שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג'ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa
14 באפריל 2010
הליך זה מתאר את זרימת עבודה קלה ומהירה להציג siRNA לתוך קשה transfect שורות תאים ופעל ביטוי גנים על ידי ה-PCR בזמן אמת. שימוש נגד תא אוטומטי, רב גם צלחת electroporation, ותחנת אלקטרופורזה אוטומטיות לספק תוצאות מהיר ואמין ללא צורך בטיפול רובוטית יקר.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש באלקטרופורציה כדי להחדיר siRNAs לתאים קשים להעברה על מנת לחקור ביטוי גנים. זה מושג על ידי קביעת כמות תרחיף תאי האווה הדרושה באמצעות ה-TC 10. לאחר מכן מתווסף אירנה אוטומטי של מונה תאים לתרחיף התאים והתאים נוצרים אלקטרו.
באמצעות מערכת האלקטרופורציה MXL התאים מודגרים למשך 24 שעות לאחר האלקטרופורציה. לאחר מכן מתווסף IL ארבע כדי לגרום לשעתוק גנים בתאי ניסוי. לבסוף, מופק RNA ונעשה שימוש ב-PCR בזמן אמת למדידת רמות ביטוי הגנים.
בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את ההשפעה של siRNAs ספציפיים על מסלולי ביטוי גנים. היי, אני אדם מקוי, מדען בכיר בחטיבת ביטוי הגנים של מעבדות Bio Rad. היום נראה לך נוהל להכנסת RNA לקווי תאים קשים להעברה על ידי אלקטרופורציה ולאחר מכן נבחן את ההשפעות על ביטוי גנים.
אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לנתח ביטוי גנים של גנים בודדים או לחקור מסלולי גנים על ידי חיסול גן אחד וחיפוש השפעות במורד הזרם. אז בואו נתחיל. בעבודה מתחת למכסה המנוע של תרבית תאים, הסר את התאים מבקבוק תרבית.
התאים המשמשים בפרוטוקול זה הם תאי השעיה. אם אתה משתמש בתאים דביקים, תצטרך לנסח את עיני הטריפסין לפני הסרתם. צנטריפוגה את התאים כדי לגלול אותם.
לאחר שהתאים סובבו כלפי מטה, הסירו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-PBS. כדי לקבוע את מספר התאים החיים, קחו מנה של תרחיף התאים והוסיפו כתם כחול טריאן ביחס של אחד לאחד כדי להכתים את התאים המתים. טריאן כחול נדרש להערכת תאים מתים חיים, אך לא לספירת התאים הכוללת.
צנר רק את התערובת על פתח שקופית ספירה חד פעמית והכנס אותה לדלפק התאים האוטומטי TC 10. ה-TC 10 יתמקד תחילה באופן אוטומטי כדי להבטיח את הספירה המדויקת ביותר ולאחר מכן נתחיל לספור את התאים. מוצג מספר התאים החיים וסך הכל למיליליטר במדגם.
בחר תמונת תצוגה כדי להציג את התאים במסך התצוגה. לאחר מכן באמצעות החצים למעלה או למטה. התקרב או הקטן לפי הצורך כדי לחשב את כמות תרחיף התאים הדרושה לניסויים, בחר מחשבון דילול.
הזן את הריכוז הרצוי וערכי הנפח הסופיים לניסוי זה. יוכנו 16 דגימות בסך הכל, כולל כפילויות לכל טיפול. כך שיהיה צורך בסך הכל ב -3.6 מיליליטר של חמישה כפול 10 מתוך ששת התאים למתלה מיליליטר.
לאחר מכן, מונה התאים ידווח על נפח תרחיף התאים הדרוש על סמך ספירת התאים החיים וערכי היעד שהוזנו. אם נעשה שימוש בכחול TRIAM, המונה יתאים אוטומטית לדילול אחד לאחד בו נעשה שימוש. עכשיו מתחת למכסה המנוע, העבירו את הנפח המחושב של תרחיף התאים לצינור חדש.
לאחר מכן סובב את תערובות התאים כדי לגלול את התאים בזמן שהתאים מסתובבים כלפי מטה. הכן צינורות מיקרו פוגה לאלקטרופורציה על ידי הוספת SIR A לכל צינור. לניסוי זה, אחד מבקרי irna שני stat 6 siRNAs ספציפיים ויוכנו בקרות לא כריתה לאחר הצנטריפוגה, הסר את ה-PBS והשהה מחדש את התאים ב-3.6 מיליליטר של מאגר אלקטרופורציה של פולסר מעביר 800 מיקרוליטר aliquots לתוך צינורות המכילים את ה-IRNA המתאים ומערבב בעדינות.
התאים מוכנים כעת לאלקטרופורציה כדי לאכול את כל הדגימות בו זמנית. באמצעות מערכת האלקטרופורציה MXL העבירו 150 מיקרוליטר מכל תרחיף תאים לבארות המתאימות של צלחת אלקטרופורציה של 96 בארות. לאחר מכן, הכניסו את הצלחת לתא הצלחת של מערכת האלקטרופורציה MXL וסגרו את המכסה.
בחר את פרוטוקול האלקטרופורציה הרצוי ולחץ על הדופק כדי לאכול את התאים לאחר השלמת האלקטרופורציה, הסר את הצלחת מהמכשיר והעביר את התאים לצלחת תרבית רקמה חדשה המכילה טרום חם עד בינוני. לאחר מכן, העבירו 150 מיקרוליטר של תאי בקרה לא מדורגים עבור כל דגימה למנה החדשה. לאחר מכן הניחו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך הלילה.
לאחר 24 שעות, השתמש ב-IL ארבע כדי לגרום לשעתוק גנים בקבוצה אחת של תאים ולהוסיף מדיום רק לקבוצה השנייה. IL ארבע אחד מתווסף לתאים. דגירה של 24 שעות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני לאחר סה"כ 48 שעות של צמיחה.
יכולים להיות הבדלים גדולים בצפיפות התאים אם הטיפול הניסיוני משפיע על חלוקת התאים. לכן מומלץ להשתמש במונה התאים האוטומטי TC 10 כדי לספור במהירות את התאים שוב על סמך ספירת התאים. מעבירים אליקוט אחד מכל באר לצינור מיקרו פוגה למיצוי RNA והקפאה.
תוספת שנייה לכתמים מערביים או ניתוח חלבון אחר. היום יוצג רק זרימת העבודה של RNA. צנטריפוגה את הדגימות כדי לגלול את התאים.
לאחר מכן הסר והשליך את ה-SUP natin מכל צינור. המשך במיצוי ה-RNA באמצעות ערכת ה-RNA הכוללת של אורום. לאחר מיצוי ה-RNA, המשך מיד בניתוח, תוך שמירה על הדגימות על הקרח.
כדי לאמת את איכות וכמות ה-RNA בשלב אחד, השתמש בחום של תחנת האלקטרופורזה האוטומטית של Experian כדי לנטרל את הדגימות ואת סולם ה-RNA של Experian ולהניח על קרח. הוסף תערובת מוכנה של הג'ל והכתם לתחול. ובכן על שבב RNA, הגדר את קוד ההתחלה בתחנת ההתחלה.
הנח את השבב בתחנת ההתחלה האוטומטית ולחץ על התחל. הסר את השבב מתחנת ההתחלה וטען את השבב. מערבל את השבב כדי לערבב דגימות עם מאגר טעינה.
הנח את השבב בתחנת האלקטרופורזה והתחל בריצה. תוכנת Experian תציג תוצאות באופן אוטומטי בצורה של אלקטרופרוגרמה, טבלת תוצאות המציגה את היחס הריבוזומלי של ריכוז ה-RNA, ומספר מחוון איכות ה-RNA וג'ל וירטואלי, שנראה דומה לג'ל RNA מסורתי. דגימות RNA כוללות באיכות גבוהה יהיו בדרך כלל בעלות RQI של שמונה עד 10.
לאחר אימות איכות ה-RNA, הכן את תגובות ה-CD NA כאן. תסריט IS ONEstep R-T-P-C-R מיקס משמש לשילוב סינתזת CD NA ו-PCR בזמן אמת. בתגובה אחת, הכינו תערובת מאסטר המכילה את כל מרכיבי התגובה למעט תבניות ה-RNA עבור כל ערכת פריימר.
לאחר מכן מחלקים את התערובת לבארות של צלחת PCR. לאחר דילול ה-RNA לריכוז אחיד, הוסיפו את הדגימות לבארות המתאימות ושילשו. אטום את הצלחת, הנח אותה במכונת ה-PCR בזמן אמת, ולאחר מכן בחר את הפרוטוקול המתאים והתחל את הריצה לאחר השלמת הריצה, השתמש בעקבות בזמן אמת כדי לקבוע את רמות הביטוי.
התוכנה מחשבת ביטוי גנים מנורמל מהנתונים על סמך ביטוי יחסי של גנים ניסיוניים וגנים ייחוס בתאים מטופלים ומבוקרים. איור זה מציג סקירה כללית של קשירת מסלול האיתות IL 4 של IL 4 לקולטן שלו. מוביל לדיאאריזציה והפעלה של STAT שש, STAT שש מופעל מעביר טרנסלוקציה לגרעין ומפעיל שעתוק של המטרה שלו.
גנים כגון CCL 17 ללא IL 4 שעתוק אינדוקציה של CCL 17 יישארו ברמות מכוננות נמוכות לאחר השתקה בתיווך אירנה של הגן STAT six. טיפול ב-IL 4 אמור להוביל לעלייה מועטה או ללא עלייה בביטוי CCL 17. השראת CCL 17 על ידי IL 4 נמדדה בתנאים שונים בזמן אמת כמותני.
דגימות PCR שגדלו ללא IL 4 היו בעלות רמת ביטוי מכוננת נמוכה. ללא קשר לאדוני, A שנמסר כפי שמוצג בדגימות ביקורת ירוקות וכחולות הגיב כרגיל לטיפול ב-IL 4 עם אינדוקציה של פי שמונה עד עשרה של CCL 17. עם זאת, תאים שהועברו עם siRNAs המכוונים ל-STAT 6 המוצגים באדום וורוד הפחיתו את ביטוי CCL L 17 בתגובה ל-IL 4 התומכים ברעיון ש-STAT 6 ממלא תפקיד בביטוי המושרה של IL 4 של CCL 17.
זה עתה הראינו לכם כיצד לנקב siRNAs לקו תאי השעיה קשה להעברה וכיצד לעקוב אחר ביטוי גנים בתאים אלה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על עקביות ככל האפשר בכל הדגימות. אז זהו.
תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה
הליך זה מתאר זרימת עבודה להכנסת siRNA לקווי תאים קשים לטרנספקציה ולניתוח ביטוי גנים באמצעות PCR בזמן אמת. השימוש במערכות אוטומטיות משפר את היעילות והדיוק בתהליך.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאים
- ביטוי גנים
- טכניקות אלקטרופורציה
רקע
- אלקטרופורציה היא שיטה המשמשת להכנסת חומצות גרעין לתאים.
- קווי תאים קשים לטרנספקציה מהווים אתגר במחקרי ביטוי גנים.
- PCR בזמן אמת היא שיטה אמינה לכימות ביטוי גנים.
- מערכות אוטומטיות יכולות לייעל את זרימת העבודה ולשפר את התוצאות.
מטרת המחקר
- להכניס siRNAs לקווי תאים מאתגרים.
- להעריך את ההשפעה של siRNAs על מסלולי ביטוי גנים.
- להשתמש בטכניקות אוטומטיות ליעילות.
שיטות ששימשו
- הכנת השעיה של תאים וספירה באמצעות סופר תאים אוטומטי.
- אלקטרופורציה של תאים עם siRNA באמצעות מערכת האלקטרופורציה MXL.
- גירוי של תעתיק גנים עם IL-4.
- חילוץ RNA ואחריו ניתוח באמצעות PCR בזמן אמת.
תוצאות עיקריות
- הכנסה מוצלחת של siRNAs לקווי תאים קשים.
- מדידה כמותית של רמות ביטוי גנים.
- הדגמה של ההשפעות של siRNAs ספציפיים על מסלולי גנים.
- דגימות RNA באיכות גבוהה המתאימות ליישומי המשך.
מסקנות
- ההליך מאפשר באופן יעיל הכנסת siRNA וניתוח ביטוי גנים.
- מערכות אוטומטיות משפרות את אמינות התוצאות.
- שיטה זו יכולה להיות מיושמת בהקשרים מחקריים שונים הכוללים ביטוי גנים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This workflow enables efficient siRNA delivery into difficult-to-transfect suspension cells, supporting target validation in gene expression studies. Automated cell counting and electroporation improve reproducibility and throughput in early discovery workflows. The approach facilitates mechanistic de-risking of signaling pathways such as IL-4/STAT6 in oncology models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulators like STAT6 in cytokine signaling pathways.
- Operational Value: Uses automated cell counting to standardize input concentrations for consistent transfection efficiency.
- Predictive Value: Supports target de-risking by linking siRNA knockdown to downstream gene expression changes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative gene expression readouts via real-time PCR for pathway analysis.
- Operational Value: Integrates automated electrophoresis for rapid RNA quality and quantity assessment.
- Scalability: MXL electroporation system allows simultaneous processing of multiple samples in 96-well format.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Uses Namalwa cells, a Burkitt lymphoma model, to study IL-4 dependent gene expression relevant to immune oncology.
- Mechanistic Insight: Demonstrates STAT6’s role in CCL17 induction, supporting biomarker-linked pathway validation.
- Preclinical Continuity: RNA quality verification enables reliable downstream applications including protein analysis and functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization by providing reliable gene modulation and quantification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via siRNA-mediated knockdown of signaling nodes in IL-4 pathway.
- Screening: Enables reproducible compound or genetic perturbation assessment through standardized cell preparation.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized gene expression data for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant systems using lymphoma cell models.
- Enterprise Reuse: Automated platforms (TC10, MXL, Experion) are reusable across siRNA, CRISPR, and transfection workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in pathway studies through specific genetic perturbation.
- Operational Value: Automation minimizes user variability in cell counting, electroporation, and RNA QC.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing confidence in target-pathway relationships.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on functional validation in disease-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, electroporation, and nucleic acid handling.
- Depends on access to automated cell counter, electroporation system, and electrophoresis station.
- Necessitates standardization of RNA extraction and QC protocols across teams.
- Adaptation considerations include varying transfection efficiencies across adherent and suspension cell types.
- Practical limitation: Electroporation optimization may be needed for primary or sensitive cell lines.
