Protocole optimisé pour une transfection efficace des cellules dendritiques, sans maturation cellulaire

L'objectif général de cette procédure est d'abaisser l'expression du gène cible dans les DCS par transfection avec un ARNsi. Ceci est réalisé en programmant d'abord l'effecteur AM Maxin Nucleo. La deuxième étape de la procédure consiste à mélanger les DCS et l'ARNsi, puis à pipeter la solution cellulaire obtenue dans des modules Nucleo QVE.

La troisième étape de la procédure consiste à placer la plaque dans le plateau de transfert amaxa pour commencer le processus de transfection. La dernière étape de la procédure est d'infester les cellules avec le virus afin d'activer la réponse interféron. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus montrant une inhibition génique par RT-PCR quantitative et immunotransfert (Western blotting).

Cette technique est précieuse pour caractériser les voies de signalisation dans les cellules dendritiques et pourrait contribuer au développement de thérapies immunitaires basées sur les cellules dendritiques. Pour programmer le Maxon 96 puits shuttle nucleo factor pour la transfection des cellules dendritiques, ouvrez un nouveau fichier de paramètres. Sélectionnez le nombre de puits que vous utiliserez pour la transfection standard en déplaçant le curseur sur le schéma de la plaque de 96 puits.

Utilisez un minimum de trois puits à regrouper pour chaque échantillon expérimental. Saisissez maintenant le code du programme : dans la première partie, sélectionnez F, F, puis dans la deuxième partie, sélectionnez 1 68 dans les menus déroulants. Ensuite, dans la zone de solution, sélectionnez monocyte human, puis sous l'option contrôle, sélectionnez standard, et cliquez ensuite sur appliquer.

Pour inclure un contrôle sans transfection, il est nécessaire de sélectionner des puits supplémentaires sur le schéma. Ensuite, dans les options de contrôle, choisissez le contrôle sans programme et cliquez à nouveau sur appliquer. Après avoir homogénéisé la solution de nucléofection, laissez-la atteindre la température ambiante.

Placez le nombre de modules nucleo vete nécessaire dans la plaque nucleo VETE en respectant l'orientation correcte, comme indiqué ici, en insérant le premier dans les puits un et deux de couleur rose, puis procédez de la même manière pour tous les tubes suivants. Transférez suffisamment de DCS depuis un flacon de culture cellulaire vers un tube de 50 millilitres afin d'obtenir 500 000 cellules par puits pour la transfection. Centrifugez les cellules 10 minutes à 400 G et à quatre degrés Celsius, puis retirez soigneusement le surnageant. Ensuite, ajoutez la solution de nucléofection au tube, puis resuspendez les DCS en pipetant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas.

Étiquetez maintenant les tubes Eppendorf en fonction du traitement spécifique à effectuer, puis répartissez les cellules en suspension dans les tubes étiquetés. Ajoutez l'ARNi à une concentration finale de 0,25 microgramme par 500 000 cellules dans les tubes Eppendorf appropriés, puis mélangez les suspensions cellulaires par pipetage. Utilisez un ARNi non ciblé pour l'échantillon contrôle sans transfection.

Ensuite, pipetez 20 microlitres de la suspension de cellules SI RA DC dans les modules nucleo vete selon le plan expérimental programmé précédemment, en veillant à ce que le liquide soit délivré au fond des puits. Couvrez la plaque nucleo vete avec un couvercle et tapez doucement la plaque sur une surface dure plusieurs fois pour faciliter l’élimination des bulles d’air afin de transfecter les DC. Insérez la plaque nucleo Yvette préparée dans le plateau shuttle nucleo effector 96 puits. Cliquez ensuite sur le bouton de chargement et de démarrage.

Suivez l'avancement du processus de transfection sur l'écran. Une croix noire sur fond vert indique une transfection réussie dans ce puits, tandis qu'une barre noire sur fond rouge signifie un échec pendant que les cellules sont transfectées. Préchauffez le milieu de croissance des DC à la fin du processus de transfection, retirez la plaque et ajoutez 80 microlitres du milieu de croissance des DC préchauffé dans chaque puits.

À l’aide d’une pipette multicanal, incuber maintenant la plaque pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius et 5 %CO₂. Pendant la période d’incubation, ajouter 100 microlitres du milieu de croissance préchauffé pour les DC dans les tubes matrice, en respectant la même orientation que celle utilisée pour la plaque de cuvettes nucléaires. Après l’incubation, transférer l’intégralité des 100 microlitres des suspensions cellulaires provenant des cuvettes nucléaires CVE vers les tubes matrice préparés.

Ensuite, retirez et jetez les tubes dans lesquels la transfection n'a pas eu lieu. Enfin, incubez les tubes matriciels pendant 24 heures ou un autre intervalle de temps souhaité. Étiquetez les tubes einor pour chacun des tubes matriciels en incubation.

Ensuite, transférez les tubes de matrice de l'incubateur vers une hotte de culture cellulaire et regroupez les tubes de matrice pour chaque échantillon expérimental dans des eend dfs pré-étiquetés. Puis, faites précipiter doucement les cellules en centrifugeant les tubes eend DPH dans une centrifugeuse de table pendant 10 minutes à 400 ×g. Retirez le surnageant et resuspendez les cellules dans un milieu de croissance sans sérum contenant le virus de la maladie de Newcastle ou NDV à un MOI de un, de manière lâche.

Couvrez les épi-endorphines de manière stérile, puis incubez les tubes pendant 45 minutes. Après cette période d'incubation, ajoutez 900 microlitres de milieu de croissance DC et réincubez les tubes pendant huit à dix heures supplémentaires. Pour récolter les DC transfectées et infectées.

Resuspendre les cellules par centrifugation dans des tubes Eppendorf à l'aide d'une centrifugeuse de table, comme précédemment, puis éliminer le surnageant. Les monocytes ont été transfectés soit avec un ARNi ciblant RIG-I, soit avec un ARNi non spécifique, puis infectés par le virus de la maladie de Newcastle (NDV), comme indiqué par un signe plus, ou sont restés non infectés, comme indiqué par un signe moins, tel que détecté par RT-qPCR. Un abattement de 75 % de RIGA au niveau transcriptionnel a été observé, ainsi qu'une réduction similaire de l'expression de l'interféron bêta. Une diminution de l'expression d'un effecteur en aval de RIGA, dans la cascade de signalisation de l'interféron, a également été observée. Par ailleurs, l'expression de l'interféron bêta dans les cellules contrôles non infectées et transfectées n'était pas détectable.

Tandis que celle des gènes de réponse en aval de MXA et de l'interféron bêta était minimale. Ici, les données d'une deuxième transfection de DCS avec un ARNi ciblant RIG-I, réalisée comme dans la figure précédente, sont présentées dans cette expérience. Cependant, toutes les cellules sont infectées par le virus de la pneumonie de Newcastle (NDV) et un contrôle supplémentaire utilisant des DCS monocytaire non différenciées a été inclus.

Les résultats de silençage génique étaient similaires à ceux observés sur la figure précédente. Un immunoblot réalisé avec un anticorps dirigé contre RGA a révélé que l'expression protéique de ce gène avait été complètement bloquée. Les pistes une et deux montrent les données obtenues à partir de lysats de cellules non résectionnées.

Les pistes trois et quatre montrent des lysats provenant de cellules transfectées avec de l'ARNi glow, et les pistes cinq et six montrent des lysats provenant de cellules transfectées avec de l'ARNi S ciblant RIG I. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure, y compris l'extinction simultanée de nombreux gènes.