Un modèle de la peau de souris fœtale de Scarless Wound Repair

L’objectif global de l’expérience suivante est de modéliser de manière reproductible la cicatrisation des plaies cutanées fœtales sans cicatrices chez la souris. Ceci est réalisé en chronométrant d’abord précisément l’âge gestationnel des embryons pour la chirurgie fœtale à l’aide de la technique de superovulation. Ensuite, in utero, la chirurgie fœtale est pratiquée pour générer une plaie cutanée fœtale à des moments précis.

Les résultats montrent que les plaies fœtales générées à l’âge gestationnel E 16.5 se régénèrent, tandis que celles à E 18.5 subissent une réparation avec cicatrice fibrotique basée sur une coloration histologique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la cicatrisation des plaies sans cicatrices, telles que l’identification des différences moléculaires dans les plaies gestationnelles précoces qui guérissent sans formation de cicatrices. Précisément. Il est d’une importance cruciale de déterminer si l’âge gestationnel des embryons de souris pour la chirurgie fœtale se situe à E 16,5 et E 18,5.

Dans cette section, nous détaillons notre protocole pour chronométrer les grossesses chez la souris à l’aide d’injections de SPM et d’HCG pour induire une super ovulation entre une heure et trois heures de l’après-midi. Commencez par injecter chez des souris femelles par voie intrapéritonéale trois à cinq unités de SPM. Dans 100 microlitres de PBS.

Les femelles doivent être logées à cinq ou moins par cage. C’est le premier jour du protocole. Le troisième jour entre midi et 14h00, injectez HCG aux mêmes souris à la même concentration que l’injection PMS.

L’ovulation se produira environ 12 heures après l’injection, immédiatement après les injections, ces femelles avec des mâles âgés de huit à 16 semaines, généralement deux femelles sont accouplées à chaque mâle. Maintenant, le matin du quatrième jour, entre six et 10h00 séparés. Les femelles des mâles enregistrent ce moment comme l’âge fœtal.

E 0,5 ne vous embêtez pas à inspecter. Pour les bouchons vaginaux, entre 30 et 50 % des femelles seront enceintes selon la souche de stérilité. Tout d’abord, nettoyez toutes les surfaces de la salle d’opération et de l’équipement avec de l’alcool isopropylique à 70 %.

Deuxièmement, stérilisez les fournitures et les instruments chirurgicaux en les autoclavage. Et troisièmement, utilisez des emballages stériles contenant de la gaze et des instruments chirurgicaux. Après la gestation à l’âge fœtal, les E 16,5 à E 18,5 ont été anesthésiés.

Confirmez un plan chirurgical d’anesthésie à l’aide d’un pincement des orteils. Appliquez ensuite une pommade ophtalmique sur les yeux et une crème dépilatoire sur l’abdomen. Retirez la crème dans les 30 secondes, puis frottez la peau avec de la povidone iodée et de l’alcool.

Maintenant, sous un microscope de dissection, effectuez une laparotomie médiane à l’aide de ciseaux microchirurgicaux. Exposez doucement l’utérus et les fœtus et irriguez le champ opératoire avec du PBS chaud à partir d’une aiguille à pointe émoussée. Une aiguille à pointe émoussée peut être fabriquée en pliant une aiguille normale.

Positionnez maintenant un fœtus de manière à ce qu’il y ait un accès complet au dos. Puis à l’aide d’une suture en nylon 7.0. Passez un point de fil de bourse dans l’utérus, recouvrant le site de la blessure dorsale prévue.

Placez le cordon de la bourse sur une région du dos à gauche ou à droite de la moelle épinière et dans une région de la paroi utérine dépourvue de gros vaisseaux sanguins. Ensuite, au milieu du cordon de la bourse, faites une incision de trois millimètres à travers la paroi utérine et le sac amniotique. Suivez cette incision en irriguant avec plus de PBS chaud.

Ensuite, dans le dos du fœtus, utilisez des ciseaux microchirurgicaux pour couper une seule plaie excisionnelle d’épaisseur totale d’environ un millimètre de long. Nettoyez cette incision à l’aide d’un coton-tige. Injectez maintenant trois microlitres d’encre de Chine par voie sous-cutanée dans le site de la plaie jusqu’à l’emplacement du marché.

Suivre l’injection avec du PBS chaud. Assurez-vous que l’encre est retenue dans le site de la plaie. Les prochaines étapes nécessitent un assistant lors de la fermeture de la suture du cordon de bourse.

Demandez à un assistant de maintenir un jet de PBS chaud éjecté d’une seringue de calibre 10 émoussée dans le sac amniotique. Lorsque les fils de suture se ferment, rétractez la seringue. Maintenant, ramenez doucement l’utérus dans la cavité abdominale, éloignez la peau et le péritoine et demandez à l’assistant d’irriguer la cavité abdominale.

Terminez en plaçant des agrafes dans la peau et le péritoine pour fermer rapidement la cavité abdominale. Après avoir fermé l’abdomen, placez l’animal dans un incubateur chaud réglé à 37 degrés Celsius. Observez la récupération au cours des 30 prochaines minutes ou jusqu’à ce que l’animal ait retrouvé un couché sternal stable.

Ensuite, administrez une injection sous-cutanée de buprénorphine et hébergez l’animal individuellement avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Ne logez pas l’animal avec d’autres personnes avant qu’il ne se soit complètement rétabli de la procédure. Continuez à fournir de la buprénorphine toutes les 12 heures au cours des 48 heures suivant la chirurgie et au besoin en fonction des évaluations régulières de la douleur.

Si nécessaire, un soulagement supplémentaire de la douleur postopératoire peut être fourni avec du carprofène 48 heures après l’opération. Sacrifiez la mère avec une surdose de fluor. Maintenez l’exposition au fluor pendant une minute après qu’il a cessé de respirer.

Confirmer l’euthanasie par une luxation cervicale et prélever le fœtus blessé et un fœtus témoin blessé de l’ONU pour une analyse histologique. Fixer les embryons dans 4 % de PFA, puis les intégrer dans de la paraffine. Pour les modèles transgéniques fluorescents.

La cryoconservation avec un composé OCT peut être appropriée. Après avoir effectué la procédure correctement, la coloration à l’het toin et à l’éosine révèle que la peau E 16.5 guérit avec une cicatrisation minimale, une réépithélialisation complète et seulement une petite augmentation du nombre de cellules inflammatoires. De plus, ces plaies cicatrisent avec une architecture cutanée normale et contiennent des follicules pileux régénérants sur le site de la blessure.

Comme l’indiquent les flèches, une dépression de l’encre au niveau de la pointe de la flèche est normale lorsque l’encre est appliquée correctement. Enfin, la coloration au trichromage révèle un fin motif de collagène dermique réticulaire caractéristique du derme non cicatriciel par rapport aux plaies faites à E 16,5. Les plaies faites à E 18,5 ont une cicatrice dense avec perte de l’architecture normale de la peau au site de la blessure.

Ceci est facilement révélé par les colorations h et d. De même, la coloration trichrome des embryons blessés à E 18.5 révèle un schéma dense de dépôt de collagène désorganisé, comme indiqué par les flèches. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’être doux lors de la manipulation de l’utérus et du fœtus.