הפעל מחדש ישיר של מזלג שכפול בדמותה של פולימראז RNA חזיתית

גורלו של replisome הבאה התנגשות עם ראש על RNA פולימראז (RNAP) אינו ידוע. אנו מוצאים כי הדוכנים replisome על התנגשות עם RNAP חזיתית, אך קורות חיים התארכות לאחר עקירת RNAP מ-DNA. MFD מקדמת מחדש שכפול ידי הקלת עקירה של RNAP לאחר ההתנגשות.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להתבונן בגורל אזור Repli ו-RNA פולימראז או RNAP לאחר התנגשות חזיתית. זה מושג על ידי הרכבה ראשונה של קומפלקס השעתוק על DNA ביוטיניל ושיתוק שלו על טבליות Stripp וחרוזים, מה שיביא לעצירה של קומפלקס התארכות RNAP. השלב השני של ההליך הוא לקשור DNA מפוצל לפני הצורך לקומפלקס התארכות ה-RNAP כדי ליצור מזלג שכפול במורד הזרם של ה-RNAP חזיתי.

השלב השלישי של ההליך הוא הרכבת אזור הרפלי והתחלת סינתזת גדיל מובילה במזלג השכפול. השלב האחרון של ההליך הוא לבודד את ה-DNA מהחרוזים המגנטיים ולטהר את ה-DNA על עמודת ניקוי PCR. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שהרוסו נתקע בהתנגשות עם קומפלקס השעתוק החזיתי דרך אגרו ג'ל אלקליין של מוצרי ה-DNA המטוהרים המסומנים ברדיו.

היי, אני ריצ'רד פומרנס מהמעבדה של מייק אודונל באוניברסיטת רוקפלר. היום אראה לנוהל שלך כיצד לבצע התנגשות של הריבוזום עם ראש על RNA פולימראז בשלב מוצק. אני משתמש בהליך הזה במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד תהליך השכפול מושפע ממתחמי שעתוק לאורך הדנ"א.

אז בואו נתחיל. כדי להתחיל את תערובת הפרוטוקולים הזו, אנזים הולו RNAP עם תבנית DNA ביוטינית של 3.6 KB המכילה את מקדם T seven A אחד ב-100 מיקרוליטר של מאגר A דוגר על התערובת למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה של 10 דקות, הוסף ריבונוקלאוטידים אדנוזין, טרי פוספט, ציטידין פוספט ואורידין אלל עדן, מה שיגביל את סינתזת ה-RNA ל-20 נוקלאוטידים.

דגרו את התמיסה למשך 10 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לשתק את קומפלקס ההתארכות של קופי RN שנעצר על חרוזים. הוסף את התמיסה לחרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין. נותנים לתערובת לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

טהר את קומפלקס התארכות ה-RNAP המשותק על ידי שטיפת החרוזים ב-0.9 מיליליטר של מאגר מלח גבוה. כדי להסיר קומפלקסים לא ספציפיים של R-N-A-P-D-N-A לאחר כל שטיפה, הסר את הסופרנטנט על ידי הפרדה מגנטית. יש לחזור על שטיפה זו חמש פעמים.

לאחר מכן יש לשטוף את החרוזים פעמיים נוספות עם 0.9 מיליליטר של מאגר A.לאחר הכביסה הסופית, ניתן להרכיב את מזלג השכפול במורד הזרם ליצירת מזלג שכפול במורד הזרם של ה-RNAP Resus, להשעות את הרצועה המגנטית לחרוזים ברורים המחוברים לקומפלקס התארכות ה-RNAP שנעצר ב-100 מיקרוליטר של מאגר ניו אינגלנד ביולאבס ארבע. לאחר מכן, הוסיפו 10 יחידות של פוספטאז אלקליין שרימפס או SAP, ודגרו את הדגימה למשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם 0.9 מיליליטר חיץ A.לאחר מכן השעו מחדש את החרוזים ב-50 מיקרוליטר של מאגר תגובת קשירה מהיר T.

הוסף שני מיקרוליטר של T ארבע ליגאז מהיר ו-DNA מזלג מראש, דגר את התמיסה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, שטפו את החרוזים שלוש פעמים נוספות עם 0.9 מיליליטר של הקסמר תערובת חיץ A, הליקאז DNAB עם הסטרפטוקוקוס המגנטי A וחרוזים המחוברים לקומפלקס התארכות ה-RNAP שנעצר ולמזלג השכפול במורד הזרם. הכן את התמיסה ב -150 מיקרוליטר של מאגר A ודגר אותה למשך 30 שניות ב -23 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה הקצרה ה -32 ב -23 מעלות צלזיוס. בפולימראז שלושה מהדקי בטא, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P אלפא P 32 עם תווית DGTP ואלפא P 32 עם תווית DATP לנפח של 200 מיקרוליטר. דגרו את הדגימה למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

התחל שכפול על ידי הוספת חלבון קושר DNA חד-גדילי DCTP ו-DTTP. הוסף גם אלפא P 32, שכותרתו DTTP ו-DCTP לנפח סופי של 250 מיקרוליטר. לאחר 10 דקות, סיים את התגובות על ידי הוספת 12 מיקרוליטר של 0.5 EDTA מולארי.

לאחר מכן, הרתיחו את חרוזי ה-strp din כדי לשחרר את ה-DNA מהחרוזים. הסר כל שאריות DNA על ידי טיפול בחרוזים עם חלבון K למשך 30 דקות ב-50 מעלות צלזיוס. הרתיחו שוב את החרוזים והסירו את הסופרנטנט על ידי הפרדה מגנטית.

טהר את הסופרנטנט המשולב המכיל את ה-DNA באמצעות ערכת הניקוי Kyogen PCR. לבסוף, נתח את מוצרי ה- DNA של תווית הרדיו המטוהרת בג'ל ארוס אלקליין התנגשות של האזור עם ראש ב- RNAP מביאה בדרך כלל לשני מוצרים באורך של 2.5 KB ו- 3.6 KB. המכפלה של 2.5 KB מייצגת את אורך ה-DNA מהמזלג ל-RNAP שנעצר.

זה נובע מהתעכבות עם התנגשות עם ה-RNAP. המכפלה של 3.6 KB מייצגת DNA באורך מלא ונובעת מתפוסה לא מלאה של המקדם על ידי RNAP או מקריאה חלקית של ה-RNAP חזיתית. תוצאה טובה מדגימה כי נוצר כ-50% DNA באורך מלא.

עם זאת, במקרים מסוימים, מתרחשת פחות תפוסה של המקדם על ידי RNAP ונצפה אחוז גבוה יותר של DNA באורך מלא. הסיבה לכך היא שאוכלוסייה גדולה יותר של אזורי repli אינה נתקלת בשכפול RNAP בהיעדר RNAP נעצר מביא רק ל-DNA באורך מלא, זה עתה הראינו לך כיצד לבצע שכפול ושלב מוצק בנוכחות קומפלקס התארכות RNA פולימראז נעצר הקשור ל-DNA. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשטוף את קומפלקס השעתוק המופסק במלח גבוה כדי להסיר עודף RNA פולימראז, אשר נקשר באופן לא ספציפי ל-DNA ומעכב את השכפול.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.