הפעל מחדש ישיר של מזלג שכפול בדמותה של פולימראז RNA חזיתית

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להבחין בגורלו של אזור השכפול (Repli zone) וה-RNA polymerase או RNAP בעקבות התנגשות חזיתית (head-on collision). מטרה זו מושגת תחילה על ידי הרכבת קומפלקס השעתוק על DNA ביוטינילי (biotinylated DNA) וקיבועו על גבי לוחיות וחרוזי Stripp, מה שיוביל לקומפלקס הארכה של RNAP במצב עצירה. השלב השני של הפרוצדורה הוא ליגציה של DNA מזלג (forked DNA) מוכן אל קומפלקס ההארכה של ה-RNAP, כדי ליצור מזלג שכפול במורד ה-RNAP שהתנגש חזיתית.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הרכבת אזור השכפול (repli zone) ויזום סינטזה של הגדיל המוביל במזלג השכפול. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא בידוד ה-DNA מהחרוזיים המגנטיים וטיהור ה-DNA באמצעות עמודת ניקוי PCR. לבסוף, ניתן לקבל תוצאות המראות כי roso נעצר בעקבות התנגשות עם קומפלקס שעתוק במפגש חזיתי, זאת באמצעות ג'ל אגרוס בסביבה בסיסית של תוצרי DNA מסומנים רדיואקטיבית ומטוהרים.

שלום, אני ריצ'רד פומרנס מהמעבדה של מייק או'דונל באוניברסיטת רוקפלר. היום אראה לכם את הפרוצדורה לביצוע התנגשות של ריבוזום עם RNA polymerase בראשו בשלב מוצק. אני משתמש בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור כיצד תהליך השכפול מושפע מקומפלקסים של שעתוק לאורך ה-DNA.

אם כן, נתחיל. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, ערבבו RNAP holo enzyme עם תבנית DNA biotinylated בגודל 3.6 KB המכילה את ה-T seven A one promoter ב-100 µL של buffer a; דגרו את התערובת למשך 10 דקות ב-37 °C. לאחר דגירה של 10 דקות, הוסיפו ribonucleotides adenosine, tri phosphate, cytidine phosphate, ו-Aden allele uridine, אשר יגבילו את סינתזת ה-RNA ל-20 נוקלאוטידים.

דגרו את התמיסה למשך 10 דקות נוספות ב-37 °C כדי לקבע את קומפלקס ההארכה של RN ape שעצר על גבי חרוזיים. הוסיפו את התמיסה לחרוזיים מגנטיים מצופים בסטראפטווידין. הדגירו את התערובת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

טהרו את קומפלקס הארכה של RNAP המעוכב והמוביליזציה על ידי שטיפת החרו지를 עם 0.9 milliliters של בופר מלח גבוה. כדי להסיר קומפלקסים לא ספציפיים של R-N-A-P-D-N-A לאחר כל שטיפה, הסירו את העלייה באמצעות הפרדה מגנטית. יש לחזור על שטיפה זו חמש פעמים.

לאחר מכן יש לשטוף את החרוזים פעמיים נוספות עם 0.9 milliliters של בופר A. לאחר השטיפה הסופית, ניתן להרכיב את מזלג השכפול במורד הזרם כדי ליצור מזלג שכפול במורד הזרם של ה-RNAP שפגש את המכונה ממול. השהה את הרצועה המגנטית כדי להביא את החרוזים הקשורים לקומפלקס הארכה של RNAP שהוצמד ב-100 microliters של בופר 4 מ-New England Biolabs. לאחר מכן, הוסף 10 units של shrimp alkaline phosphatase או SAP one, והדגר את הדגימה למשך 10 דקות ב-37 degrees Celsius. שטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 0.9 milliliters של בופר A. לאחר מכן, השהה שוב את החרוזים ב-50 microliters של בופר תגובת ליגציה quick T four.

הוסיפו שני µL של T4 ligase מהיר ו-forked DNA טרום-מעובד, והדגירו את התמיסה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, שטפו את החרוצים שלוש פעמים נוספות עם 0.9 mL של buffer A. ערבבו hexamer, DNAB helicase עם ה-magnetic strep A ועם החרוצים המחוברים לקומפלקס ה-RNAP elongation שהושה ולמזלג השכפול (replication fork) שבמורד הזרם. הכינו את התמיסה ב-150 µL של buffer A והדגירו אותה למשך 30 שניות ב-23 °C.

לאחר דגירה קצרה של 32 דקות ב-23 °C, הוסיפו polymerase three beta clamp, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P, DGTP המסומן ב-alpha P 32 ו-DATP המסומן ב-alpha P 32 עד לנפח של 200 µl. דגרו את הדגימה למשך חמש דקות ב-37 °C.

התחילו את השכפול על ידי הוספת חלבון קושר ל-DNA גדילי-יחיד, DCTP ו-DTTP. הוסיפו בנוסף alpha P 32, DTTP ו-DCTP מסומנים, עד לנפח סופי של 250 µL. לאחר 10 דקות, סיימו את התגובות על ידי הוספת 12 µL של EDTA בריכוז 0.5 M.

בשלב הבא, הרתיחו את חרוזי ה-strp din כדי לשחרר את ה-DNA מהחרוזים. הסירו שאריות DNA על ידי טיפול בחרוזים ב-proteinase K למשך 30 דקות בטמפרטורה של 50 °C. הרתיחו את החרוזים שוב והסירו את supernatant באמצעות הפרדה מגנטית.

טהרו את העל-משקע המאוחד המכיל את ה-DNA באמצעות ערכת ה-Kyogen PCR cleanup. לבסוף, נתחו את תוצרי ה-DNA המסומנים רדיואקטיבית והמטוהרים בגל אלקלי. התנגשות של הזון עם RNAP במישור חזיתי גורמת בדרך כלל לשני תוצרים באורך 2.5 KB ו-3.6 KB. התוצר באורך 2.5 KB מייצג את אורך ה-DNA מהמזלג ועד ל-RNAP שעצר.

תוצאה זו נובעת מעצירה של השכפול בעקבות התנגשות עם ה-RNAP. המוצר בגודל 3.6 KB מייצג DNA באורך מלא ונובע או מכיבוש חלקי של הפרומוטר על ידי RNAP או מקריאה חלקית של רצפי ה-DNA מעבר ל-RNAP במפגש חזיתי (head-on). תוצאה טובה מעידה על כך שייוצר DNA באורך מלא בכמות של כ-50%.

עם זאת, במקרים מסוימים, תתרחש תפוסה נמוכה יותר של הפרומוטור על ידי RNAP ויש observed אחוז גבוה יותר של DNA באורך מלא. זאת מכיוון שאוכלוסייה גדולה יותר של אזורי שכפול (repli zones) אינה נתקלת בשכפול RNAP חזיתי; היעדר RNAP נעצר מוביל להיווצרות של DNA באורך מלא בלבד. הראינו לכם כיצד לבצע שכפול בשלב מוצק בנוכחות קומפלקס הארכה של RNA פולימראז נעצר הקשור ל-DNA. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשטוף את קומפלקס התעתוק הנעצר במלח בריכוז גבוה כדי להסיר RNA פולימראז עודף, הנקשר ל-DNA באופן לא ספציפי ומעכב את השכפול.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.