Microdissection לייזר יישומית כדי Gene Expression Profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק

כאן אנו מספקים תיאור יסודי של מיקרו-דיסקציה בלייזר המיושמת כדי להשיג פרופיל תעתיק RNA בהשוואה של אזורים מושתקים ולא מושתקים של דיסק הכנף של הדרוזופילה. גישה זו דורשת כחומר ביולוגי, דיסקי תמונה של דרוזופילה מנותחים ידנית כציוד עיקרי, מיקרו דיסקטור לייזר. אנו משתמשים ב-LI A-L-L-M-D 6, 000 ובמכונת PCR בזמן אמת.

השתמשנו ב-IQ של BioRad. חמישה כלים קטנים הנדרשים הם צלחת קעורה, מלקחיים קטנים של מכחול מיקרו-דיסקציה תלויים, פינג חרקים טיפה, רכוב על מחטי מזרק, מסגרת מתכת עם קרום PET, צינורות פלסטיק קטנים. שיטה זו כוללת את השלבים הבאים.

שלב ראשון לחציית שני קווים טרנסגניים מתאימים על מנת לעורר השתקת גנים מקומית וספציפית בצאצאים תוך שימוש במערכת GAL 4 UAS. שלב שני, לטיפול במסגרות הדיסקציה. שלב שלישי, כדי להגדיר את דיסקטור המיקרו בלייזר.

שלב רביעי, לאסוף ידנית את הדיסקים הדמיוניים של הכנף מצאצאי הזחל של הצלב הגנטי. שלב חמישי, לבצע מיקרו-דיסקציה בלייזר של אזורים ספציפיים ב-GFP המסומנים כדיסקים דמיוניים. שלב שישי, פרופיל שעתוק של אזורים שווים של אזורים מושתקים ולא מוצקים של הדיסק יאפשר לבסס את ההשפעות המופעלות על ידי השתקת הגן המעניין שלך.

קרא לזה גן X in vivo פרופיל שעתוק ידרוש מיצוי של RNA מהאזורים המנותחים, שליטה על דיוק הדיסקציה הידנית, הערכת ביטוי GFP בשתי הדגימות על ידי R-T-P-C-R, כימות הביטוי המשוער. מטרות של גן השתיקה בשתי הדגימות על ידי R-T-P-C-R בזמן אמת או על ידי ביצוע ניתוח מיקרו-מערך. עכשיו פרטים נוספים על כל שלב.

הצעד הראשון, הצלב הגנטי. ההכלאה הגנטית מערבת GAL ארבעה זנים טרנסגניים של כטב"מים ומתמקדת בהשגת דיסקים דמיוניים מושתקים בצאצאי הזחל. מערכת GAL four הרב-תכליתית מאפשרת לך להפעיל השתקת גנים ספציפית ומקומית על ידי הפרעות RNA.

זן אחד מציג בצלב את הטרנסגן המניע המבטא GAL 4 בתבנית זמנית או מרחבית ספציפית. ומדווח A-U-A-S-G-F-P המאפשר ויזואליזציה של תחום הביטוי GAL ארבעה. הזן השני מציג טרנסגן מגיב כטב"ם המבטא RNA משתיק סיכות ראש, המסוגל לכוון ספציפית לגן X לאחר שהתבטא בתא.

RNA זה נחתך כדי ליצור RNA מפריע קטן, המסוגל להשתיק באופן ספציפי את הגן הנבחר X בצאצאים של הכלאה זו. טרנסגן ההשתקה של הכטב"מים מועתק רק באותם תאים המבטאים את חלבון GAL 4, ובכך גורם להשתקה מוגבלת מרחבית של הגן X. בין מגוון היישומים, התמקדנו בפרופיל תעתיק RNA בדיסק הכנף המושתק על ידי דרייבר Grailed GAL four, המכוון השתקה ספציפית בתא האחורי.

אזור השקט מסומן על ידי ביטוי הטרנסגן U-A-S-G-F-P. בתא האחורי. שני אירועים יופעלו לביטוי של GGFP והשתקה של גן x.

שלב שני, טיפול במסגרות הדיסקציה כדי לעכב את פעילות הרנ"א. שטפו את מגלשות המסגרת וכלי החיתוך במי DEPC למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר ותנו להם להתייבש בתא סטרילי. כדי לעכב את פעילות ה-RNA, השתמש בשפופרת חדשה לגמרי של 50 מ"ל שכבר נטולת RNA, מלאה במי DEPC עם מלקחיים שהוכנסו לצינור, מגלשת טיפה תלויה ומסגרת לחיות מחמד.

שניהם דרושים למיקרו-דיסקציה. סגור את הצינור, הפוך אותו הפוך, ואז השאיר אותו להגיב למשך שעה לפחות. בטמפרטורת החדר, שעה לאחר מכן, העבירו את מי ה-DEPC לצינור אחר בעזרת המלקחיים.

החזק את המגלשות בתוך הצינור כדי שלא ייפלו. לאחר מכן הניחו לשקופיות להתייבש בתוך הצינור. שלב שלישי, הגדרת מיקרו-דיסקט.

ראשית, הפעל את כל המכשירים הדרושים, נורת הקרינה, המיקרוסקופ והתוכנה למיקרודיסקציה. חלון אזהרה יזכיר לך להפעיל גם את הלייזר. עשה זאת ותן ללייזר להתחמם בזמן שאתה מסיים את הגדרת המיקרו-דיסק.

עכשיו הגיע הזמן להכין את הבארות בהן ניתן לאסוף את הרקמה. חתך. ציוד חיתוך הלייזר Leica LMD 6,000 מאפשר טעינה של עד ארבעה צינורות לאיסוף דגימות שונות. למטרתנו, אנו זקוקים רק לשני צינורות.

האחד, לאסוף את רקמת השתיקה החיובית של GFP, השני לאסוף רקמת יוניל שלילית של GFP עם מיקרו pec. מלאו את שני מכסי הצינור ב-20 מיקרוליטר של תמיסת טרי-ריאגנט כדי לשמר את ה-RNA. כעת המיקרודיסקט מוכן לשימוש בשלב הרביעי, דיסקציה ידנית של דיסקיות הדמיית כנף מזחלי ג'וף.

בודד דיסקי כנף מצאצאי הזחל שהושגו כפי שתואר קודם לכן, וודא שרקמות אחרות אינן מזהמות את הדיסקים כדי להשיג מטרה זו, גישת הדיסקציה שלי שונה למדי מזו הנפוצה לאיסוף עיקר כל הדיסקים המקוריים. ראשית, שטפו את הזחל בתמיסת הצלצול כדי להסיר חומר דבק. לאחר מכן העבירו אותו למגלשת טיפה תלויה וחתכו את הראש מיד ומשכו את הפה כלפי מטה.

בעזרת סיכות החרקים ניתחו כעת בזהירות רקמות אחרות. קווי המתאר האדומים מציגים את דיסקיות הכנף הדמיוניות שיש לאסוף. שמור על הדיסקים נקיים מהרקמה הדביקה במהירות ובעדינות העבר כל דיסק כנף מבודד למסגרת חיתוך לחיתוך מיידי.

יש לחזור על הליך זה עד להגעה למספר הכולל של מאה דיסקי כנף. שלב חמישי, מיקרו-דיסקציה בלייזר של אזורים ספציפיים של דיסקי כנף המסומנים ב-GFP. ברגע שדיסק הכנף המקורי נמצא על הממברנה, אתה יכול להמשיך בחיתוך.

הניחו את המסגרת על המחזיק שלה וקבעו את המחזיק על הבמה הממונעת. חפש את דיסק הכנף המקורי באמצעות LMD 6,000 כמיקרוסקופ נפוץ. התמקדו בו וקבעו את הגזרה.

צייר אזור אליפסה שיתאים משני צידי הדיסק, ה-GFP החיובי והשני. בחר את מכסה הצינור שבו ברצונך לאסוף את החלק החיובי של GFP. לחץ על כפתור התחל לחתוך.

המיקרו דיסקטור ממשיך בחיתוך הרקמה במהירות ובעוצמה שהגדרת קודם על ידי בחירת הפונקציה הזז וחתך. ניתן לחדד את החיתוך באופן ידני עד שפיסת הרקמה שלא נבחרה נופלת. האנימציה התלת מימדית מראה מה קורה מתחת למיקרוס דיסקטור חיתוך לייזר מתמקד ברקמה ביצוע חתך לאורך ההיקף שנבחר.

לאחר סיום החיתוך, פיסת הרקמה נופלת במכסה הצינור שנבחר וכתוצאה מכך במגיב המשולש. לאחר החיתוך הראשון, הזז את אזור החיתוך בצד השני של דיסק הכנף כדי לחתוך אזור שלילי GFP שווה ערך. לפני שתמשיך בחיתוך החדש, הקפד לבחור מכסה צינור אחר כדי להפריד בין הרקמות החיוביות של GFP לשלילי GFP.

לחץ על כפתור התחלת החיתוך לאחר החיתוך האוטומטי. המשך לליטוש החיתוך באופן ידני כפי שמוצג על ידי האנימציה התלת מימדית לפני החיתוך השני. השלב הממונע מזיז את מכסה הצינור שנבחר מתחת לאזור החיתוך.

קרן הלייזר מתמקדת ברקמה שנחתכה לאורך ההיקף שנבחר, וברגע שהחיתוך נעשה, פיסת הרקמה נופלת במכסה הצינור שנבחר המכיל מגיב Tri. כדי לאסוף מספיק חומר, חזרנו על ההליך על מאה דיסקי כנף דמיוניים. לאחר שאספתם את הדגימות, פרקו את הצינורות.

זהו שלב עדין שיכול לגרום לך לאבד את כל העבודה שעשית עד כה. אז היזהר. סגור את המכסה הפוך והמשך בניסוי.

זה זה עם רקמה חיובית ל-GFP. זה השני עם רקמה שלילית GFP. שלב שישי, פרופיל תמלול.

סובב את הצינורות כדי לנתק את הנוזל מהמכסה ולהוסיף נסה מגיב עד מיליליטר אחד. בצע מיצוי RNA בהתאם לפרוטוקול הניסיון הסטנדרטי של ריאגנטים ממאה אזורים של כ-5,000 מיקרומטר בריבוע כל אחד. היבול שלנו היה של 1.5 מיקרוגרם RNA.

אנו משתמשים בכתב עילי שלוש בוויטרוגן כדי לסנתז CD NA עם הקסמה אקראית. דיוק הדיסקציה הידנית נשלט על ידי בדיקת ביטוי ה-GFP בשתי הדגימות על ידי R-T-P-C-R. כפי שהוצג בג'ל עם R-T-P-C-R כמותית.

הערכנו את רמות הביטוי של גן השתיקה X יחד עם אלו של מטרות אפשריות של מסלול ויסות מתווך גן X. תרשים זה מציג דוגמה לרמות הביטוי של גן X ואחד המטרות המשוערות שלו. קראו להם גנים Y ביחס לרמות הביטוי הבסיסיות שלהם בתאים האחוריים הקדמיים של דיסקי כנף לא מוצקים.

הפעילות של הגן X שנבחר נמצאה מופחתת ל-40% עם ההשתקה. לעומת זאת, אחד היעדים המשוערים שלו, גן Y, נמצא מווסת משמעותית פי שבעה מה שהוביל אותנו לאמת את ההשערה שהוא מווסת באופן שלילי על ידי גן X. אנו מסיקים כי ניתן ליישם בהצלחה את הגישה הניסויית המתוארת לעיל לאימות מטרות משוערות במסלולי רגולציה מגוונים.