Protocole optimisé pour une transfection efficace des cellules dendritiques, sans maturation cellulaire

L’objectif global de cette procédure est de réduire l’expression du gène cible dans le DCS par transfection de l’ARN SI. Pour ce faire, il faut d’abord programmer l’effecteur AM Maxin Nucleo. La deuxième étape de la procédure consiste à mélanger le DCS et le siRNA et à pipeter la solution cellulaire résultante dans les modules Nucleo QVE.

La troisième étape de la procédure consiste à placer la plaque dans le plateau de navette amaxa pour commencer le processus de transfection. La dernière étape de la procédure consiste à infecter les cellules avec le virus pour activer la réponse à l’interféron. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent l’inactivation des gènes par R-T-P-C-R quantitatif et Western blot.

Cette technique est précieuse pour caractériser les voies de signalisation dans les cellules dendrétiques et peut contribuer au développement de thérapies immunitaires à base de cellules dendrétiques. Pour programmer le facteur nucléologique de la navette Maxon 96 puits pour la transfection CC, ouvrez un nouveau fichier de paramètres. Sélectionnez le nombre de puits que vous utiliserez pour la transfection standard en faisant glisser le curseur sur le diagramme de plaque à 96 puits.

Utilisez un minimum de trois puits pour regrouper chaque échantillon expérimental. Entrez maintenant le code du programme dans la première partie, sélectionnez F, F et i deuxième partie, sélectionnez 1 68 dans les menus déroulants. Ensuite, dans la boîte de solution, sélectionnez monocyte humain puis sous l’option de contrôle, sélectionnez standard, puis cliquez sur appliquer.

Pour inclure un contrôle sans transfection, sélectionnez des puits supplémentaires dans le diagramme. Ensuite, à partir de l’option de contrôle, choisissez aucun contrôle de programme et cliquez à nouveau sur appliquer. Après avoir mélangé la solution d’affection nucléique, laissez-la se réchauffer à température ambiante.

Placez le nombre de modules nucleo vete nécessaires dans la plaque nucleo vete dans le bon sens, comme indiqué ici, en insérant le premier dans la rose un et deux, puis ainsi de suite pour tous les tubes suivants. Transférez suffisamment de DCS d’un flacon de culture cellulaire dans un tube de 50 millilitres pour avoir 500 000 cellules par puits pour la centrifugeuse de transfection des cellules pendant 10 minutes à 400 G à quatre degrés Celsius, puis retirez soigneusement le surnageant. Ensuite, ajoutez une solution d’affection nucléaire dans le tube, puis remettez le DCS en suspension en le pipetant doucement de haut en bas à quelques reprises.

Étiquetez maintenant les tubes DPH en fonction du traitement spécifique à effectuer, puis divisez les cellules remises en suspension dans les tubes marqués. Ajouter l’ARN SI à une concentration finale de 0,25 microgramme par 500 000 cellules dans les tubes épi-endorf appropriés, puis mélanger les suspensions cellulaires par pipetage. Utilisez de l’ARN SI non cible pour l’échantillon de contrôle sans transfection.

Ensuite, pipetez 20 microlitres de la suspension de cellules DC SI RA dans les modules nucleo vete selon le schéma expérimental préalablement programmé, en veillant à ce que le liquide soit livré au fond du puits, couvrez la plaque nucleo vete avec un couvercle et tapotez la plaque sur une surface dure à quelques reprises pour faciliter l’élimination des bulles d’air afin de transfecter les dcs. Insérez la plaque nucleo Yvette préparée dans le plateau de navette à 96 puits de nucleo effector. Cliquez ensuite sur le bouton Télécharger et démarrer.

Suivez la progression du processus de transfection sur l’écran. Une croix noire sur fond vert signifie qu’une transfection a réussi dans ce puits, tandis qu’une barre noire sur fond rouge signifie qu’elle a échoué pendant que les cellules sont transfectées. Une fois le processus de transfection terminé, retirez la plaque et ajoutez 80 microlitres de milieu de croissance CC préchauffé dans chaque puits.

À l’aide d’une pipette multicanaux, incubez maintenant la plaque pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Pendant la période d’incubation, ajoutez 100 microlitres de milieu de croissance DC préchauffé dans les tubes matriciels dans la même orientation que la plaque de cuvette nucléotique installée. Après la période d’incubation, transférez les 100 microlitres de suspensions cellulaires des CVE de nucléo dans les tubes matriciels prédisposés.

Ensuite, retirez et jetez les tubes où la transfection n’a pas eu lieu. Enfin, incubez les tubes matriciels pendant 24 heures ou à un autre intervalle de temps souhaité. Étiquetez les tubes einor pour chacun des tubes matriciels d’incubation.

Transférez ensuite les tubes matriciels de l’incubateur vers une hotte de culture cellulaire et regroupez les tubes matriciels pour chaque échantillon expérimental dans l’eend dfs pré-étiqueté. Ensuite, granulez doucement les cellules en faisant tourner les tubes DPH dans une centrifugeuse de bureau pendant 10 minutes. À 400 g, retirez le snat et mettez en suspension les cellules dans un milieu de croissance libre sérique contenant le virus de la maladie de Newcastle ou NDV à un moment d’inertie de un lâchement.

Couvrez les endorphines épi de manière stérile, puis incubez les tubes pendant 45 minutes. Après cette période d’incubation, ajoutez 900 microlitres de milieu de croissance DC et réincubez les tubes pendant huit à 10 heures supplémentaires. Pour récolter les dc transfectés et infectés.

Granulez les cellules en faisant tourner les tubes einor dans une centrifugeuse de bureau comme auparavant et retirez les dcs monocytaires de snat ont été transfectés avec soit IRNA ciblant RIG I, soit irna luisant non spécifique et infectés par NDV comme indiqué par un signe plus ou sont restés non infectés comme indiqué par un signe moins comme détecté par R-T-P-C-R-A inactivation quantitative de R RGA de 75 %Au niveau de transcription, une réduction similaire de l’expression de interféron bêta. Un effecteur en aval de RGA dans la cascade de signalisation de l’interféron a également été observé. De plus, l’expression de l’interféron bêta dans les cellules transfectées témoins non infectées n’était pas détectable.

Alors que celle du MXA et du gène de réponse en aval de l’interféron bêta était minime. Ici. Les données d’une deuxième transfection de DCS avec rigi ciblant irna réalisée comme dans la figure précédente sont présentées dans cette expérience. Cependant, toutes les cellules sont infectées par le NDV et un contrôle supplémentaire utilisant des DCS monocytaires non réséqués a été incorporé.

Les résultats du silençage génique étaient similaires à ceux observés dans la figure précédente. Un transfert Western sondé pour le RGA a révélé que l’expression protéique de ce gène avait été complètement bloquée. Les voies un et deux montrent des données pour les lysats à partir de cellules non réséquées.

Les voies trois et quatre montrent des lysats de cellules transfectées d’ARNi lumineux et les voies cinq et six montrent des lysats de cellules transfectées avec RIG I ciblant S Irna Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure, y compris l’élimination simultanée de plusieurs gènes.