Name: הפעל מחדש ישיר של מזלג שכפול בדמותה של פולימראז RNA חזיתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: חקור את התנהגות הרפליזום בעת התנגשות עם פולימראז RNA חזיתית. למד כיצד Mfd מסייע בהפעלה מחדש של שכפול DNA לאחר עצירת הרפליזום והסרת הפולימראז.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו אסירי תודה במיוחד סת Darst לאספקת חלבונים RNAP ו MFD ו וקטורים הביטוי. אנחנו גם להודות סרגיי Borukhov למתן גרב ודן אנג לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם מכון הבריאות הלאומי (MOD) ועל ידי מארי Josee והנרי Kravis מלגה באוניברסיטת רוקפלר (RTP).

בשיטה זו נעשה שימוש במחקר דיווחו <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/327/5965/590/F3">פומרנץ ו או 'דונל, המדע 327, 590-592 (2010)</a> . 1. האסיפה של קומפלקס נעצרה התארכות RNAP בוצעה כדלהלן: 500 nM הריכוז הסופי של ה RNAP coli σ 70 הוא היה מעורבב עם ריכוז 5 nM הסופי של תבנית biotinylated kb 3.6-DNA המכיל את האמרגן T7A1 ב μl 100 של המאגר (20 טריס Cl-(pH 7.5), 8 מ"מ MgCl 2, 0.5 מ"מ mM EDTA, 5 mM DTT, גליצרול 10%) במשך 10 דקות על 37 ° C. 100 מיקרומטר של APU ו -40 מיקרומטר אחד GTP, ATP ו CTP נוספו 10 דקות נוספות ב 37 ° C. 2. Immobilization של מורכבות נעצרה התארכות RNAP על חרוזים streptavidin בוצעה כדלהלן: 200 μl של חרוזים מצופים streptavidin מגנטית (Invitrogen) נוספו התגובה מעל 10 דקות בכל מקום זמני. 3. טיהור המורכב משותקת נעצרה התארכות RNAP בוצעה כדלהלן: החרוזים (מלמעלה) נשטפו 5 פעמים עם 0.9 מ"ל של המאגר מכיל 0.75 M NaCl, 200 מיקרוגרם / מ"ל ​​הפרין, ו -20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ssDNA (supernatant הוסר לאחר כל שלב לשטוף על ידי הפרדה מגנטי.) הבא, חרוזים נשטפו 2 פעמים עם 0.9 מ"ל של חיץ א 4. כינונה של מזלג שכפול יחסית במורד הראש על RNAP בוצעה כדלהלן: חרוזים (מלמעלה) היו resuspended ב μl 100 של ניו אינגלנד Biolabs חיץ 4 ו - 10 יחידות של סאפ אני (ניו אינגלנד Biolabs) נוספה על 10 דקות בשעה 37 ° C. החרוזים נשטפו 3 פעמים עם 0.9 מ"ל של המאגר ואת resuspended אז μl 50 של המאגר תגובה מהירה קשירת T4 (ניו אינגלנד Biolabs). 2 μl של האנזים T4 מהירה (ניו אינגלנד Biolabs) נוספה יחד עם ריכוז 6 nM הסופי של ה-DNA מראש annealed מפוצל (RP10, RP22, RP25) במשך 10 דקות בכל מקום זמני. החרוזים נשטפו 3 פעמים עם 0.9 מ"ל של חיץ א 5. האסיפה של replisome ועל ייזום סינתזה של גדיל מוביל מזלג שכפול בוצעה כדלהלן: 448 pmol של DnaB (כמו hexamer) הודגר עם μl 150 חרוזי חיץ (20 mM טריס Cl-(pH 7.5), 8 מ"מ MgCl 2, 0.5 mM EDTA, 5 מ"מ DTT, גליצרול 10%) במשך של 30 ב 23 ° C. 4.9 pmol של Pol III * (Pol III HE מינוס β), 15 pmol של β, 2 mM ATP, ו - 60 מיקרומטר אחד dGTP ו dATP נוספו בהיקף של μl 200 ו מודגרות עוד 5 דקות על 37 ° C. שכפול יזם על הוספת 10 מיקרוגרם SSB ו - 24 מיקרומטר אחד dATP ו dTTP יחד עם [α-32-P] dTTP ו [α-32-P] dCTP (פעילות ספציפית, 3,000-5,000 עותקים לדקה / pmol) נפח סופי של 250 μL. תגובות הופסקה אחרי 10 דקות על הוספת 12 μl של 500 mM EDTA. 6. טיהור וריכוז של רדיו שכותרתו מוצרי ה-DNA בוצע כדלקמן: החרוזים (מלמעלה) היו מבושלים לאחר התגובה הופסקה על מנת להסיר את ה-DNA מן החרוזים. ה-DNA כל שיורית שנותרה המחוברים חרוזים הוסר על ידי טיפול עם חרוזים proteinase K בנפח של ul 10 למשך 30 דקות ב 50 ° C. החרוזים היו מבושלים אז supernatant הוסר על ידי הפרדה מגנטי. Supernatant משולב הכולל את ה-DNA היה מטוהרים באמצעות PCR Qiagen ערכת ניקוי. מטוהרים רדיו שכותרתו מוצרי ה-DNA נותחו לאחר מכן ג'ל agarose אלקליין. * שכפול בהעדר חזיתית RNAP נעצרה מורכב התארכות בוצעה כאמור לעיל, עם זאת, σ 70 הושמט. נציג תוצאות: התנגשות של replisome עם ראש על RNAP בדרך כלל התוצאות בשני מוצרים של 2.5 קילו ו 3.6 קילו אורך. המוצר 2.5 kb מייצג את האורך של ה-DNA של מזלג כדי RNAP נעצרה תוצאות replisome השתהות על התנגשות עם RNAP. המוצר 3.6 kb מייצגים באורך מלא דנ"א תוצאות תפוסה או חלקית של האמרגן על ידי RNAP או חלקית replisome לקריאה דרך של RNAP חזיתית. תוצאה טובה או מדויק מוכיח כי כ -50% באורך מלא DNA מיוצר. עם זאת, במקרים מסוימים פחות תפוסה של האמרגן על ידי RNAP מתרחשת אחוז גבוה יותר של דנ"א באורך מלא, הוא ציין כי אוכלוסייה גדולה יותר של replisomes לא נתקלים RNAP חזיתית. שכפול בהעדר תוצאות RNAP נעצרה ב-DNA באורך מלא בלבד (3.6 kb). <img src="/files/ftp_upload/1919/1919fig1.jpg" alt="איור 1"> איור. 1 replisome היא הקשתה על ידי חזיתית RNAP. (א) התקנה ניסיונית. E. colאני RNAP מורכב התארכות נעצרה הורכב על ה-DNA המכיל את האמרגן biotinylated T7A1 כפי שתואר לעיל (9). בקצרה, קומפלקס התארכות נעצרה הוקמה 20 bps במורד הזרם האמרגן על ידי דוגרים holoenzyme RNAP עם DNA biotinylated עבור 10 דקות לאחר מכן על ידי תוספת של APU, GTP, ATP ו CTP 10 דקות נוספות. חרוזים streptavidin נוספו 10 דקות נוספות ואז חרוזים נשטפו חמש פעמים עם 0.9 מ"ל של מאגר המכיל 0.75M NaCl, 200 מ"ג / מ"ל ​​הפרין, ו 100 ננומטר גדיל DNA בודד להסיר יציב RNAP-DNA תסביכים NTPs עודף . ה-DNA היה מעוכל לאחר מכן עם SAPI, התרחצתי, ligated ל-DNA מראש annealed מפוצל. החרוזים נשטפו שוב לפני הרכבה של replisome. האמרגן ממוקם 2.5 KB מתוך המזלג מכוונת אל תעתיק ישיר לכיוון המזלג. (ב) DnaB נוספה אז replisome הורכב ושכפול יזם או בנוכחות (מסלול 2) או היעדרות (מסלול 1) של חזיתית RNAP.

<ol><li>Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+and+resolving+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription.</a> DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).</li>
<li>Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-induced+deletions+in+plasmid+vectors%3A+M13+DNA+replication+as+a+source+of+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability.</a> Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).</li>
<li>Trautinger, B. W., Jaktaji, R. P., Rusakova, E., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+modulators+and+DNA+repair+activities+resolve+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription.</a> Mol Cell. 19, 247-247 (2005).</li>
<li>McGlynn, P., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+RNA+Polymerase+by+%28p%29ppGpp+Reveals+a+RecG-Dependent+Mechanism+for+Replication+Fork+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression.</a> Cell. 101, 35-35 (2000).</li>
<li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381, 249-249 (2008).</li>
<li>Labib, K., Hodgson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+barriers%3A+pausing+for+a+break+or+stalling+for+time%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Replication fork barriers: pausing for a break or stalling for time.</a> EMBO Rep. 8, 346-346 (2007).</li>
<li>Bidnenko, V., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+collapse+at+replication+terminator+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Replication fork collapse at replication terminator sequences.</a> Embo J. 21, 3898-3898 (2002).</li>
<li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+mechanics%3A+insights+into+a+twin+DNA+polymerase+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replisome mechanics: insights into a twin DNA polymerase machine.</a> Trends Microbiol. 15, 156-156 (2007).</li>
<li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+replisome+uses+mRNA+as+a+primer+after+colliding+with+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The replisome uses mRNA as a primer after colliding with RNA polymerase.</a> Nature. 456, 762-762 (2008).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-557 (2006).</li>
<li>Yuzhakov, A., Turner, J., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Cell. 86, 557-557 (1996).</li>
<li>Hinkle, D. C., Ring, J., Chamberlin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+assembly+reveals+the+basis+for+asymmetric+function+in+leading+and+lagging+strand+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading and lagging strand replication.</a> J Mol Biol. 70, 197-197 (1972).</li>
<li>Kaplan, D. L., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+binding+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+to+DNA.+V.+T7+RNA+chain+initiation+by+enzyme-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes.</a> Mol Cell. 15, 453-453 (2004).</li>
<li>Park, J. S., Marr, M. T., Roberts, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twin+DNA+pumps+of+a+hexameric+helicase+provide+power+to+simultaneously+melt+two+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twin DNA pumps of a hexameric helicase provide power to simultaneously melt two duplexes.</a> Cell. 109, 757-757 (2002).</li>
<li>Hanawalt, P. C., Spivak, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+Transcription+repair+coupling+factor+%28Mfd+protein%29+rescues+arrested+complexes+by+promoting+forward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 958-958 (2008).</li>
<li>Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+DNA+repair%3A+two+decades+of+progress+and+surprises%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises.</a> Science. 266, 1957-1957 (1994).</li>
<li>Selby, C. P., Sancar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+repair+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled repair and human disease.</a> J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).</li>
<li>Liu, B., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+transcription-repair+coupling+factor.+I.+Structural+domains+and+binding+properties.+Head-on+collision+between+a+DNA+replication+apparatus+and+RNA+polymerase+transcription+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex.</a> Science. 267, 1131-1131 (1995).</li>
<li>George, D. L., Witkin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+excision+repair+in+an+mfd+mutant+of+Escherichia+coli+B%2Fr%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r.</a> Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).</li>
</ol>

כביסה המורכב התארכות נעצרה מאוגדים חרוזים עם מלח גבוהה היא קריטית על מנת להסיר כל אי - יציבות או דווקא מולקולות RNAP כבול. RNAP יש זיקה גבוהה ביותר עבור פריימר-תבנית ה-DNA מבנים סוג. לפיכך, יש צורך להסיר כאלה שאינם ספציפיים RNAP-DNA מתחמי מנת לבצע שכפול מתבנית-פריימר. ריכוז רדיו שכותרתו מוצרי ה-DNA באמצעות PCR Qiagen ערכת טיהור חיוני גם כדי לקבל אות גבוה מספיק רדיואקטיבי כי ניתן לצפות הג&#39;ל.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M-270</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0569S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Quick Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

הפעל מחדש ישיר של מזלג שכפול בדמותה של פולימראז rna חזיתית

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

בשנת vivo מחקרים מראים כי מזלגות שכפול נעצרים עקב מפגשים עם חזיתית מתחמי שעתוק. עם זאת, גורלם של replisome ו RNA פולימראז (RNAP) בעקבות התנגשות חזיתית אינו ידוע. כאן, אנו מוצאים כי ה coli דוכני replisome על התנגשות עם הראש על מורכבות שעתוק, אבל במקום לקרוס, מזלג שכפול נשאר יציב מאוד, ובסופו של דבר יתחדש התארכות לאחר עקירת RNAP מ-DNA. כמו כן, אנו מוצאים כי גורם שעתוק תיקון צימוד, MFD, מקדם מחדש ישירה של המזלג בעקבות התנגשות ידי הקלת עקירה של RNAP. ממצאים אלה מעידים על היציבות הפנימית של מנגנון השכפול ואת תפקיד הרומן מסלול שעתוק מצמידים את התיקון בקידום שכפול בעבר לחסום RNAP.

גורלו של replisome הבאה התנגשות עם ראש על RNA פולימראז (RNAP) אינו ידוע. אנו מוצאים כי הדוכנים replisome על התנגשות עם RNAP חזיתית, אך קורות חיים התארכות לאחר עקירת RNAP מ-DNA. MFD מקדמת מחדש שכפול ידי הקלת עקירה של RNAP לאחר ההתנגשות.

הפעל מחדש ישיר של מזלג שכפול בדמותה של פולימראז RNA חזיתית

מחקרים in vivo מצביעים על כך שפיסוקי השכפול נעצרים בעקבות מפגשים עם קומפלקסי שעתוק המגיעים ממול (head-on). עם זאת, גורלו של הרפליסום וה-RNA...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבחון את גורלם של אזור השכפול (Repli zone) ושל RNA polymerase או RNAP בעקבות התנגשות חזיתית. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הרכבת קומפלקס השעתוק על DNA ביוטינילי וקיבועו על לוחית Stripp וחרוצים, דבר שיוביל לקומפלקס הארכה של RNAP במצב עצירה. השלב השני של הפרוצדורה הוא ליגציה של DNA מזלג מוכן אל קומפלקס ההארכה של ה-RNAP, כדי ליצור מזלג שכפול במורד ה-RNAP שהתנגש חזיתית.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הרכבת אזור השכפול (repli zone) והתחלת סינתזת הגדיל המוביל במזלג השכפול. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא בידוד ה-DNA מהחרוזים המגנטיים וטיהור ה-DNA באמצעות עמודת ניקוי PCR. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כי ה-roso נעצר בעקבות התנגשות עם קומפלקס תעתוק ראש בראש, זאת באמצעות ג'ל אגרוז alkaline של תוצרי ה-DNA המסומנים רדיואקטיבית המטוהרים.שלום, אני ריצ'רד פומרנס מהמעבדה של מייק אודונל באוניברסיטת רוקפלר. היום אדגים לכם את הפרוצדורה לביצוע התנגשות של הריבוזום עם RNA polymerase במצב מוצק. אני משתמש בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד תהליך השכפול מושפע מקומפלקסי טרנסקריפציה לאורך ה-DNA.בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, ערבבו RNAP holo enzyme עם תבנית DNA biotinylated בגודל 3.6 KB המכילה את ה-T seven A one promoter ב-100 µL של buffer a. דגרו את התערובת למשך 10 דקות ב-37 °C. לאחר דגור של 10 דקות, הוסיפו ribonucleotides adenosine, tri phosphate, cytidine phosphate, ו-Aden allele uridine, אשר יגבילו את סינתזת ה-RNA ל-20 נוקליאוטידים.דגרו את התמיסה למשך 10 דקות נוספות ב-37 degrees Celsius כדי לקבע את קומפלקס ההארכה של RN ape שהופסק על גבי חרו지를. הוסיפו את התמיסה לחרוזים מגנטיים מצופים בסטרפטאווידין. השאירו את התערובת לדגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.טהרו את קומפלקס הארכה של ה-RNAP המעוכב והמקובע על ידי שטיפת החרו지를 ב-0.9 milliliters של בופר מלח גבוה. כדי להסיר קומפלקסים לא ספציפיים של R-N-A-P-D-N-A לאחר כל שטיפה, הסירו את supernatant באמצעות הפרדה מגנטית. יש לחזור על שטיפה זו חמש פעמים.לאחר מכן יש לשטוף את החרוזים פעמיים נוספות עם 0.9 milliliters של באפר A. לאחר השטיפה הסופית, ניתן להרכיב מזלג רפליקציה במורד הזרם כדי ליצור מזלג רפליקציה במורד הזרם של RNAP שנע במנוגד (head-On). השעה את רצועת המגנט כדי להביא את החרוזים הקשורים למכלול השחלוף של הארכה של RNAP שהופסק ב-100 microliters של באפר 4 של New England Biolabs. לאחר מכן, הוסף 10 units של פוספטאז שרימפס בסיסי או SAP, והדגר את הדגימה למשך 10 דקות ב-37 degrees Celsius. שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 0.9 milliliters של באפר A. לאחר מכן, השעה שוב את החרוזים ב-50 microliters של באפר תגובת ליגציה Quick T4.הוסיפו שני מיקרוליטרים של quick T4 ligase ו-DNA מזלג שנוצר מראש, והדגירו את התמיסה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, שטפו את החרוזים שלוש פעמים נוספות עם 0.9 מיליליטרים של buffer A. ערבבו hexamer, DNA helicase עם ה-magnetic strep A והחרוזים המחוברים למערך ה-RNAP elongation המעוכב ולמזלג השכפול במורד הזרם. הכינו את התמיסה ב-150 מיקרוליטרים של buffer A והדגירו אותה למשך 30 שניות ב-23 מעלות צלזיוס.לאחר דגירה קצרה של 32 דקות ב-23 degrees Celsius, הוסיפו polymerase three beta clamp, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P, DGTP מסומן ב-alpha P 32 ו-DATP מסומן ב-alpha P 32 עד לנפח של 200 microliters. דגרו את הדגימה למשך חמש דקות ב-37 degrees Celsius.התחילו את השכפול על ידי הוספת חלבון קושר DNA לחוט בודד, DCTP ו-DTTP. הוסיפו גם alpha P 32, DTTP ו-DCTP מסומנים, עד לנפח סופי של 250 µL. לאחר 10 דקות, הפסיקו את התגובות על ידי הוספת 12 µL של EDTA בריכוז 0.5 M.בשלב הבא, הרתיחו את חרוזי ה-strp din כדי לשחרר את ה-DNA מהחרוזים. הסירו שאריות DNA על ידי טיפול בחרוזים ב-proteinase K למשך 30 דקות ב-50 °C. הרתיחו את החרוזים שוב והסירו את הנוזל העליון באמצעות הפרדה מגנטית.טהרו את העילאי המאוחד המכיל את ה-DNA באמצעות ערכת Kyogen PCR cleanup. לבסוף, נתחו את תוצרי ה-DNA המסומנים רדיואקטיבית בגל אלקלין אגרוז. התנגשות של האזור עם RNAP מקדימה מביאה בדרך כלל לשני תוצרים באורך 2.5 KB ו-3.6 KB. התוצר באורך 2.5 KB מייצג את אורך ה-DNA מהמזלג ועד ל-RNAP שעצר.תוצאה זו נובעת מעצירה של השכפול בעקבות התנגשות עם ה-RNAP. המוצר בגודל 3.6 KB מייצג DNA באורך מלא, והוא תוצאה של תפיסה חלקית של הפרומוטור על ידי ה-RNAP או מעבר חלקי של השכפול דרך ה-RNAP במצב של התנגשות חזיתית (head-on). תוצאה טובה מדגימה כי נוצר DNA באורך מלא בכמות של כ-50%.עם זאת, במקרים מסוימים, תתרחש תפיסה נמוכה יותר של הפרומוטור על ידי RNAP וייצפה אחוז גבוה יותר של DNA באורך מלא. זאת מכיוון שאוכלוסייה גדולה יותר של אזורי רפליקציה אינה נתקלת ברפליקציה של RNAP במפגש חזיתי; בהיעדר RNAP שנעצר, תיווצר רק DNA באורך מלא. הרגע הצגנו כיצד לבצע רפליקציה במוצק (solid phase) בנוכחות קומפלקס הארכה של RNA פולימראז שנעצר וקשור ל-DNA. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשטוף את קומפלקס התעתוק שנעצר במלח בריכוז גבוה כדי להסיר RNA פולימראז עודף, הנקשר ל-DNA באופן לא ספציפי ומעכב את הרפליקציה.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

direct-restart-replication-fork-stalled-head-on-rna

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

DT40, מערכת החולייתנים מודל גנטי, מספק כלי רב עוצמה כדי לנתח את תפקוד החלבון. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת ניתוח איכותני של פרמטרים המשפיעים על סינתזת דנ"א בשלב S-של DT40 תאים ברמת מולקולה בודדת.

ויזואליזציה של שכפול ה-DNA של DT40 דגם מערכת החולייתנים באמצעות טכניקה סיב ה-DNA

אנו מתארים כאן מערכת המשתמשת בבלוק חלבון in vivo ספציפי לאתר, הפיך כדי לעכב ולמוטט מזלגות שכפול ב-Escherichia coli. הקמת בלוק השכפול מוערכת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל אגרוז ניטרלי-ניטרלי משמשת להדמיית חומרי ביניים לשכפול.

התרמת סתימה שכפול לאתרים ספציפיים ב<i&gt; E. coli</i&gt; באמצעות מערכת מפעיל פלורסנט מדכא

כאן, אנו מתארים את ההליך לניתוח התקדמות השכפול באמצעות חזרות פתוגניות, נוטות למבנה באמצעות אלקטרופורזה ג'ל דו מימדית.

ניתוח אלקטרופורטי של שכפול באמצעות DNA נוטה למבנה חוזר בתוך אפיזום אנושי מבוסס SV40

טכניקה זו ממחישה דרך יעילה כדי להכין את השכפול פגום מניות retroviral קידוד oncogene אדם, לאחר מכן נעשה שימוש לזירוז המחלה myeloproliferative במודל עכבר.

הפקה של רטרווירוס שכפול פגומים-by transfection חלוף של תאים 293T

פרוטוקול זה מדגים במיקרוסקופ פשוט מולקולה בודדת פלואורסצנציה טכניקה חזותי שכפול ה-DNA על ידי replisomes הפרט בזמן אמת.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

שיטה כדי לספק morpholinos ישירות otocyst דג הזברה ב 24hpf פותחה. שימוש microinjection של morpholinos לתוך לומן של שלפוחית ​​otic ו electroporation אפקט חדירה, הצלחנו לעקוף את ההשפעה של morpholinos על המוח ולקבל השפעות ספציפיות באוזן הפנימית.

משלוח ישיר של MIF Morpholinos Into Otocyst דג הזברה על ידי הזרקת electroporation משפיעה על פיתוח האוזן הפנימית

שיטה זו מתארת סינתזה in vitro בתפוקה גבוהה של mRNA עם כיסוי (capped) וללא כיסוי (uncapped), מפלסמיד ליניארי המכיל את הגן של לוסיפראז Gaussia (GLuc). ה-RNA מטוהר, וחלק מה-RNA ללא הכיסוי עובר תהליך כיסוי אנזימטי באמצעות אנזים הכיסוי של נגיף ה-Vaccinia. בשלב הסופי, ה-mRNA מוחדר (transfection) לתאי HeLa, ותעליל התרבית של התאים נבדק לפעילות לוסיפראז.

בתעתיק במבחנה תקרת של mRNA בלוציפראז Gaussia ואחריו transfection Cell הלה

על ידי שילוב של כל שיטות להר...

רנ&quot;א<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה בעוברי הר שלמים והיסטולוגיה הסלולרית מותאמת לElasmobranchs הימי

חקור את התנהגות הרפליזום בעת התנגשות עם פולימראז RNA חזיתית. למד כיצד Mfd מסייע בהפעלה מחדש של שכפול DNA לאחר עצירת הרפליזום והסרת הפולימראז.

הפעל מחדש ישיר של מזלג שכפול בדמותה של פולימראז RNA חזיתית

גלה סרטונים נוספים