שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג'ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשתמש באלקטרופורציה כדי להחדיר siRNAs לתאים שקשה להעביר להם טרנספקציה, וזאת על מנת לחקור ביטוי גנים. הדבר מושג תחילה על ידי קביעת כמות תרחיף התאים הדרושה באמצעות ה-TC 10. Automated cell counter, ולאחר מכן מוסיפים את ה-irna לתרחיף התאים ומבצעים אלקטרופורציה לתאים.

בעזרת מערכת electroporation מדגם MXL, התאים מדגגנים למשך 24 שעות לאחר ה-electroporation. לאחר מכן, מוסיפים IL-4 כדי להשרות שעתוק גנים בתאי הניסוי. לבסוף, מחלצים RNA ומשתמשים ב-real-time PCR למדידת רמות הביטוי הגני.

בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את ההשפעה של siRNAs ספציפיים על מסלולי ביטוי גנים. שלום, אני אדם מקקוי, מדען בכיר בחטיבת ביטוי הגנים של מעבדות Bio Rad. היום נראה לכם את הפרוצדורה להחדרת RNAs לשורות תאים שקשה להעביר להן טרנספקציה באמצעות אלקטרופורציה, ולאחר מכן נבחן את ההשפעות על ביטוי הגנים.

אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לנתח ביטוי של גנים בודדים או לחקור מסלולים גנטיים על ידי ביצוע knockout לגן אחד ובחינת ההשפעות במורד המסלול. לכן, בואו נתחיל. בעבודה תחת מנדף לתרביות תאים, הוציאו את התאים מבקבוק תרבית.

התאים המשמשים בפרוטוקול זה הם תאי תרחיף. אם אתם משתמשים בתאים נצמדים, תצטרכו לבצע trypsinization לפני הסרתם. סבבו את התאים בצנטריפוגה כדי להשקיע אותם.

לאחר שסובבו התאים בצנטריפוגה, הסיר את הנוזל העליון והשהה מחדש את התאים ב-PBS. כדי לקבוע את מספר התאים החיים, קח מנת דגימה (aliquot) מהסספנסיון של התאים והוסף צבע tripan blue ביחס של אחד לאחד כדי לצבוע את התאים המתים. tripan blue נדרש להערכת תאים חיים ומתים, אך לא לספירת תאים כוללת.

העבירו בעזרת פיפטה את התערובת אל פתחו של סלייד ספירה חד-פעמי והכניסו אותו לסופר התאים האוטומטי TC 10. ה-TC 10 יבצע תחילה מיקוד אוטומטי כדי להבטיח את הספירה המדויקת ביותר, ולאחר מכן נתחיל בספירת התאים. מספר התאים החיים וסך התאים למיליליטר בדגימה מוצגים על המסך.

בחר ב-view image כדי להציג את התאים על מסך התצוגה. לאחר מכן, השתמש בחצי חיצים למעלה או למטה כדי להגדיל או להקטין את התצוגה לפי הצורך. כדי לחשב את כמות תרחיף התאים הדרושה לניסויים, בחר ב-dilution calculator.

הזינו את ערכי הריכוז והנפח הסופי הרצויים עבור ניסוי זה. ייערכו 16 דגימות בסך הכל, כולל כפילויות לכל טיפול. לפיכך, יידרשו 3.6 milliliters בסך הכל של תרחיף בריכוז של five times 10 of the six cells per milliliter.

מונה התאים ידווח לאחר מכן על נפח תרחיף התאים הדרוש, בהתבסס על ספירת התאים החיים ועל ערכי היעד שהוזנו. אם נעשה שימוש ב-TRIAM blue, המונה יתקן אוטומטית עבור הדילול ביחס של אחד לאחד שבו נעשה שימוש. כעת, תחת מ 빠르게 (hood), העבירו את הנפח המחושב של תרחיף התאים למבחנה חדשה.

לאחר מכן, סבבו את תערובות התאים במצנטריפוגה כדי לשקיע את התאים. הכינו מבחנות מיקרו-צנטריפוגה לאלקטרופורציה על ידי הוספת SIR A לכל מבחנה. בניסוי זה, יוכנו בקרת irna אחת, שש siRNAs ספציפיות ובקרות ללא חיתוך. לאחר הסבב במצנטריפוגה, הסירו את ה-PBS והשעיקו מחדש את התאים ב-3.6 milliliters של בופר אלקטרופורציה מסוג gene Pulser. העבירו מנות של 800 microliter למבחנות המכילות את ה-IRNA המתאים וערבבו בעדינות.

התאים מוכנים כעת לאלקטרופורציה כדי לטפל בכל הדגימות בו-זמנית. באמצעות מערכת האלקטרופורציה MXL, העבירו 150 µL מכל תרחיף תאים לבארים המתאימות בלוח אלקטרופורציה בעל 96 בארות. לאחר מכן, הניחו את הלוח בתא הלוחות של מערכת האלקטרופורציה MXL וסגרו את המכסה.

בחרו את פרוטוקול האלקטרופורציה הרצוי ולחצו על pulse כדי להעביר פולס לתאים. לאחר השלמת האלקטרופורציה, הוציאו את הפלטה מהמכשיר והעבירו את התאים לפלטה חדשה לתרביות רקמה המכילה מצע מחומם מראש. לאחר מכן, העבירו 150 µL של תאי ביקורת לא שעברו אלקטרופורציה עבור כל דגימה למנתח החדש. לאחר מכן, הניחו את התאים בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך הלילה.

לאחר 24 שעות, השתמש ב-IL four כדי להשרות שעתוק גנים בקבוצה אחת של תאים והוסף מצע בלבד לקבוצה השנייה. הוסף IL four אחד לתאים. דגור למשך 24 שעות נוספות ב-37 °C ו-5% carbon dioxide, לאחר סך כולל של 48 שעות גידול.

ייתכנו הבדלים משמעותיים בצפיפות התאים אם הטיפול הניסיוני משפיע על חלוקת התאים. לכן, מומלץ להשתמש בסופר התאים האוטומטי TC 10 כדי לספור במהירות את התאים שוב על בסיס ספירות התאים. העבירו מנה אחת מכל באר למבחנה למיקרו-צנטריפוגה לצורך הפקת RNA והקפיאו.

מנה שנייה עבור western blotting או ניתוח חלבונים אחר. היום יוצג רק זרימת העבודה של ה-RNA. סבבו את הדגימות בצנטריפוגה כדי לשקיע את התאים.

לאחר מכן, הסירו והשליכו את ה-SUP natin מכל מבחנה. המשיכו במיצוי ה-RNA באמצעות ערכת ה-orum total RNA. ברגע שה-RNA מוצ), עברו מיד לניתוח, תוך שמירת הדגימות על קרח.

כדי לאמת את איכות וכמות ה-RNA בשלב אחד, השתמשו בתחנת האלקטרופורזה האוטומטית Experian, בצעו דנטורציה תרמית לדגימות ולסולם ה-RNA של Experian והניחו על קרח. הוסיפו תערובת מוכנה של ג'ל וצבע לבאר הראשית על שבב RNA, והגדירו את קוד ההפעלה בתחנת ההפעלה.

הניחו את השבב בתחנת ההכנה האוטומטית (priming station) והקישו על start. הוציאו את השבב מתחנת ההכנה והטעינו אותו. ערבבו את השבב באמצעות וורטקס כדי לערבב את הדגימות עם באפר הטעינה.

מקמו את השבב בתחנת האלקטרופורזה והפעילו את הריצה. תוכנת Experian תציג את התוצאות באופן אוטומטי בצורה של אלקטרופורוגרמה, טבלת תוצאות המציגה את ריכוז ה-RNA והיחס הריבוזומלי, את מספר מדד איכות ה-RNA (RQI) וג'ל וירטואלי, הנראה בדומה לג'ל RNA מסורתי. לדגימות RNA כולל באיכות גבוהה יהיה בדרך כלל RQI של 8 עד 10.

לאחר אימות איכות ה-RNA, הכינו כאן את תגובות ה-CD NA. תערובת ה-IS script ONEstep R-T-P-C-R משמשת לשילוב של סינתזת CD NA ו-PCR בזמן אמת. עבור תגובה אחת, הכינו תערובת מאסטר (master mix) המכילה את כל רכיבי התגובה למעט תבניות ה-RNA עבור כל סט פריימרים.

לאחר מכן, חלק את התערובת לבארות של פלטת PCR. לאחר דילול ה-RNA לריכוז אחיד, הוסף את הדגימות לבארות המתאימות בשלוש חזרות (triplicate). אטום את הפלטה, הכנס אותה למכשיר ה-realtime PCR, בחר את הפרוטוקול המתאים והפעל את הריצה; עם השלמת הריצה, השתמש בעקומות ה-realtime כדי לקבוע את רמות הביטוי.

התוכנה מחשבת ביטוי גנים מנורמל מהנתונים על בסיס ביטוי יחסי של גנים ניסיוניים וגני ייחוס בתאים מטופלים ובתאי בקרה. איור זה מציג סקירה כללית של מסלול האיתות של IL four, שבו קישור של IL four לקולטן שלו מוביל לדימריזציה ולהפעלה של STAT six; STAT six פעיל עובר לגרעין ומפעיל את השעתוק של מטרה שלו.

בגנים כגון CCL 17 ללא השראה על ידי IL 4, השעתוק של CCL 17 יישאר ברמות בסיסיות נמוכות לאחר השתקה של הגן STAT 6 באמצעות siRNA. טיפול ב-IL 4 אמור להוביל לעלייה מועטה או ללא עלייה בביטוי של CCL 17. השראה של CCL 17 על ידי IL 4 נמדדה בתנאים שונים באמצעות qPCR.

מדגמי PCR שגודלו ללא IL four הראו רמה נמוכה של ביטוי קונסטיטוטיבי. ללא קשר ל-sir, מדגמי בקרה A שנמסרו כפי שמוצג בירוק ובכחול הגיבו כרגיל לטיפול ב-IL four עם השראה של פי שמונה עד עשרה של CCL 17. עם זאת, תאים שעברו טרנספקציה עם siRNAs המכוונים ל-STAT six, המוצגים באדום ובורוד, הראו ביטוי מופחת של CCL L 17 בתגובה ל-IL four, מה שתומך ברעיון ש-STAT six ממלא תפקיד בביטוי של CCL 17 המושרה על ידי IL four.

הראינו לכם כיצד להחדיר siRNAs לשורת תאי תליה שקשה להחדיר אליהם חומרים, וכיצelijk לעקוב אחר ביטוי גנים בתאים אלו. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על עקביות מרבית בין כל הדגימות. וזהו זה.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.