שיטות הצמד תיקון הקלטות קיבול מן Calyx

היי, שמי קן פרדיסו. אני עובדת עבור לינג גאנג וו בתוכנית הפנימית של המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי, שממוקמת ב-NIH בקמפוס בת'סדה. אני הולך להראות לך את הטכניקות עבור הקליטה הקדם-סינפטית הידוק טלאי.

אז כדי להכין את רקמת המוח, אנו מסירים את המוח מהחולדה. אנחנו מכניסים את המוח לתוך התמיסה הזו, שתהיה תמיסה קרה כקרח, דלת סידן, והיא תהיה מבעבעת בקרבוגן כדי לוודא שיש אספקת חמצן למוח כל הזמן. וזה גם צריך להיות קר כקרח כדי למזער DA כדי למזער את כמות הנזק.

אז המוח יהיה עכשיו בפתרון הזה. היינו מוציאים אותו, חותכים אותו כראוי כך שניתן יהיה לשים אותו על הבלוק, להרכיב אותו על הבלוק עם מתאם סנו או דבק מטורף, אבל ממלאים את החדר אז בתמיסת סידן קרה כקרח, מבעבעים אותו, מניחים אותו על הוויברטור ואז חותכים פרוסות בעובי של 180 עד 190 מיקרון בתדר להב תדר של 70 הרץ ומהירות מתקדמת קדימה של 0.01 עד 0.02 מילימטר לכל שניה. אז זה יהיה 10 עד 20 מיקרון לשנייה.

לאחר הכנת כל פרוסה, אנו מעבירים את הפרוסות ממי המלח הקרים כקרח לתא זה, המכיל תמיסת סידן רגילה. זו אותה תמיסה שאנחנו רושמים בה והיא בטמפרטורה פיזיולוגית של 37 מעלות. לאחר מכן הכנסנו את הפרוסות לכאן להתאוששות.

הוא נשאר כאן חצי שעה עד שעה לפני הרצת הניסויים הפיזיולוגיים. אז הנה יש לי את המוח ואני הולך לשלוף אותו מהתמיסה. אז זה מוח גדול יותר למטרות הדגמה.

זה מחולדת P 20. אנחנו נהפוך את זה. זה גזע המוח שאנחנו מתעניינים בו.

אז האזור הזה כאן למטה והגביע החזיק נמצא ממש באזור הזה ממש שם. אז מה שאנחנו הולכים לעשות זה לחתוך את שאר המוח, לבודד את גזע המוח, ואז להכין את גזע המוח לתא החיתוך. אוקיי, אז אנחנו הולכים לחתוך את שאר המוח ופשוט לבודד את גזע המוח.

אני הולך להפוך את זה כדי להדגים איפה אנחנו נמצאים. בדרך כלל לא היינו עושים את זה כך, ושוב, אנחנו יכולים פשוט להיפטר מכל החלק הזה. כשהופכים אותו בחזרה, בודדנו את גזע המוח ואנחנו פשוט עושים עוד חיתוך שם.

אוקיי, זהו זה. זה גזע המוח. גביע מוחזק נמצא ממש שם ושם.

זהו גזע המוח. שוב, נדחה את זה קצת אחורה. אנחנו הולכים לחתוך צד אחד של המוח הקטן וזה יאפשר לגזע המוח לשבת הצידה ככה.

שמנו מעט דבק אקרילי של סנו והשארנו אותו מונח הצידה ממלאים אותו במהירות בקרח קר, תמיסת סידן נמוכה קרה. הכניסו לשם את קו החמצן בהקדם האפשרי. עכשיו אנחנו מרימים אותו ומביאים אותו לוויברטו.

אנו מביאים אותו מהר כדי להגיע לתחילת המוח, ואז ברגע שאנו מגיעים לתחילת המוח, אנו מורידים את המהירות ל-0.01 מילימטר לשנייה. אז זה 10 מיקרו לשנייה. אז זה נע בקצב איטי להפליא.

החלק הראשון של המוח הוא, הוא החלק שיש לו את ה-mtb, שהוא הנילוס המדיאלי של גוף הטרפז. וזה החלק שמכיל את, בסדר, אז ברגע שיש לי אותו בפיפטת ההעברה, אני מנסה לקרב אותו כמה שיותר קרוב לקצה הפיפטה. ויש את החלק של המוח ואני מעביר אותו די מהר לתוך החדר הזה, שמכיל תמיסת הקלטה סטנדרטית שהיא רמות נורמליות של סידן וגם טמפרטורה גבוהה יותר.

וזה יאפשר לפרוסות להתאושש לאחר הליכי החיתוך שהן מוכנות מניסויים פיזיולוגיים. אוקיי, אז מכאן והלאה, זה הולך להיות אותו הדבר שוב ושוב. הציוד הבא הוא מה שאשתמש בו כדי לבצע את הידוק התיקון.

יש לנו מיקרוסקופ זקוף שלב קבוע. הבמה קבועה, כפי שאמרתי, כך שהמיקרוסקופ נע מתחתיה ממניפולטור. אנו משתמשים בפאות ובמיקרו מניפולטור ניומן כדי להחזיק את הבמה, שלב הראש של המגבר, אנו משתמשים במגבר מהדק תיקון EPC 10 מבית heca.

ומה שגם הייתי צריך להזכיר הוא שאנחנו משתמשים ב-DIC עם אור אינפרא אדום. אז יש לנו כאן מצלמת IR, ולכן כל מה שאנחנו רואים ייראה על המסך כשאנחנו מחפשים CAEs. מגבר מהדק התיקון נשלט על ידי תוכנה זו, הנקראת Pulse, שהיא גם היא מ-Heca, ותשלוט במגבר ובכל הניסוי הפיזיולוגי.

התוצאות ייצאו על המסך הזה. הגביע החזיק הוא טרמינל פרה-סינפטי גדול, ומכיוון שהוא גדול, הוא מאפשר לנו להדביק פיזית את הטרמינל. אז אנחנו יכולים לקחת הקלטות פרה-סינפטיות וזה סוג של דבר ייחודי, במיוחד במערכת העצבים המרכזית.

אז זה מאפשר לנו למדוד תעלות סידן המופעלות באופן פרה-סינפטי. כמו כן, אנו יכולים למדוד פעילות פוטנציאלית לפעולה אם נרצה לעורר את העצב המוביל לגביע. מה שאנו עושים במעבדה הזו הוא למדוד תהליך שנקרא אקסוציטוזיס, שהוא איחוי של שלפוחיות שמכילות מוליך עצבי עם הממברנה.

עכשיו בשלפוחיות האלה מתמזגות עם הממברנה בתהליך שנקרא אקסוציטוזיס, הן מוסיפות קרום לטרמינל הסינפטי, ואנחנו יכולים למדוד את זה כשינוי בקיבול. נקבל עלייה בקיבול ככל שממברנה מתווספת לטרמינל כך שהניסויים שאראה היום הם מדידות קיבול, באופן פרה-סינפטי כאשר הממברנה מוסרת. אז אתה לא יכול פשוט להמשיך להוסיף ממברנה, אתה כמובן צריך להסיר כמה.

תהליך זה נקרא אנדוציטוזיס או קליטת ממברנה. אנחנו יכולים גם למדוד את זה וזה יימדד כירידה ברמת הקיבול ונראה דוגמאות לכך בהמשך. עכשיו מה שזה מאפשר לנו לעשות זה לנטר את פעילות תעלות הסידן וגם לפקח על חלק מהחלבונים שמעורבים באקסוציטוזיס ובאנדוציטוזיס ולחקור אותם.

אנחנו יכולים להכניס דברים כמו פפטידים כדי לחסום חלבונים שמעורבים באקסו או באנדוציטוזיס. אנחנו יכולים גם להשתמש ברעלים שעושים את אותו הדבר. אנו יכולים גם להתאים את כמויות הסידן שנכנסות לטרמינל, כך שנוכל באמת לחקור את תהליך האקסוציטוזיס, שחרור המוליך העצבי, כמו גם את ספיגת הממברנה שלאחר אותו אירוע.

זהו הצינור המכיל את תמיסת ההקלטה התוך-תאית שלנו. אנו מכינים אותו מבעוד מועד ואז מקפיאים אותו ובדרך כלל נוכל להשתמש בו במשך מספר שבועות עד חודש לפני שנצטרך להכין פיתרון חדש. שוב, חשבנו מיד לפני שעשינו את ההקלטות שלנו, ותמיד תקבל כמות מסוימת של חלקיקי אבק או סוג אחר של פסולת שהולכת להיכנס לצינור שלך.

אתה יכול לעשות אחד משני דברים. אתה יכול להוציא את התמיסה ולסנן אותה, או שאתה יכול לסובב אותה במשך דקה או שתיים ואז לשלוף את התמיסה, ולהשאיר חלק תחתון שבתוכו יהיה פסולת וחומר אחר. אז אני מעדיף לסובב את זה ואני אעשה את זה עכשיו.

אז זהו הצינור המכיל את התמיסה התוך-תאית שלנו. הוא מופשר. אנחנו הולכים לסובב אותו במשך שתיים עד שלוש דקות בצנטריפוגה קטנה, וזה אמור להספיק כדי להוציא חלקיקי אבק גדולים מהתמיסה.

אז עכשיו אני פשוט מוריד את החלק העליון, את התמיסה שזה עתה סובבנו, נזהר לא לעורר אותה, מעביר אותה לצינור נקי, ואני מוריד בערך 90% ממנה. אני מנסה לא שוב, לקבל את החלק האחרון. אז אני אעצור כאן.

שמתי אותו מיד על קרח כדי שיישאר נעים וקר במהלך הניסוי. זה חשוב מאוד. זהו, זה אחד הפיפטות שלנו.

אנו משתמשים בזה להקלטות תוך-תאיות. זו זכוכית סיליקה עבה עם קירות, קוטר חיצוני של שני מילימטרים, קוטר פנימי של 1.16 מילימטרים. ראשית, מה שאנחנו עושים זה למלא מחדש את הפיפטה.

אז אנחנו מיישמים יניקה, אנחנו מכניסים את הפיפטה לתמיסת ההקלטה ומפעילים יניקה כדי לנסות למלא את קצה הפיפטה, שאחרת לא יתמלא בשום דרך אחרת. לאחר שעשינו זאת, אנו לוקחים צינור נימי וממלאים את שאר האלקטרודה רק לוקחים את החלק האחורי של הפיפטה שלך. זוהי טכניקה פיזיולוגית סטנדרטית וממש להעיף אותה.

אתה מסתכן בשבירת קצה הפיפטה, אבל יהיה לך גם, אם לא תעשה זאת, לעתים קרובות יהיו לך בועות אוויר. אוקיי, עכשיו שמנו אותו על מחזיק הפיפטה שלנו, שמחובר לשלב הראש שלנו של מגבר צמח התיקון. יש שם חוט כלוריד כסוף.

חוט כלוריד הכסף בא במגע עם התמיסה התוך-תאית, וזה מאפשר לנו למדוד את הפעילות החשמלית במסוף הפרה-סינפטי. אז מה שאנחנו עושים זה למצוא את הפרוסה שיש בה הרבה CAEs. אנחנו רוצים צפיפות גבוהה של CAEs.

אז זהו, אנחנו מחפשים את הגרעין המדיאלי של גוף הטרפז, שהוא ה-MNTB, ושם נמצא הטרמינל, שיוצר את הגביע הנתמך, או שהוא אפליקציית הגביע. אז מה שאנחנו עושים זה להתחיל לסרוק את הפרוסה. כך למשל, יש לנו גביע שנמצא קצת עמוק מעל פני השטח ואין הרבה על מה להדביק, אז אנחנו פשוט ממשיכים לסרוק על פנינו.

אז זהו גביע כאן שאנחנו הולכים אליו. מה שעשיתי זה שני סימנים על המסך, וזה המקום שאליו הפיפטה הולכת ללכת. ואתם יכולים לראות שיש את חתיכת הגביע שאני הולך לרדוף אחרי הפיפטה.

אני הולך להפעיל לחץ חיובי כך שהוא ידחוף כלפי מעלה את הגביע, ואז אני הולך להקל על הלחץ החיובי. לאחר מכן הגביע הולך להידחף כלפי מעלה כנגד הפיפטה, ובשלב זה אני מפעיל יניקה עדינה מאוד ומנסה למצוץ ולדחוף את הממברנה או לגרום לממברנה לאטום על קצה הפיפטה. בסדר, שחרר את הלחץ החיובי.

ועכשיו אני הולך ליישם יניקה. אז הנה אנחנו מקצוענים, אנחנו מפעילים פולס של חמישה מילי-וולט, או למעשה פולס של ארבעה מילי-וולט. אוקיי, זהו. בסדר.

כעת אנו מורידים את פוטנציאל הממברנה מינוס 80, מבטלים את הבום החולף המהיר. עכשיו אנחנו הולכים ללכת על תא שלם. אני הולך להפעיל יניקה עדינה ולנסות ללכת בסיטונאות.

הטרנזיינטים הטעונים האלה מצביעים על כך שהוא, שהפיפטה והתא עכשיו רציפים שיש לו הקלטה סיטונאית. זה עוד צילום יפהפה. אז האדום הבהיר יותר היה עקבות הקיבול, ואתה יכול לראות שיש קפיצה פתאומית ואז זה ירד.

אוקיי, הרגע הראיתי לכם את הטכניקות הבסיסיות לקבלת הקלטות ממסוף פרה-סינפטי מוחזק בגביע. הראיתי לכם כיצד לייצר את הפרוסות המכילות את הגרעין המדיאלי של גוף הטרפז. שם תמצאו את הגביעים החזיקו.

והראיתי לכם את הטכניקות להתבוננות דרך הפרוסות. אתה הולך לעבור על כל אחת מהפרוסות, לחפש את הפרוסה שיש לה את המספר הגדול ביותר של גביעים שנמצאים על פני השטח. לאחר מכן אתה הולך לחפש את קרום הגביע הגדול ביותר שאתה יכול למצוא ולהדביק עליו תקליט מהדק

והראיתי לכם גם את הטכניקות להקלטת מהדק תיקון, ואלה הן טכניקות הקלטה סטנדרטיות של מהדק טלאי.