Name: גל T-Ion Mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 40 s
Description: חקור את צורת המבנה התלת-ממדי של קומפלקסי חלבונים באמצעות ספקטרומטריית מסה עם ניידות יונים. השיטה מאפשרת לקבוע ערכי חתך התנגשות וארגון תת-יחידות במדויק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לחברי הקבוצה שרון סקירה ביקורתית שלהם, על תרומתם כתב היד. אנו אסירי תודה על התמיכה של תוכניות מורשה ו ביכורה, הקרן הלאומית למדע (מענק מס &#39;1823-1807 ו - 378/08), יוסף כהן מרכז מינרבה לחקר Biomembrane, עמיתי משפחת צ&#39;ייס תכנית מדענים בניו, אברהם וסוניה Rochlin קרן; האמון משפחת וולפסון הצדקה; הלן מילטון א קימלמן המרכז מבנה Biomolecular ו העצרת; הנדל&quot;ן של שלמה סבין Beirzwinsky; Meil ​​דה בוטון Aynsley, וקארן סיאם, בריטניה.

<ol><li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+mobility-mass+spectrometry+analysis+of+large+proteincomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ion mobility-mass spectrometry analysis of large proteincomplexes.</a> Nat Protoc. 3 (7), 1139-1152 (2008).</li>
<li>Scarff, C. A., Thalassinos, K., Hilton, G. R., Scrivens, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Travelling+wave+ion+mobility+mass+spectrometry+studies+of+protein+structure%3A+biological+significance+and+comparison+with+X-ray+crystallography+and+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Travelling wave ion mobility mass spectrometry studies of protein structure: biological significance and comparison with X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance spectroscopy measurements.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 22 (20), 3297-3304 (2008).</li>
<li>Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+drift+time+measurements+from+travelling+wave+ion+mobility+spectrometry-mass+spectrometry+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Mass+Spectrom+%28Chichester%2C+Eng%29%22%5BJournal%5D)">Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies.</a> Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 15 (2), 113-130 (2009).</li>
<li>Leary, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+measuring+conformation+of+solvent-disrupted+protein+subunits+using+T-WAVE+ion+mobility+MS%3A+an+investigation+into+eukaryotic+initiation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Methodology for measuring conformation of solvent-disrupted protein subunits using T-WAVE ion mobility MS: an investigation into eukaryotic initiation factors.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 20 (9), 1699-1706 (2009).</li>
<li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+stoichiometry+and+conformational+changes+in+the+first+step+of+the+P22+tail+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of stoichiometry and conformational changes in the first step of the P22 tail assembly.</a> J Mol Biol. 379 (2), 385-396 (2008).</li>
<li>Pukala, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+architecture+of+multiprotein+assemblies+determined+using+restraints+from+gas-phase+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Subunit architecture of multiprotein assemblies determined using restraints from gas-phase measurements.</a> Structure. 17 (9), 1235-1243 (2009).</li>
<li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperonin+complexes+monitored+by+ion+mobility+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Chaperonin complexes monitored by ion mobility mass spectrometry.</a> J Am Chem Soc. 131 (4), 1452-1459 (2009).</li>
<li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+macromolecular+protein+rings+in+the+absence+of+bulk+water%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for macromolecular protein rings in the absence of bulk water.</a> Science. 310 (5754), 1658-1661 (2005).</li>
<li>Ruotolo, B. T., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspects+of+native+proteins+are+retained+in+vacuum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Aspects of native proteins are retained in vacuum.</a> Curr Opin Chem Biol. 10 (5), 402-408 (2006).</li>
<li>Giles, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+travelling+wave-based+radio-frequency-only+stacked+ring+ion+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 18 (20), 2401-2414 (2004).</li>
<li>McKay, A. R., Ruotolo, B. T., Ilag, L. L., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+measurements+of+increased+accuracy+resolve+heterogeneous+populations+of+intact+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Mass measurements of increased accuracy resolve heterogeneous populations of intact ribosomes.</a> J Am Chem Soc. 128 (35), 11433-11442 (2006).</li>
<li>Ruotolo, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+mobility-mass+spectrometry+reveals+long-lived%2C+unfolded+intermediates+in+the+dissociation+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Ion mobility-mass spectrometry reveals long-lived, unfolded intermediates in the dissociation of protein complexes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 46 (42), 8001-8004 (2007).</li>
<li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li>
<li>Valentine, S. J., Counterman, A. E., Clemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+database+of+660+peptide+ion+cross+sections%3A+use+of+intrinsic+size+parameters+for+bona+fide+predictions+of+cross+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A database of 660 peptide ion cross sections: use of intrinsic size parameters for bona fide predictions of cross sections.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 10 (11), 1188-1211 (1999).</li>
<li>Mesleh, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+information+from+ion+mobility+measurements%3A+effects+of+the+long-range+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural information from ion mobility measurements: effects of the long-range potential.</a> J Phys Chem. 100, 16082-16086 (1996).</li>
<li>Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exact+hard-spheres+scattering+model+for+the+mobilities+of+polyatomic+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Phys+Lett%22%5BJournal%5D)">An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions.</a> Chem Phys Lett. 261, 86-91 (1996).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר להגדיר את לחצות קטע ההתנגשות של חלבונים או קומפלקסים חלבונים עם מבנה בעל שלוש ידועים ממדי, במטרה לספק מידע על הצורה הכללית שלהם, אריזה למקטע ו טופולוגיה. לשם כך פעם לחצות התנגשות ערכים סעיף מתוארים יש צורך להמיר את הערכים הללו כדי פרטים מבניים. תהליך זה דורש מאמצים נוספים ניסיוניים כמו גם ניתוח חישובית, אשר דנו בקצרה להלן. ראשית, מומלץ לנתח חלבונים או קומפלקסים חלבונים עם מבנים ידועים. מדידות אלה יכולים לספק בקרת איכות שימושי של המתודולוגיה ויאפשר הערכת הדיוק של הפרמטרים הרכישה על ידי השוואת התיאורטי נמדד בערכים Ω. אזורים התיאורטי חתך צלב ניתן לחשב מתוך המבנה הגבישי קואורדינטות באמצעות תוכנת MOBCAL 15,16, המהווה מקור פתוח תוכנה FORTRAN מבוסס קוד המאפשר עריכת בהתאם לצרכי המפעיל. עבור מפעיל חישובים כאלה הוא נדרש לשנות את התוכנית כך שמספר איטרטיבי חישובים שבוצעו לכל מבנה קלט הוא גדל וזה לתאם קבצים המכילים מספר גדול של אטומים מתקבלים 1. אסטרטגיה IM-MS להגדרת הסדרים טופולוגי של יחידות משנה בתוך multicomponent אסיפות הוצע לאחרונה 4,6. השיטה כרוכה ניטור של המסלולים דיסוציאציה של מכלולים חלבון לרכיבים קטנים יותר. דיסוציאציה זו מושגת באמצעות התאמה מבוקרת של התנאים שלב פתרון, אשר מעורר הפצה של subcomplexes רעיוני של &quot;אבני הבניין&quot; של מכלולים. מדידה בו זמנית של ערכים Ω של המתחם שניהם שלמים ומוצרי פירוק יוצרת מגבלות מבניות אשר משמשים לחישוב המודלים טופולוגי של קומפלקסים חלבונים. הנחת היסוד הבסיסית במתודולוגיה זו היא כי subcomplexes שנוצר לשמור אישורים מקומיים כמו שלהם, ואכן מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי המבנה פתרון של מוצרי פירוק נשמרת ואין התארגנות מרכזי פתרון או שלבים גז התרחשו 4,6. השלב האחרון במשימה של מבנה הרביעון לגז שלב יונים חלבון מורכב מתאים הצלב התנגשות ערכים סעיף מודלים מחשב. גישות מידול מועסקים על מנת לחקור את הסדרים שונים טופולוגי אפשרית של יחידות משנה שלהם ואת הערכים סיליקו Ω מחושבים לעומת אלה ניסיוני. נכון לעכשיו רק גישות חישוביות כמה משמשים, כמו שיטת גס גרגר spheretype המדמה את הקוטר של יחידות משנה 1,8. ככלל, תחום זה נמצא עדיין בשנים הראשונות שלה התפתחות נוספת נדרשת כדי להפוך את הגישה הזו גנריות, והיא חלה על מגוון רחב של קומפלקסים.

גל t-ion mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

יון ניידות (IM) היא שיטה אשר מודד את הזמן שנדרש עבור יון לנסוע דרך תא בלחץ תחת השפעה של שדה חשמלי חלש. המהירות שבה היונים חוצים את האזור להיסחף תלוי בגודל שלהם: יונים גדול יחוו מספר גדול יותר של התנגשויות עם גז אינרטי הרקע (בדרך כלל N 2) וכך לנסוע יותר לאט דרך המכשיר IM מאלו שמרכיבים יונים קטן יותר חתך. באופן כללי, הזמן שלוקח עבור היונים להעביר אף את השלב גז דחוס מפריד אותם, על פי ההתנגשות שלהם חתך (Ω). לאחרונה, IM ספקטרומטריית היה יחד עם ספקטרומטריית מסה נודדת גל (T-wave) Synapt יון ניידות ספקטרומטר מסה (IM-MS) שוחרר. שילוב ספקטרומטריית מסה עם ניידות יון המאפשרת מימד נוסף של הפרדה מדגם הגדרה, מניב מגוון תלת ממדי (מסה לעת תשלום, עוצמה, ואת להיסחף). טכניקה זו מאפשרת הפרדה חפיפה ספקטרלית לירידה, ומאפשר ברזולוציה של קומפלקסים הטרוגנית עם מסה דומה מאוד, או המסה תשלום יחסי, אבל פעמים להיסחף אחר. יתר על כן, מדידות זמן להיסחף לספק נדבך חשוב של מידע מבניים, כמו Ω קשורה בצורת טופולוגיה הכוללת של יון. המתאם בין זמן הערכים שנמדדו להיסחף Ω מחושב באמצעות עקומת כיול שנוצר חלבונים calibrant עם חתכים מוגדר 1. כוחה של גישה IM-MS טמונה ביכולתה להגדיר את האריזה למקטע ואת הצורה הכללית של מכלולים החלבון בריכוזים מיקרו, ו-near-פיזיולוגיים תנאים 1. מספר מחקרים IM האחרונות של שני חלבונים בודדים 2,3 ולא קוולנטיים קומפלקסים חלבונים 4-9, הפגינו בהצלחה כי מבנה החלבון הרביעון נשמר בשלב גז, הדגיש את הפוטנציאל של גישה זו במחקר של מכלולים חלבון הגיאומטריה לא ידוע . כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של ניתוח IMS-MS של קומפלקסים חלבונים באמצעות Synapt (quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) מכשיר HDMS (ווטרס בע&quot;מ; רק מכשיר מסחרי IM-MS זמין כרגע) 10. אנו מתארים את השלבים אופטימיזציה בסיסית, כיול של התנגשות חתכים, שיטות לעיבוד נתונים לפרשנות. השלב הסופי של פרוטוקול דן שיטות לחישוב תיאורטי ערכים Ω. באופן כללי, הפרוטוקול אינו מנסה לכסות כל היבט של אפיון IM-MS של מכלולים חלבון, אלא מטרתו היא להציג את ההיבטים המעשיים של שיטת לחוקרים חדשים בתחום.

יון ניידות ספקטרומטריית מסה היא המתעוררים גז שלב טכנולוגיה שמפרידה יונים, המבוסס על ההתנגשות שלהם חתך ומסה. השיטה מספקת מידע תלת מימדי על טופולוגיה את הצורה הכוללת של קומפלקסים חלבונים. כאן, אנו המתאר הליך בסיסי לקביעת מכשיר ואופטימיזציה, כיול פעמים להיסחף, ופרשנות של נתונים.

גל T-Ion Mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים

ניידות יונים (Ion mobility - IM) היא שיטה המודדת את הזמן הנדרש ליון כדי לנוע דרך תא תחת לחץ בהשפעת שדה חשמלי חלש. ...

t-wave-ion-mobility-mass-spectrometry-basic-experimental-procedures

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ספקטרומטריית מסה הוכיחה להיות כלי רב ערך עבור ניתוח מערכות חלבון גדול. שיטה זו מאפשרת תובנות אדריכלות, הרכב stoichiometry הכוללת של למקטע רב מכלולים. כאן, אנו לתאר, שלב אחר שלב, כיצד לבצע ניתוח מבניות ספקטרומטריית מסה, ולאפיין מבנים macromolecular.

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

רמת תגובתי מינים החמצן הוא גבוה כאשר תאים נתקלים בתנאי עקה. כאן אנו מציגים דוגמה מכתים diaminobenzidine '3'-3, כמו גם תיוג cysTMT ו ספקטרומטריית מסה לפרופיל proteome חיזור...

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

הגישה המתוארת ההשוואתית, כמותית proteomic מטרתה קבלת תובנות לתוך הרכב של מתחמי multiprotein בתנאים שונים ומודגמת על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית. ניתוח כמותי כמויות שווה של שברים שונים מצפיפות סוכרוז שיפוע מעורבבות ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה.

גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על<sup&gt; 15</sup&gt; N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

כאן, אנו מתארים assay כרומטוגרפי בשילוב עם ההפרדה ניידות יון של פפטיד מבשרי ואחריו ברזולוציה גבוהה (~ 30,000) MS-הזיהוי של פפטיד קטעים על כימות של פפטיד מחודדים הסטנדרטים של נוגדן חד שבטי תקציר.

וזמינותו HS-MRM עבור כימות של התא המארח חלבונים בחלבון ביופרמצבטיקה באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית יון ניידות QTOF ספקטרומטר מסה

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

הארכיטקטורה של מתחמי חלבון חיוני לתפקוד שלהם. שילוב של טכניקות שונות המוני spectrometric הוכיח עוצמה ללמוד ההרכבה שלהם. אנחנו מספקים פרוטוקולים cross-linking כימי, יליד ספקטרומטר מסה ולהראות כמה שיטות משלימות אלה לעזור להבהיר את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון הרכבות.

שילוב cross-linking כימי ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ללמוד את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון להרכבות

ספקטרומטר מסה (MS) התפתחה כלי חשוב החקירה של מבנה, הדינמיקה של הרכבות macromolecular. כאן, אנחנו משלבים גישות MS לחקור היווצרות מורכבות חלבון ואיגוד ליגנד.

ניתוח ארכיטקטורות חלבון חלבון-ליגנד מתחמי באמצעות ספקטרומטר מסה מבניים אינטגרטיבית

פרוטוקול מפורט מתואר את ההפרדה, זיהוי של אפיון proteoforms דגימות חלבון באמצעות נימי אזור אלקטרופורזה-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (CZE-ESI-MS/MS). הפרוטוקול יכול לשמש עבור אפיון ברזולוציה גבוהה proteoforms דגימות חלבון וזיהוי בקנה מידה גדול של proteoforms בדגימות פרוטאום מורכבים.

בקנה מידה גדול פרוטאומיקס מלמעלה למטה באמצעות ספקטרומטר מסה של טנדם אלקטרופורזה של אזור נים

ספקטרומטריית ניידות יונים (IMS) היא השלמה מעניינת לספקטרומטריית מסה לאפיון ביומולקולות, בעיקר משום שהיא רגישה לאיזומריזם. פרוטוקול זה מתאר ניסוי IMS (IMS/IMS) דו-מושבי, המאפשר בידוד של מולקולה ויצירת פרופילי הניידות של שבריה.

שימוש בספקטרומטר ניידות יונים מחזורי לניסויי ניידות יון דו-מושבית

מאמר זה מתאר פרוטוקול ניסיוני המשתמש בספקטרומטריית מסות-ניידות אלקטרו-יונים, חישובים קוונטיים אמפיריים למחצה ודיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות סף הנפתרת על-ידי אנרגיה, כדי למדוד את התרמוכימיה היחסית של הדיסוציאציה של קומפלקסים של מתכות טרנריות קשורות.

מחקרים תרמוכימיים של קומפלקסים טרנריים Ni(II) ו-Zn(II) באמצעות ספקטרומטריית ניידות-מסה של יונים

חקור את צורת המבנה התלת-ממדי של קומפלקסי חלבונים באמצעות ספקטרומטריית מסה עם ניידות יונים. השיטה מאפשרת לקבוע ערכי חתך התנגשות וארגון תת-יחידות במדויק.

גל T-Ion Mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים

גלה סרטונים נוספים