Passaging אדם בתאי גזע עצביים

היי, אני סטיב. אני עובדת במעבדה של ד"ר פלנגן במחלקה לפתולוגיה באוניברסיטת קליפורניה, אירווין. היום אני הולך להראות לכם כיצד לפצל תאי קודמן עצביים אנושיים.

טכניקה זו כוללת קידוד בקבוק חדש עם תמיסה של פיברונקטין אנושי, הרמת התאים עם מאגר דיסוציאציה של תאים, ואז נטרול מאגר הדיסוציאציה של התאים עם תמיסת סרום של 10%, צנטריפוזיה של תרחיף התאים והחייאה, השעיית התאים בטרי, בינוני, והעברת תרחיף התאים לבקבוק חדש. במעבדה שלנו, אנו מגדלים תאים קודמים עצביים אנושיים על ידי החלפת מחצית מהמדיה שלהם כל יומיים, ואנו מעבירים אותם בערך פעם בשבוע על ידי פיצול אחד לשניים. כשאני עובר תאים, אני יכול לספור אותם אם אני רוצה להחליף אותם בניסוי כימי חיסוני, או אם אני רוצה לבצע טרנספקציה עם אפקטור גרעיני.

חשוב להשתמש במאגר דיסוציאציה של תאים בעת אריזת תאים מכיוון שראשית, הוא אינו אנזימטי, בניגוד לטריפסין, והוא הרבה יותר עדין לתאים. היי, אנחנו בחדר תרבית הרקמה עכשיו, ולפני שאראה לכם איך נראית בקבוק משולב של תאי קודמן אנושיים, ראשית אני הולך להכין את תרבית הרקמה. ראשית, אני הולך לכבות את אור ה-UV ולהדליק את האור ואת זרימת האוויר.

לאחר מכן, אני הולך לחטא את מכסה המנוע עם 70% אתנול על ידי ריסוס מגבת נייר וניגוב מכסה המנוע. חשוב לרסס מגבת נייר עם 70% אתנול ולא ישירות את החלק הפנימי של מכסה המנוע מכיוון שריסוס מכסה המנוע באתנול 70% עלול לפגוע במסנן HEPA, וזה ממש יקר. לאחר מכן, אני הולך לרסס את כל הריאגנטים והמכשירים.

ולבסוף, אני הולך לרסס את צינורות הוואקום, ואנחנו מוכנים. בואו נסתכל על התאים האלה. אז התאים האלה נראים בערך 80% קונפלואנטים.

אלה הם תאי קודמן עצביים אנושיים שבודדו מעוברים אנושיים, ואנו מגדלים אותם בצלוחיות T 25. חילקנו אותם בערך כל שבוע, אחד או שניים. אני מוכן לעבור את התאים שלי עכשיו.

וראשית אני הולך להביא בקבוק T 25 חדש שציפיתי במשך ארבע שעות בפיברונקטין אנושי מ-BD biosciences. אז הסרתי את תמיסת הפיברונקטין. אני הולך לשטוף את הבקבוק הזה עם BBS לפני שאני הולך להעביר את התאים לתוך הבקבוק.

ועכשיו אני הולך להוציא את התאים מהאינקובטור של 37 מעלות. הנה הם. עכשיו אני הולך להסיר את תמיסת הכביסה PBS מהבקבוק החדש שהיה מצופה בפיברונקטין אנושי.

ואני הולך להוסיף שני מיליליטר של מדיה ממוזגת ישנה לבקבוק החדש. אז עכשיו אני צריך לשטוף את התאים שלי עם PBS לפני שאוכל להוריד אותו מעל פני השטח. אז ראשית, אני הולך להסיר את המדיה שנותרה, להוסיף כשני מיל PBS מיד מבלי להרטיב את התאים להתייבש.

אני הולך לחכות כשתי דקות לפני שאסיר את PBS ואשים מאגר דיסוציאציה למכירה על מנת להוריד את המכירות מעל פני השטח. עכשיו אני הולך להסיר PBS, ושוב, אני הולך לנסות להוסיף מאגר דיסוציאציה של תאים מיד כדי שהתאים לא יתייבשו. אז אני הולך להוסיף 1.5 מיל של מאגר דיסוציאציה של תאים.

ובניגוד ל-PBS, אני הולך להוסיף אותו ישירות לתאים ואני הולך לנסות לכסות כמה שיותר שטח. אז אני מזיז את הבקבוק מצד לצד כשאני מוסיף לאט לאט את המאגר הזה לתאים. ואני הולך לחכות עכשיו כחמש דקות עד שהתאים יתחילו לרדת מעל פני השטח.

ואני הולך להשאיר את הבקבוק בטמפרטורת החדר במכסה המנוע. כפי שאתם יכולים לראות כאן, תאים מתחילים קודם כל להתעגל כלפי מעלה ואז הם מתחילים לרדת מעל פני השטח ואתם יכולים למעשה לראות כמה תאים צפים כבר. ואם תקישו על הבקבוק בצד, זה יעזור להם לרדת.

אז עברו חמש דקות, וכפי שאתם יכולים לראות, התמיסה הפכה להיות ממש צפופה עם תאים שירדו מעל פני השטח. ועכשיו אני הולך לנטרל את ההשפעה של מאגר דיסוציאציה של תאים על ידי הוספת 4.5 מיל של מדיום המכיל סרום. אז אני הולך להשתמש בסרום בקר עוברי מומת בחום של 10% במדיה D-M-E-M-F 12, ואני הולך להוסיף אותו ישירות על פני השטח של הבקבוק כדי לוודא שלא נותרו תאים מחוברים.

ואני הולך לעשות זאת, ואני הולך להניע בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לעקור את כל התאים שנותרו. ואז אני הולך להעביר את תמיסת התא לצינור חרוטי של 15 מיל. ואני הולך לסובב אותו באלף סל"ד למשך דקה אחת.

אז התאים סיימו להסתובב ויש לנו כאן משטח תאים יפהפה. אני הולך להסיר את מדיית הסרום בזהירות רבה מאוד מבלי לנסות להפריע למזרן. ואז אני הולך להשעות את המשטח בארבעה מיליוני תקשורת.

אז אני אנסה להשהות את הגלולה כך שיהיו, יש, לא יישארו גושי תאים כך שהתמיסה תהיה הומוגנית ותכיל, לא תכיל גושים. ומכיוון שאני עושה פיצול אחד לשניים, אני הולך לקחת שניים מתוך ארבע הטחנות ולהעביר אותם לבקבוק החדש שכבר מכיל שני מיל של מדיית המצב. ולבסוף, אני הולך לתייג את הבקבוק עם סוג התא, מספר המעבר והתאריך.

זהו מבט על התאים שעברנו לפני חצי שעה. וכפי שאתם יכולים לראות, רובם נצמדו אל פני השטח והתחילו לשלוח תהליכים. זה הכל חבר'ה.

ועכשיו אני מוכן לספור.