparant les billes, suivis d'un lavage avec 100 microlitres d'eau. Puis effectuer une autre séparation afin de dénaturer l'ADN synthétisé : resuspendre les billes dans cinq microlitres d'hydroxyde de sodium 0,1 N et laisser le mélange agiter pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, séparez les complexes pendant une minute et récupérez le surnageant SUP, qui contient la jonction du génome viral pré-amplifié. Passez immédiatement à l'amplification exponentielle ou conservez à moins 20 degrés Celsius. Commencez par exposer les complexes au séparateur pendant une minute.

Et resuspendre les billes d'ADN dans 100 microlitres d'eau. Puis les séparer à nouveau et éliminer le surnageant. Pour la réaction de ligation, ajouter 6,5 microlitres d'eau, un microlitre de circ Ligase et du tampon de réaction 10 x.

Un demi microlitre de chlorure de magnésium, un demi microlitre de TP, un microlitre d'oligonucléotides linkers SS et un demi microlitre de cir ligase. Après une heure à 60 degrés Celsius, arrêter la réaction avec 90 microlitres d'eau en utilisant le séparateur de billes, resuspendre les billes dans 100 microlitres supplémentaires d'eau, utiliser à nouveau le séparateur et recueillir les complexes de lavage dans 10 microlitres d'eau. Commencer par préparer un mélange maître de PCR comme décrit dans le tableau trois du texte.

Ajoutez 48 microlitres de mélange maître à deux microlitres de produits d'agneau ou d'agneau NR dans des tubes PCR de 200 microlitres et effectuez la PCR comme décrit dans le texte précédemment. Préparez davantage de strept sur des billes et remettez-les en suspension dans du chlorure de lithium à six molaire. Utilisez 20 microlitres pour l'agneau ou 50 microlitres pour l'agneau NR. Ajoutez ensuite les billes au même volume de produits de réaction PCR et incubez-les sur un agitateur à 300 tr/min pendant deux heures à toute la nuit à température ambiante. Récupérez le complexe ADN-billes et lavez-le avec 100 microlitres d'eau comme démontré précédemment.

Maintenant, suspendez le complexe dans de l'hydroxyde de sodium 0,1 N et incubez les billes pendant 10 minutes à température ambiante sur un agitateur. Ensuite, exposez les billes au séparateur pendant une minute et récupérez le surnageant contenant l'ADN amplifié dans un nouveau tube. En utilisant l'ADN amplifié comme matrice, utilisez deux microlitres de celui-ci pour réaliser une PCR comme décrit dans le tableau 4 du texte.

Visualisez les produits par électrophorèse sur gel afin de purifier les produits. Mélangez 40 microlitres d'entre eux avec 44 microlitres de billes magnétiques AMPure XP à température ambiante, puis incubez-les pendant cinq minutes. Ensuite, séparez les billes pendant deux minutes sur l'aimant.

Après avoir retiré le surnageant, laver les billes deux fois avec 200 microlitres d'éthanol à 70 %, puis resuspendre les billes dans 30 microlitres d'eau à l'aide de 40 nanogrammes d'amorce de fusion d'ADN. La PCR peut être utilisée pour ajouter des adaptateurs spécifiques au séquençage. Les détails sont indiqués dans le tableau cinq.

Contrôlez les produits sur un gel. L'analyse des résultats de la PCR du gène lamb par électrophorèse sur gel haute résolution constitue le meilleur choix d'analyse diagnostique en comparaison. Bien qu'un gel à 2 % d'agarose fonctionne également, il est moins efficace.

La clonalité de NR LAMB, les produits de PCR ne peuvent pas être diagnostiqués visuellement. Un gel d'agarose à 2 % est toutefois parfaitement suffisant pour déterminer la réussite du protocole. Après séquençage des produits de PCR, l'emplacement des vecteurs peut être identifié dans le génome de l'hôte.

À partir de ces données, il est possible d'enregistrer les emplacements d'insertion dans les régions codantes et à proximité des sites de démarrage de la transcription après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la thérapie génique pour explorer la biosécurité des vecteurs de transfert génique tant dans les modèles précliniques que dans les essais cliniques de thérapie génique.