Analyse en temps réel de profil métabolique dans Ex Vivo Cultures souris intestinale Crypte organoïde

Le but de cette procédure est d’analyser en temps réel le profil métabolique des organoïdes primaires des cryptes de souris. Ceci est accompli en recueillant d’abord l’intestin grêle de la souris, suivi de l’isolement des cryptes intestinales André se pliant en matrigel. La deuxième étape consiste à cultiver les cryptes jusqu’à ce qu’elles forment des organoïdes de crypte adultes.

L’étape suivante est la préparation d’un test en cartouche pour les études métaboliques. La dernière étape consiste à charger la cartouche et la plaque utilitaire dans l’analyseur de flux extracellulaire XF 24 et à effectuer une analyse de flux extracellulaire pour mesurer le taux de consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire des organoïdes de la crypte K. En fin de compte, cette procédure permet d’étudier en temps réel le profil métabolique des organoïdes primaires de la crypte intestinale de souris.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’utilisation de la culture cellulaire pour les essais métaboliques est qu’elle nous permet d’évaluer le métabolisme intestinal des crypto-organes en temps réel. Les cultures d’organoïdes imitent l’état immunitaire avec plus de précision, ce qui permet de générer des données physiologiques plus pertinentes. La technique peut également être étendue à l’analyse d’autres cultures d’organoïdes XI 3D.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer, telles que la caractérisation des changements métaboliques dans les Crips de l’intestin grêle au cours de la tumorgenèse, et dans la recherche sur le diabète et le métabolisme, comme la comparaison du métabolisme des états normaux et pathologiques. Pour commencer cette procédure, ouvrez longitudinalement l’abdomen d’une souris euthanasiée. Remplissez l’intestin grêle avec du PBS sans calcium ni magnésium glacé et deux antibiotiques antimycosiques.

Ensuite, isolez rapidement l’intestin grêle. Retirez la graisse mésentérique à l’aide d’un scalpel. Veillez à ne pas perforer le tissu et à garder le tissu humide avec du PBS glacé pendant toute la procédure.

Ouvrez l’intestin et lavez-le soigneusement avec du PBS glacé. Après cela, coupez l’intestin grêle en deux sections. Aplatissez-les à l’aide d’un coton-tige humide.

Ensuite, grattez doucement le VII à l’aide d’une glissière préco. Lavez les mouchoirs vigoureusement dans du PBS glacé plusieurs fois. Ensuite, incubez-les dans 20 millilitres d’un XPBS avec trois millimolaires d’EDTA et 0,5 millimolaire de DTT pendant trois minutes.

Ensuite, coupez les tissus en morceaux de deux à quatre millimètres sur une lame préco. À l’aide d’une lame de rasoir, transférez les morceaux dans un tube de 50 millilitres contenant 20 millilitres de PBS glacé. Ensuite, pipetez doucement de haut en bas 10 fois à l’aide d’une pipette jetable stérile de 10 millilitres.

Une fois que les fragments de tissu se sont déposés par gravité, retirez le SUP natum à l’aide d’une pipette. Répétez la procédure trois fois de plus et assurez-vous que le surnageant est clair. Maintenant, transférez les morceaux de tissu dans un tube de 50 millilitres contenant 20 millilitres de PBS avec deux millimoles molaires EDTA SW et incubez le mélange à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes en le balançant doucement.

Après cela, laissez le tissu se déposer et jetez le supinate. Ajoutez 15 millilitres de charbon de glace PBS et des tuyaux de haut en bas cinq fois. Laissez les fragments de tissu se déposer et collectez le supinat sous forme de fraction un.

Répétez les procédures pour recueillir la fraction deux à la fraction cinq et gardez les fractions séparées. Ensuite, ajoutez 15 millilitres de glace appelée PBS et secouez vigoureusement à la main pendant 15 secondes. Prélevez la fraction six et répétez les procédures pour la fraction sept et la fraction huit.

Si les morceaux de tissu commencent à flotter, tapotez le tube pour les aider à se déposer. Ensuite, inspectez une aliquote de chaque fraction à la recherche de crips au microscope. Ceci est un exemple d’une mauvaise fraction, et ceci est un exemple d’une bonne fraction.

Rassemblez ceux qui contiennent des Crips. Après cela, passez les fractions tirées dans une passoire à cellules de nylon de 70 microns et collectez les Crips dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, centrifugez l’échantillon à 100 fois G pendant cinq minutes, quatre degrés Celsius, jetez le supinate et remettez le PT en suspension dans 10 millilitres de PBS glacé avec deux antibiotiques antimycosiques.

Transférez ensuite les Crips dans un tube de 15 millilitres et répétez le lavage une fois de plus. Ensuite, lavez les cryptes une fois avec 10 millilitres de glacé, un DF avancé D-M-E-M-F 12 contenant deux antibiotiques antimycosiques. Ensuite, lavez les cryptes une fois avec 10 millilitres d’un DF contenant un antibiotique antimycosique.

Après cela, comptez les cryptes à l’aide d’un hémocytomètre. Ajustez le volume de la solution de crypte et transférez-la dans un tube de 1,5 millilitre de sorte que la concentration finale de la crypte lorsqu’elle est remise en suspension soit de 100 à 200 cryptes pour 20 microlitres de mélange de protéines gélatineuses. Ensuite, centrifugez la solution de crypte à 100 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Retirez le séné et remettez en suspension les cryptes dans le mélange de protéines gélatineuses. Ensuite, plaquez 20 microlitres de la suspension de mélange de protéines gélatineuses de la crypte par puits dans une plaque utilitaire de 24 puits. Conservez la plaque dans un incubateur à CO2 à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes jusqu’à ce que la suspension se solidifie.

Ajoutez ensuite 500 microlitres de milieu de culture complet et glacé dans chaque puits et cultivez les Crips jusqu’à ce qu’ils deviennent les organoïdes complètement développés. Dans cette procédure, hydratez la cartouche pendant la nuit dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Retirez ensuite le milieu de culture et lavez les organoïdes deux fois avec 500 microlitres de DMEM. Après cinq minutes, ajoutez 675 microlitres de milieu de dosage à chacun.

Eh bien, vérifiez ensuite la morphologie microscopique des organoïdes de la crypte pour les incuber dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, préparez 10 composés injectables micromolaires dans le milieu de dosage. Configurez la cartouche en chargeant séquentiellement 75 microlitres de composés injectables de 10 micromolaires dans les ports de la cartouche.

Ensuite, incubez la cartouche pendant 30 minutes à une heure dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Simultanément, allumez l’analyseur XF et créez le modèle de protocole de test. Placez la cartouche et la plaque utilitaire dans l’analyseur XF et exécutez la cartouche d’étalonnage. Après cela, chargez la plaque de culture cellulaire dans l’instrument et exécutez le test.

Le protocole montré ici sont les organoïdes de la crypte dérivés d’une souris C 57 black six vieille de huit mois en deux jours ou 18 jours. Culture. Cette figure montre le dosage métabolique à l’aide d’organoïdes dérivés de souris C 57 black six âgées de huit mois, dans lesquels le taux de consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire sont présentés. Les cryptes sont indiquées en rouge et le contrôle est indiqué en bleu.

Les réactifs préchargés dans la cartouche ont été injectés séquentiellement sous forme d’oligomycine, de B-F-C-C-P et de roténone C. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du cancer et du métabolisme pour explorer les changements métaboliques dans les organoïdes cryptiques dérivés de patients. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer le métabolisme de la crypte intestinale et des organoïdes en temps réel.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.