Encapsulation alginate de cellules souches pluripotentes en utilisant une buse de co-axiale

L’objectif global de cette procédure est d’intégrer des cellules souches dans des capsules d’alginate et d’hydrogel de manière sûre et efficace, et de les cultiver à l’intérieur des capsules pour contrôler l’agrégation et le microenvironnement, ceci est accompli en mélangeant d’abord une suspension de cellules souches filtrées et une solution d’alginate de sodium. Le mélange est ensuite transféré dans une seringue et une buse coaxiale est installée sur la seringue avant de les déposer sur un pousse-seringue. Ensuite, les gouttelettes sont préparées en expulsant la suspension cellulaire avec de l’azote gazeux co-coulant, suivie d’une collecte et d’une solution de chlorure de calcium.

Les capsules sont ensuite traitées avec de la lysine poly L pour éviter les fuites cellulaires et de l’EDTA pour fluidiser les capsules internes avant de cultiver les cellules encapsulées dans une condition d’agitation rotative. Enfin, les cellules sont collectées à partir des capsules par EDTA et destruction physique de la membrane. En fin de compte, l’encapsulation des cellules souches pluripotentes dans l’alginate empêche les cellules de s’agréger excessivement et limite le stress subi par les cellules en culture en suspension.

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine biologique et biomédical, telles que la grande expansion de la transplantation de cellules et la recherche sur la niche des cellules souches. Commencer l’encapsulation des cellules en recueillant les cellules comme décrit dans le protocole textuel après centrifugation à 160 fois G pendant trois minutes. Laver la tige pluripotente induite ou pastille de cellules IPS par Resus, en suspendant dans des tas de solution saline tamponnée et en centrifugeant trois fois après la réusation, en suspendant les cellules et en tas de solution saline tamponnée.

Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 microns afin d’éliminer les gros agrégats, qui pourraient autrement obstruer la buse. Ensuite, mélangez deux millilitres de suspension cellulaire filtrée et trois millilitres de solution d’alginate de sodium à 5 %. Pour obtenir une suspension cellulaire de cinq millilitres dans un alginate de sodium à 3 %, la densité cellulaire est DIR plus de 1 million de cellules par millilitre.

Après avoir recueilli la suspension cellulaire dans une seringue de cinq millilitres, installez une buse coaxiale sur la seringue et placez-la sur une pompe à seringue pour émettre un flux d’azote gazeux à travers l’aiguille extérieure de la buse coaxiale et expulser la suspension cellulaire à travers la buse intérieure. Prélever les gouttelettes dans 250 millilitres de solution de chlorure de calcium à 0,5 % et attendre 10 à 20 minutes pour la dation tout en agitant à 60 à 90 tr/min. Après le lavage avec une solution saline tamponnée en tas, les capsules collectées sont utilisées comme des capsules nues pour traiter les capsules d’incubation des capsules d’alginate de calcium en 0,05 % poids par volume.

Solution de lysine Poly L pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec agitation. Après avoir recueilli les capsules dans un tube et les avoir lavées avec une solution saline tamponnée en tas, incubez-les dans du DMEM contenant 10 % de FBS. Afin de neutraliser la charge électrique à leur surface, utilisez les capsules résultantes comme capsules enrobées pour générer des capsules creuses.

Incuber les gélules dans une solution saline tamponnée contenant 10 millimolaires d’EDTA pendant cinq minutes. Les capsules traitées à l’EDTA sont utilisées comme des capsules creuses. Incuber les cellules encapsulées à 75 tr/min avec agitation à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 jours après l’incubation, recueillir et incuber les capsules dans 10 millimolaires d’EDTA à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 10 minutes.

Prélever les cellules des capsules d’alginate sans traitement à la polylycine par centrifugation à 1000 fois G pendant trois minutes. Si les gélules d’alginate sont traitées avec de la lysine poly L, brisez la membrane de lysine poly L d’alginate en pipetant de haut en bas environ 10 fois avec une aiguille attachée à une seringue. Le diamètre de l’aiguille doit être inférieur à la taille de la capsule, et des aiguilles de calibre 25 sont utilisées dans cette expérience.

Après une centrifugation de 1000 à 5 000 fois G pendant cinq minutes, prélevez la pastille cellulaire strictement à partir de membranes lycines d’alginate poly L brisées. Si des échantillons d’ARNm sont prélevés dans des cellules, notez que les membranes de lycine poly L d’alginate restantes peuvent empêcher la purification de l’ARNm telle que visualisée par une caméra à grande vitesse. La solution d’alginate expulsée forme une forme sphérique immédiatement après l’expulsion. Si la suspension est expulsée avec un débit d’azote inférieur à un litre par minute, la taille des gouttelettes est uniforme.

Cependant, si le débit d’azote est supérieur à un litre par minute, les gouttelettes se décomposent et la taille des gouttelettes devient hétérogène. Dans ce contexte, il est difficile de préparer des gouttelettes de moins de 500 microns en utilisant cette méthode. Dans le processus de gélification, des gouttelettes d’alginate de sodium forment des capsules d’alginate de calcium de forme sphérique dans une solution de chlorure de calcium.

Cependant, si la concentration d’alginate de sodium est suffisamment élevée, une faible concentration d’alginate de sodium provoque des gélules de forme non sphérique, sphérique et nonoo, qui ont un problème dans le processus de codage. Même si la concentration d’alginate de sodium n’est pas suffisante, des gélules sphériques peuvent être formées en augmentant la concentration de calcium. Cependant, environ 50 millimolaires de chlorure de calcium conviennent à l’encapsulation car trop élevée, une concentration de chlorure de calcium diminue la croissance et la viabilité cellulaires.

Les cellules encapsulées peuvent se développer dans les capsules, mais des fuites cellulaires peuvent se produire dans les capsules sans revêtement d’alginate poly L lysine. Dans le cas des cellules IPS de souris, les cellules forment des agrégats en forme de disque dans chaque capsule d’alginate de calcium, tandis que les cellules s’agglutinent et forment des agrégats sphériques uniques dans chaque capsule creuse. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’encapsuler et de cultiver des cellules dans le contrôle de la taille.

L’hydrogène capte sans aucun équipement spécial, sans absorbant organique.