Name: Microdissection לייזר יישומית כדי Gene Expression Profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 59 s
Description: למדו פרופיל ביטוי גנים באמצעות מיקרודיסקציה לייזרית בדיסק כנף של Drosophila. השיטה מאפשרת השוואת אזורים מושתקים ולא מושתקים לניתוח רגולציה גנית בסביבת רקמה טבעית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים פרופ. קיארה קמפנלה ואת עמרה מרכז כשירות, אוניברסיטת נאפולי פדריקו השני, נאפולי, איטליה, למתן אותם עם השימוש microdissector לייזר, ומר נצו Vicidomini לעזרה נדיבה אנימציה 3D.

חלק 1. הכנת דיסקים תסיסנית דמותי אגף נתון RNAi ספציפיים לשפות אחרות. כמו חומר ביולוגי, השתמשנו תסיסנית דיסקים דמותי כנף המתקבל הזחלים מהונדס נתון השתקת הגן מקומיים ספציפיים באמצעות המערכת GAL4/UAS 1. זה הצאצאים הזחל orginates מן הצלב גנטית מעורבים שני קווים ההורים: האחד נושא את הנהג GAL4, השני מגיב כטב&quot;מ. בנוסף להביע GAL4 דפוס הזמני ספציפיים ו / או מרחבית, קו הנהג נושא כתב כטב&quot;מ-GFP המאפשר לחזות את תחום GAL4 הביטוי. הקו המגיב כטב&quot;מ מבטא, תחת שליטתו של רצף כטב&quot;מ, מכבנה השתקת RNA (hpRNA) מסוגלים במיוחד למקד את הגן הנבחר של עניין (קוראים לזה גן X) 2. הביע פעם בתא, X hpRNA הוא ביקע ליצירת RNA התערבות קטנה (siRNA) מסוגלים במיוחד להשתיק את הגן שנבחר. בשנת הצאצאים הזחל, שנושאת גם הנהג המגיב transgenes, לבנות כטב&quot;מ-ההשתקה הוא עיבד רק באותם תאים המבטאים את חלבון GAL4, וכך הוא מסוגל לגרום השתקה מוגבלת מרחבית של הגן X. נבחרים בין מגוון של יישומים אפשריים, אנו ליישם את הגישה הזאת כדי להשתיק גן נבחרים של האינטרס שלנו (גן X) תחת שליטה של engrailed-GAL4 (en) נהג, אשר יכול להפעיל השתקה ספציפיים בתא האחורי של הדיסק כנף 3 , שטח אשר סומן על ידי ביטוי של transgene כטב&quot;מ-GFP. הדיסקים השתיק כנף דמותי היו ביד גזור, דואג לחסל זיהום ברקמות שמסביב, ובעיקר דבקות וקנה הנשימה. דיסק כל אגף מבודד אז הועבר במהירות ובעדינות על מסגרת שטופלו בעבר RNase, דיסקציה חינם microdissection לייזר מיידי של אזורים נבחרים. חלק 2. לייזר microdissection של אזורים נבחרים מן (קדמית) תאים השתיק (האחורי) ו unsilenced של הדיסק כנף. לאחר דיסק האגף היה על הממברנה, microdissection לייזר של אזורים ספציפיים של השתיק (האחורי; GFP שכותרתו) ו unsilenced (קדמית, GFP-תווית) תאים הושגה. זה בוצע על ידי ציור שטח זה יכול בקלות להשתלב בשני הצדדים GFP-GFP חיובי שלילי של הדיסק. תחת microdissector, אנחנו הראשונים התמקדה קרן הלייזר על הרקמה GFP חיובי, ביצוע חתך לאורך המערכת שנבחרה. התמורה microdissector עם חיתוך במהירות שנבחרה כוח, אבל זה אפשרי כדי לחדד את חיתוך ידני, עד האזור הנבחר של רקמת נופל הצינור מתחת. צינורית זו מכילה נפח קטן של מגיב TRI, כך רקמות GFP חיובי מוכן להפקת RNA הבאים. אנו מכן עבר האזור חיתוך אל מול, GFP שלילי הצד של הדיסק כנף, על מנת לנתח שטח שווה ערך מן הרקמה unsilenced GFP-שלילי. שוב, אחרי לחתוך את האוטומטי, אנו המשיך הזיקוק לחתוך באופן ידני. לאחר לחתוך נעשתה, גם את רקמת ה-GFP שלילי נמצאה בתוך מגיב TRI, מוכן להפקת RNA. חלק 3. הפקת RNA ו פרופיל תמלול מאזורים רקמות Microdissected. סובבנו את הצינורות כדי לנתק את הנוזל מתוך כובע והוסיף מגיב TRI עד 1 מ&quot;ל, ואז ביצע מיצוי רנ&quot;א בעקבות פרוטוקול מגיב תקן TRI. כדי לאסוף מספיק חומר, אנחנו חוזרים ונשנים את הליך החיתוך על 100 דיסקים כנף דמותי. החל מ 100 מיקרומטר על שטחי 5000 2 כל אחד, התשואה שלנו היתה של 1.5 מיקרוגרם של רנ&quot;א. דיוק של דיסקציה ידנית נשלט אז על ידי בדיקת ביטוי של GFP בדגימות הושתק unsilenced על ידי RT-PCR, באמצעות סופר סקריפט III (Invitrogen) לסנתז cDNA עם Hexamers אקראיים. ניתוחים כמותיים לאחר ממוקד כדי לקבוע את רמות הביטוי של גנים מושתקים X, יחד עם אלו של יעדים המשוערת של מסלול הרגולציה שלה, בוצעו על ידי זמן אמת RT-PCR באמצעות מאסטר מיקס (Invitrogen).

<ol><li>Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene. Dahmann, C. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2008).</li>
<li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wing+disc+development+in+the+fly%3A+the+early+stages.+%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Wing disc development in the fly: the early stages. </a> Current Opinion in Genetics & Development. 11, 470-475 (2001).</li>
<li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-U1-151-U1 (2007).</li>
<li>Martin, F. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+the+control+of+growth+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Compartments and the control of growth in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 133, 4421-4426 (2006).</li>
<li>Tabata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+morphogen+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of morphogen gradients.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 620-630 (2001).</li>
<li>Moreno, E. &amp, Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dMyc+transforms+cells+into+super-competitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">dMyc transforms cells into super-competitors.</a> Cell. 117, 117-129 (2004).</li>
</ol>

לגבי רמות הבסיס שלהם ביטוי להשיג התאים קדמית / אחורית של דיסקים כנף unsilenced, הפעילות של הגן X שנבחר נמצא מופחת 40% על ההשתקה. לעומת זאת, אחת המטרות המשוערת שלה (גנים Y) נמצא באופן משמעותי מעלה מוסדר (7 מתקפלת עליה), מוביל אותנו כדי לאמת את ההשערה כי זה היה מוסדר באופן שלילי על ידי גן X. אנו מסיקים כי הגישה הניסוי המתואר לעיל יכול להיות מיושם בהצלחה אימות של מטרות המשוערת של מסלולים רגולטוריים שונים. <p cla...

טוס זנים תסיסנית כטב&quot;מ-השתקת השורות ניתן לקבל VDRC RNAi אוסף 2. אוסף של GAL4 נהג קווי זמין ב תסיסנית Bloomington במלאי מרכז (אינדיאנה, ארה&quot;ב). ציוד הציוד הנדרש כולל לייזר microdissector (לייקה LMD6000), קולטר Microfuge 22R (Beckman), PCR (BIO-RAD Cycler שלי), זמן PCR נדל (BIO-RAD iQ5). כלים כלים נדרשים כוללים: זכוכית בארות, מברשת, מלקחיים microdissection, מגלשות ירידה תלוי, סיכות חרקים רכוב על מחטי מזרק, מסגרות מתכת עם קרום PET, צינורות פלסטיק (50 מ&quot;ל, 05 מ&quot;ל, 0.25 מ&quot;ל).

microdissection לייזר יישומית כדי gene expression profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

טבע הטרוגניות של רקמות הוכיחה להיות גורם מגביל בסכום של מידע ניתן להפיק מן דגימות ביולוגיות, להתפשר על מנתח במורד הזרם. בהתחשב עמותות הסלולר מורכב ודינמי הקיימים בתוך רקמות רבות, על מנת לשחזר את הניתוח באינטראקציות vivo מולקולרית יסודי אחד חייב להיות מסוגל לנתח אוכלוסיות תאים ספציפיים בהקשר הטבעי שלהם. לייזר בתיווך microdissection יכולים להשיג מטרה זו, המאפשרת זיהוי חד משמעי וקציר מוצלח של תאים בעלי עניין תחת להדמיה מיקרוסקופית ישירה תוך שמירה על שלמות מולקולרית. יש לנו ליישם את הטכנולוגיה הזאת כדי לנתח ביטוי גנים באזורים מוגדרים של הדיסק בפיתוח האגף תסיסנית, המייצג את מערכת מודל יתרון ללמוד לשלוט צמיחה, התמיינות תאים ו organogenesis. הדיסקים מחולקים דמותי הזחל מפותח על ידי גבולות הגבלה השושלת לתאים הקדמי ואת האחורי, הגבי ו הגחון. עשיית שימוש של ועין מתנהלת GAL4-כטב&quot;מ ביטוי בינארי המערכת, כל אחד תאים אלה יכולים להיות מתויג במיוחד זבובים מהונדס המבטא כטב&quot;מ-GFP transgene בשליטת המתאים GAL4 נהג לבנות. ב הדיסקים מהונדס, ביטוי גנים פרופיל של תת דיסקרטית של תאים יכול להיקבע בדיוק אחרי microdissection לייזר בתיווך, באמצעות אותות ה-GFP ניאון מדריך לחתוך לייזר. בין מגוון של יישומים במורד הזרם, אנו מתמקדים פרופיל תעתיק הרנ&quot;א לאחר מקומי התערבות RNA (RNAi). עם כניסתו של RNAi הטכנולוגיה, GFP תיוג יכול להיות בשילוב עם מציאה מקומי של גן מסוים, המאפשר דטרמיניסטיות תעתיק את התגובה של האוכלוסייה תא בדידים כדי להשתיק את הגן הספציפי. כדי לאמת גישה זו, ניתחנו אזורים המקבילה של הדיסק מן האחורי (מסומן על ידי ביטוי של GFP), ואת תא קדמי (תווית) על השתקה אזורי בתא P של הגן אחרת לידי ביטוי בכל מקום בגוף. RNA הופק מאזורים הושתק unsilenced microdissected ואת הגן השוואתי הביטוי פרופיל נקבע על ידי כמותי בזמן אמת RT-PCR. אנו מראים כי בשיטה זו יכול למעשה להיות מיושם עבור transcriptomics מדויק של תת קבוצות של תאים בתוך הדיסקים דמותי תסיסנית. ואכן, תוך הכנת דיסק מסיבי כמקור של RNA בדרך כלל מניחה הומוגניות התא, זה ידוע היטב כי הביטוי תעתיק יכול להשתנות במידה רבה בתוך מבנים אלה עקב מידע מיקומית. בעזרת ה-GFP מקומי אות ניאון מדריך לחתוך לייזר, ניתוחים תעתיק מדויק יותר ניתן לבצע ויישומי רווחי ליישומים שונים, כולל פרופיל תמליל של שושלות תאים נפרדים בהקשר הטבעי שלהם.

Microdissection לייזר יושמה כדי לנתח את הביטוי פרופיל גנטי בתאים מסוימים של הדיסק כנף תסיסנית נתון RNAi מקומי<em&gt; In vivo</em&gt;. RNA המופק אזורים המקבילה של תאים הושתק unsilenced נותח על ידי RT-PCR כמותי כדי לקבוע פרופיל השוואתי ביטוי גנים בהקשר של microecology רקמות הילידים.

Microdissection לייזר יישומית כדי Gene Expression Profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק

הטבע ההטרוגני של רקמות הוכח כגורם מגביל לכמות המידע שניתן להפיק מדגימות ביולוגיות, ...

במסמך זה אנו מספקים תיאור מקיף של מיקרודיסקציה בלייזר, שיושמה לצורך השוואת פרופיל תעתוקי של RNA באזורים מושתקים ואזורים שאינם מושתקים בדיסק הכנף של droso phila. גישה זו דורשת כחומר ביולוגי דיסקים של כנף droso phila שבודדו ידנית, וכציוד מרכזי מיקרודיסקטור לייזר. אנו משתמשים במכשיר LI A-L-L-M-D 6, 000 ובמכשיר PCR בזמן אמת.השתמשנו במכשיר BioRad iq. חמישה כלים קטנים הנדרשים הם פלטה קעורה, מברשת צבע קטנה, פינצטה למיקרו-דיסקציה, שקופית לטיפות תלויות, פינים לחרקים המורכבים על מחטי מזרק, מסגרת מתכת עם ממבנה דם (membrane) ופחלוני פלסטיק קטנים. שיטה זו כוללת את השלבים הבאים.שלב ראשון: הכלאה בין שני קווי שוואו-טרנסגניים (oph transgenic) מתאימים, במטרה להוביל להשתקה גנטית מקומית וספציפית בצאצאים באמצעות מערכת ה-GAL four UAS. שלב שני: הכנת מסגרות הניתוח. שלב שלישי: הגדרת המיקרו-דיסקטור הלייזרי.שלב ארבע, איסוף ידני של הדיסקים של התאים המייסדים (imaginal discs) של הכנף מהצאצאים הזחליים של ההכלאה הגנטית. שלב חמש, ביצוע מיקרו-דיסקציה בלייזר של אזורים ספציפיים בדיסקים המסומנים ב-GFP. שלב שש, פרופיל שעתוק של אזורים מקבילים בדיסקים שבהם הגן הושתק ובאזורים שאינם מושתקים יאפשר לבסס את ההשפעות שנגרמו כתוצאה מהשתקת הגן המדובר.ניתוח פרופילי תעתוק in vivo של הגן, שניתן לכנותו גן X, ידרוש הפקת RNA מהאזורים שעברו מיקרו-דיסקציה, בקרת דיוק של הדיסקציה הידנית, הערכת ביטוי GFP בשני הדגימות באמצעות R-T-P-C-R, כימות הביטוי של מטרות פוטנציאליות של הגן המושתק בשתי הדגימות באמצעות Real-time R-T-P-C-R או על ידי ביצוע אנליזת מיקרו-מערך (microarray). להלן פירוט רב יותר על כל שלב.השלב הראשון, ההכלאה הגנטית. ההכלאה הגנטית כוללת זני GAL4 UAS טרנסגניים ומתמקדת בהשגת דיסקים דמיוניים (imaginal discs) מושתיקים בצאצאים בשלב הזחל. מערכת ה-GAL4 הרב-גונית מאפשרת להפעיל השתקה ספציפית וממוקמת של גנים באמצעות הפרעה ב-RNA.זן אחד מביא להכלאה את טרנסגן הדרייבר (driver transgene), המבטא GAL4 בתבנית זמנית או מרחבית ספציפית, וכן רפורטר UAS-GFP המאפשר ויזואליזציה של תחום הביטוי של GAL4. הזן השני מביא טרנסגן רספונדר (responder transgene) מסוג UAS המבטא RNA משתיקה בצורת סיכת ראש (hairpin silencing RNA), המסוגל להתמקד ספציפית בגן X מרגע ביטויו בתא.RNA זה נחתך כדי ליצור RNA מפריע קטן (siRNA), המסוגל להשתיק באופן ספציפי את הגן X הנבחר בצאצאים של הכלאה זו. התראנסגן להשתקה מבוססת UAS מותעת רק באותם תאים המבטאים את חלבון GAL4, ובכך הוא משרה השתקה מוגבלת מרחבית של הגן X. מבין מגוון היישומים, התמקדנו בפרופילי תעתוק של RNA בדיסק כנף שהושתק על ידי דרייבר Grailed GAL4, המכוון השתקה ספציפית במדחור האחורי.אזור השתיקה מסומן על ידי ביטוי של הטרנסגן U-A-S-G-F-P. במדור האחורי. שני אירועים יעוררו את ביטויו של GGFP ואת השתיקה של גן x.שלב שני, טיפול במסגרות הדיסקציה (ניתוח) כדי לעכב את פעילות ה-RNases. שטפו את שקופיות המסגרת ואת כלי הדיסקציה במים עם DEPC למשך שעה אחת לפחות בטמפרטורת החדר, והניחו להם להתייבש בתא סטרילי. כדי לעכב את פעילות ה-RNases, השתמשו במבחנה חדשה בנפח 50 ml שהיא כבר נקייה מ-RNases, מלאו אותה במים עם DEPC והכניסו למבחנה פינצטה, שקופית טיפה תלויה ומסגרת PET.שני הפריטים נחוצים עבור המיקרו-דיסקציה. סגרו את המבחנה, הפכו אותה על פיה, ולאחר מכן השאירו אותה להגיב למשך שעה אחת לפחות. בטמפרטורת החדר, לאחר שעה, העבירו את ה-DEPC water למבחנה אחרת באמצעות הפינצטה.החזיקו את השקפים בתוך המבחנה כדי שלא ייפלו. לאחר מכן, הניחו לשקפים להתייבש בתוך המבחנה. שלב שלוש, הגדרה למיקרו-דיסקציה.ראשית, הדליקו את כל המכשירים הדרושים: את נורת הפלואורסצנציה, את המיקרוסקופ ואת התוכנה למיקרו-דיסקציה. חלון אזהרה יזכיר לכם להדליק גם את הלייזר. עשו זאת ואפשרו ללייזר להתחמם בזמן שתשלימו את הגדרות המיקרו-דיסקציה.עתה הגיע הזמן להכין את הבארים שבהן ייאסף הרקמה הגזור. מכשיר הגזירה בלייזר Leica LMD 6,000 מאפשר טעינה של עד ארבעה מבחנות לאיסוף דגימות שונות. למטרתנו, נזדקק לשתי מבחנות בלבד.אחד, לאיסוף רקמה מושתקת חיובית ל-GFP, והשני לאיסוף רקמה לא מושתקת שלילית ל-GFP באמצעות מיקרו-מלקחים. מלא את שני מכנסי המבחנות ב-20 µL של תמיסת TRI reagent כדי לשמר את ה-RNA. כעת המיקרו-דיסקציה מוכנה לשימוש. שלב ארבע, דיסקציה ידנית של דיסקי תמונת כנף מזחלי דרוזופילה.בודד את דיסקי הכנף (wing discs) מצאצאי הזחלים שהתקבלו כפי שתיאור קודם, והקפד שרקמות אחרות לא יזהמו את הדיסקים. כדי להשיג מטרה זו, שיטת הדיסקציה שונה למדי מזו המשמשת בדרך כלל לאיסוף המסה של כל הדיסקים המקוריים. ראשית, שטוף את הזחל בתמיסת רינגר (ringer's solution) כדי להסיר שאריות מדיה דבקים. לאחר מכן, העבר אותו לשקופית טיפה תלויה (hanging drop slide) וחתך את הראש תוך써 משיכה מיידית של הפה כלפי מטה.השתמשו בסיכות החרקים כדי להסיר בזהירות רקמות אחרות. המסגרת האדומה מראה את הדיסקים של כנפי הדמיונות (imaginal wing discs) שיש לאסוף. שמרו על הדיסקים נקיים מרקמות דבקות והעבירו במהירות ובעדינות כל דיסק כנף מבודד למסגרת ניתוח לצורך חיתוך מיידי.יש לחזור על פרוצדורה זו עד להגעה למספר כולל של מאה דיסקים של כנף. שלב חמישה, מיקרו-דיסקציה בלייזר של אזורים ספציפיים בדיסקים של כנף המסומנים ב-GFP. ברגע שהדיסק המקורי של הכנף נמצא על הממברנה, ניתן להמשיך בחיתוך.הניחו את המסגרת על התושבת שלה וקבעו את התושבת על הבמה הממוטרת. אתרו את דיסקת הכנף המקורית באמצעות ה-LMD 6,000 המשמש כמיקרוסקופ רגיל. התמקדו בה והגדירו את החיתוך.שרטטו שטח אובלי שיכיל את שני צדי הדיסק, את החלק החיובי ל-GFP ואת החלק השני. בחרו את מכסה המבחנה שבה תרצו לאסוף את החלק החיובי ל-GFP. לחצו על כפתור Start cut.המיקרו-דיסקטור (micro dissector) ממשיך בחיתוך הרקמה במהירות ובבעוצמה שהוגדרו מראש באמצעות בחירת פונקציות ההזזה והחיתוך. ניתן לדייק את החיתוך ידנית עד שנפלה חתיכת הרקמה שלא נבחרה. האנימציה התלת-ממדית מראה את התהליך המתרחש תחת חיתוך המיקרו-דיסקטור, כאשר קרן לייזר ממוקדת על הרקמה ומבצעת חיתוך לאורך ההיקף שנבחר.לאחר ביצוע החיתוך, פיסת הרקמה נופלת אל תוך מכסה המבחנה הנבחרת ובעקבות זאת אל תוך ה-tri Reagent. לאחר החיתוך הראשון, העבירו את אזור החיתוך לצד השני של דיסקיות הכנף (wing disc) כדי לחתוך אזור מקביל שלילי ל-GFP. לפני ביצוע החיתוך החדש, הקפידו לבחור מכסה מבחנה שונה כדי להפריד בין הרקמות החיוביות ל-GFP לרקמות השליליות ל-GFP.לחץ על כפתור תחילת החיתוך (start cut) לאחר החיתוך האוטומטי. המשך לעדן את החיתוך באופן ידני כפי שמוצג באנימציית התלת-ממד לפני החיתוך השני. השולחן הממוטרי מזיז את מכסה המבחנה הנבחר אל אזור החיתוך.קרן הלייזר מתמקדת ברקמה לאורך ההיקף שנבחר, ולאחר השלמת החיתוך, חתיכת הרקמה נופלת אל תוך מכסה המבחנה הנבחרה המכילה Tri reagent. כדי לאסוף מספיק חומר, חזרנו על הפרוצדורה במאה דיסקים של כנפי בוגר (imaginal wing discs). לאחר איסוף הדגימות, הוצא את המבחנות.זהו שלב עדין שעלול להוביל לאובדן כל העבודה שביצעת עד כה, לכן יש לנהוג בזהירות. סגור את המכסה כשהוא הפוך והמשך בניסוי.זהו הרקמה החיובית ל-GFP. זוהי הרקמה השנייה, החיובית ל-GFP. שלב שש, פרופיל תעתוק.סובב את המבחנות כדי להפריד את הנוזל מהמכסה והוסף עד מיליליטר אחד של ריאגנט Try. בצע מיצוי RNA בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי של ריאגנט try ממאה אזורים בשטח של כ-5,000 µm² כל אחד. התנובה שהשגנו הייתה 1.5 µg של RNA.השתמשנו ב-superscript three ב-vitrogen כדי לסנתז CD NA עם hexa אקראי. דיוק הדיסקציה הידנית נבדק על ידי בדיקת ביטוי GFP בשני הדגימות באמצעות R-T-P-C-R. כפי שמוצג בג'ל עם R-T-P-C-R כמותי.הערכנו את רמות הביטוי של הגן המודחק X יחד עם רמות הביטוי של מטרות פוטנציאליות אפשריות של מסלול הוויסות המתווך על ידי הגן X. דיאגרמה זו מציגה דוגמה לרמות הביטוי של הגן X ואחד ממטרותיו הפוטנציאליות. נקרא להן גנים Y ביחס לרמות הביטוי הבסיסיות שלהם במדורים הקדמיים והאחוריים של דיסקיות כנף שאינן מוצקות.נמצא כי הפעילות של הגן הנבחר X פחתה ל-40% לאחר השתקה. לעומת זאת, אחד מיעדיו המשוערים, הגן Y, נמצא במצב של ביטוי מוגבר (upregulated) באופן משמעותי, עם עלייה פי שבעה, מה שהוביל אותנו לתקף את ההשערה כי הוא מווסת באופן שלילי על ידי הגן X. אנו מסיקים כי הגישה הניסוית המתוארת לעיל יכולה להיות מיושמת בהצלחה לאימות של יעדים משוערים במסלולי בקרה מגוונים.

laser-microdissection-applied-to-gene-expression-profiling-subset

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה לבידוד יחידים או...

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

המבנים הבוגרים של דרוזופילה נגזרים ממבנים דמויי שק הנקראים דיסקים דמיוניים. ניתוח דיסקים אלה מספק תובנה לגבי תהליכים התפתחותיים רבים כולל קביעת רקמות, קביעת גבול תאים, התפשטות תאים, מפרט גורל התא וקוטביות תאים מישוריים. פרוטוקול זה משמש להכנת דיסקים דמיוניים למיקרוסקופ אור/פלורסנט.

נתיחה וImmunostaining של דמותי דיסקים מ Melanogaster דרוזופילה

כאן אנו מציגים פרוטוקול למיקרו-דיסקציה בסיוע לייזר של סוגי תאי צמחים ספציפיים לפרופיל שעתוק. בעוד שהפרוטוקול מתאים למינים וסוגי תאים שונים, ההתמקדות היא בתאים בלתי נגישים מאוד של קו הנבט הנקבי החשובים לרבייה מינית ואפומית בסוג המצליבים Boechera.

Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים

פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מסומן פלורסנטי, גידולים המשובטים מוגדר גנטית בעין תסיסנית / דיסקים דמותי מחושים (EAD). הוא מתאר כיצד לנתח את EAD והמוח מן הזחלים instar השלישי וכיצד לעבד אותם לחזות ולכמת שינויים בהתבטאות גנים הפולשנות הגידול.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

לגנים רבים בעלי חשיבות התפתחותית יש דפוסי ביטוי ספציפיים לתאים או לרקמות. מאמר זה מתאר ניסויי LM RNA-seq לזיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בגבול להב-נדן עלי התירס ובמוטציות lg1-R בהשוואה לסוג בר. השיקולים הניסיוניים שנדונו כאן חלים על ניתוחים טרנסקריפטומיים של תופעות התפתחותיות אחרות.

עיצוב ניסיוני עבור לייזר Microdissection RNA-seq: לקחים מניתוח התפתחות תירס ליף

היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים ברקמות דרוזופילה הוא קריטי עבור הלומדים שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח. הנה התיאור של תהליך פשוט לנתח כנפיים הגולמי. אלה כנפיים יכול לשמש כדוגמאות מספר טכניקות (אימונוהיסטוכימיה, PCR assay, וכו ').

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

פרוטוקול זה מתאר מיקרוניתוח לכידת לייזר עבור הבידוד של סחוס ועצם מחלקים קפואים טריים של העובר העכבר. סחוס ועצם יכול להיות דמיינו במהירות על ידי cresyl סגול כתמים ונאסף בדיוק כדי להניב RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח transcript.

לכידת לייזר מיקרו חיתוך של העכבר סחוס ועצם עבור ניתוח ביטוי גנים

עיתוי החשיפה לליפות עלול להשפיע על תוצאותיה ההתפתחותיות. כאן אנו מראים כיצד לשחרר את התמונה של חלבון מורפולאחר העצם של דרוזוהילה (BMP) שנקרא dpp מתאים של הדיסק כנף.

שחרור הדמיה מתוך דיסק כנף של דרוזופילה

מתואר פרוטוקול המשתמש במיקרו-דיסקציה של לייזר כדי לבודד רקמות נמטודה בודדות לריצוף RNA. הפרוטוקול אינו דורש ערכות כלים גנטיות ספציפיות למינים, מה שמאפשר להשוות פרופילי ביטוי גנים בין מינים שונים ברמה של דגימות של רקמה אחת.

מיקרו-דיסקציה של לייזר עבור יישומים של רקמה אחת אגנוסטית של מינים

אנו מתארים פרוטוקול למדידת מגעים בין תאים בשכבות אפיתל סמוכות בדיסקים דמיוניים חיים של כנפי דרוזופילה באמצעות גישה מבוססת בנייה מחדש של GFP.

מערכת ביטוי כפול מבוססת השלמת GFP להערכת מגע תא-תא בתיווך ציטונמים בדיסקים דמיוניים חיים של כנף דרוזופילה

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל לפירוק דיסק דמיוני וצביעת נוגדנים, שהוא חסכוני עם מגיבים ומקל על טיפול בדיסקים דמיוניים במספרים קטנים.

כריתה בקנה מידה קטן וצביעת נוגדנים של דיסקים דמיוניים באנטנות העיניים והכנף מ-Drosophila melanogaster

למדו פרופיל ביטוי גנים באמצעות מיקרודיסקציה לייזרית בדיסק כנף של Drosophila. השיטה מאפשרת השוואת אזורים מושתקים ולא מושתקים לניתוח רגולציה גנית בסביבת רקמה טבעית.

Microdissection לייזר יישומית כדי Gene Expression Profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק

גלה סרטונים נוספים