Culturas Organotypic tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivas

El objetivo general de este procedimiento es establecer cultivos organotípicos tridimensionales de los órganos sensoriales vestibulares y auditivos murinos. Este método puede ayudar a responder las preguntas clave en el campo de investigación del oído interno, como por ejemplo, cuáles son las funciones de la fuerza mecánica y la rigidez del tejido durante el desarrollo de los órganos sensoriales del oído interno. La principal ventaja de esta técnica es que conserva en gran medida la arquitectura innata de la cóclea vestibular y nos permite estudiar la señalización molecular y mecánica durante el desarrollo del oído interno.

El Dr. Hudspeth y yo tuvimos la idea de este método cuando nos dimos cuenta de que los cultivos tridimensionales pueden proporcionar condiciones morfisiológicas para estudiar el crecimiento de órganos vestibulares in vitro. Primero, use etanol al 70% para limpiar y desinfectar el área de trabajo y todos los instrumentos de disección necesarios, incluidas las pinzas número cinco y un cuchillo para el cabello. A continuación, utiliza una hoja de bisturí estéril para hacer un corte longitudinal, divide la cabeza del ratón en dos mitades y extrae los huesos temporales.

Transfiera 15 mililitros de tampón HBSS en una placa de Petri de 60 milímetros sobre hielo. A continuación, utilice dos pares de pinzas finas del número cinco para aislar los oídos internos de los huesos temporales. Luego, transfiera de tres a cuatro mazorcas a la vez en una placa de Petri de 60 milímetros que contenga tampón HBSS helado.

A continuación, orienta las orejas con el lado medial hacia arriba para localizar el utrículo. Utilice los dos pares de pinzas del número cinco para extraer el cartílago que rodea los órganos vestibulares. A continuación, corte el nervio vestibular, la conexión entre el utrículo y el sáculo, y los canales semicirculares para liberar el utrículo y las ampollas adjuntas de las orejas.

Recorte el exceso de canales semicirculares si es necesario. Alternativamente, use los dos pares de pinzas del número cinco para eliminar el tejido cartilaginoso que rodea el órgano auditivo. Luego, aísla la cóclea.

A continuación, utilice una pipeta de 200 microlitros equipada con una punta ancha antiadherente para transferir la cóclea y los utrículos a una placa de Petri de 30 milímetros llena de medio de crecimiento basado en DMEM/F12. A continuación, transfiera las preparaciones cocleares y de utrículo a una incubadora de cultivo de tejidos, gaseada con un 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Esto es para lograr cultivos de órganos con lúmenes cerrados.

Prepare 100 microlitros de la solución de polimerización de colágeno uno en un tubo estéril de 1,5 mililitros. Luego, deje el tubo en hielo. A continuación, retire las preparaciones cocleares y de utrículo de la incubadora de cultivo de tejidos.

Prepare la solución de colágeno neutralizado. Para ello, añade 400 microlitros de colágeno a un tubo refrigerado de 1,5 mililitros con 100 microlitros de solución de polimerización pipeteando varias veces con hielo. Transfiera 500 microlitros de la solución de colágeno neutralizado a una placa de Petri refrigerada de 30 milímetros con un inserto de fondo de vidrio de 10 milímetros.

Transfiera inmediatamente la cóclea o los utrículos a la solución de colágeno neutralizado utilizando una pipeta de 200 microlitros equipada con una punta ancha antiadherente. Use un cuchillo de cabello estéril o un par de pinzas finas para ajustar los órganos a sus posiciones deseadas bajo un microscopio de disección binocular. Para asegurar una polimerización completa, incube la placa de Petri a 37 grados centígrados durante 20 minutos.

Después de 20 minutos, agregue tres mililitros de medio de crecimiento, complementado con 0,5% de suero bovino fetal en cada placa de Petri. Después de agregar el medio de crecimiento, incube el cultivo a 37 grados centígrados. Primero, descongele el virus en hielo.

Luego, mezcle la suspensión viral con la solución de azul de tripano en un tubo cónico de 0,5 mililitros para ajustar la concentración final de tinte de 0,05%Después de mezclar la solución de azul de tripano, deje las partículas virales en hielo. A continuación, utilice un microscopio de disección binocular para observar la rotura de la punta de la aguja de vidrio, preparada en un extractor de micropipetas con pinzas limpias y finas. Primero, retire el cultivo de órganos sensoriales de la incubadora.

Conecte la aguja al microinyector. Llena la aguja con dos o tres microlitros de tinte y mezcla viral. Mire a través del microscopio de disección binocular mientras coloca la aguja en el órgano sensorial.

Siga avanzando la punta de la aguja a través de las capas mesenquimal y epitelial del techo de un cultivo utricular tridimensional. Siga inyectando la mezcla viral hasta que las cavidades del utrículo y las ampollas se llenen con el tinte azul. Luego, incube el cultivo de órganos en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados gaseada con 5% de dióxido de carbono.

Estas son las imágenes microscópicas de luz del cultivo de utrículo y coclear incrustadas en el gel tridimensional de colágeno uno. El utrículo y la cóclea se obtienen a partir de embriones de 17,5 y 14,5 días de edad, respectivamente, y se cultivan durante 48 horas. Estas imágenes microscópicas confocales muestran un utrículo embrionario de 18,5 días de edad justo antes y después de la explantación en el gel de colágeno 40PA.

Después de tres días en el cultivo, casi el 80% de las células ciliadas positivas para Myo7A permanecen intactas. La densidad celular de soporte disminuye en más del 30% y la densidad de células ciliadas disminuye en un 60% después de tres días en cultivos uticulares. Estas imágenes microscópicas confocales muestran una cóclea embrionaria de 14,5 días de edad justo antes y después de la explantación en el gel de colágeno 40PA.

Después de tres días en cultivo, las células ciliadas internas y externas Myo7A y Sox2 positivas se distinguen morfológicamente y se organizan en unas cuatro o cinco filas. Aquí, las imágenes muestran una infección viral exitosa de las células de soporte en la base de la cóclea y a través de los cultivos tridimensionales utriculares obtenidos a partir de 15,5 y 17,5 días de embriones, respectivamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diseccionar órganos sensoriales intactos del oído interno, establecer cultivos tridimensionales de utrículo y cóclea y colágeno tipo uno, y realizar transfecciones virales en esos cultivos tridimensionales.

Recuerde que trabajar con partículas virales, dependiendo de la carga de genes, puede ser peligroso. Siempre se deben practicar precauciones, como el uso de equipo de protección personal y la eliminación viral adecuada.