Passaging אדם בתאי גזע עצביים
22 באוגוסט 2007
היכולת לתפעל האדם גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs) במבחנה מאפשרת לחקור את השירות שלהם, כמו השתלות תאים למטרות טיפוליות לחקור ההתפתחות העצבית האנושית. פרוטוקול זה מציג שיטה culturing ו hNSPCs passaging בתקווה reproducibility גדל והולך של מחקרים תא גזע אנושיים.
היי, אני סטיב. אני עובדת במעבדה של ד"ר פלנגן במחלקה לפתולוגיה באוניברסיטת קליפורניה, אירווין. היום אני הולך להראות לכם כיצד לפצל תאי קודמן עצביים אנושיים.
טכניקה זו כוללת קידוד בקבוק חדש עם תמיסה של פיברונקטין אנושי, הרמת התאים עם מאגר דיסוציאציה של תאים, ואז נטרול מאגר הדיסוציאציה של התאים עם תמיסת סרום של 10%, צנטריפוזיה של תרחיף התאים והחייאה, השעיית התאים בטרי, בינוני, והעברת תרחיף התאים לבקבוק חדש. במעבדה שלנו, אנו מגדלים תאים קודמים עצביים אנושיים על ידי החלפת מחצית מהמדיה שלהם כל יומיים, ואנו מעבירים אותם בערך פעם בשבוע על ידי פיצול אחד לשניים. כשאני עובר תאים, אני יכול לספור אותם אם אני רוצה להחליף אותם בניסוי כימי חיסוני, או אם אני רוצה לבצע טרנספקציה עם אפקטור גרעיני.
חשוב להשתמש במאגר דיסוציאציה של תאים בעת אריזת תאים מכיוון שראשית, הוא אינו אנזימטי, בניגוד לטריפסין, והוא הרבה יותר עדין לתאים. היי, אנחנו בחדר תרבית הרקמה עכשיו, ולפני שאראה לכם איך נראית בקבוק משולב של תאי קודמן אנושיים, ראשית אני הולך להכין את תרבית הרקמה. ראשית, אני הולך לכבות את אור ה-UV ולהדליק את האור ואת זרימת האוויר.
לאחר מכן, אני הולך לחטא את מכסה המנוע עם 70% אתנול על ידי ריסוס מגבת נייר וניגוב מכסה המנוע. חשוב לרסס מגבת נייר עם 70% אתנול ולא ישירות את החלק הפנימי של מכסה המנוע מכיוון שריסוס מכסה המנוע באתנול 70% עלול לפגוע במסנן HEPA, וזה ממש יקר. לאחר מכן, אני הולך לרסס את כל הריאגנטים והמכשירים.
ולבסוף, אני הולך לרסס את צינורות הוואקום, ואנחנו מוכנים. בואו נסתכל על התאים האלה. אז התאים האלה נראים בערך 80% קונפלואנטים.
אלה הם תאי קודמן עצביים אנושיים שבודדו מעוברים אנושיים, ואנו מגדלים אותם בצלוחיות T 25. חילקנו אותם בערך כל שבוע, אחד או שניים. אני מוכן לעבור את התאים שלי עכשיו.
וראשית אני הולך להביא בקבוק T 25 חדש שציפיתי במשך ארבע שעות בפיברונקטין אנושי מ-BD biosciences. אז הסרתי את תמיסת הפיברונקטין. אני הולך לשטוף את הבקבוק הזה עם BBS לפני שאני הולך להעביר את התאים לתוך הבקבוק.
ועכשיו אני הולך להוציא את התאים מהאינקובטור של 37 מעלות. הנה הם. עכשיו אני הולך להסיר את תמיסת הכביסה PBS מהבקבוק החדש שהיה מצופה בפיברונקטין אנושי.
ואני הולך להוסיף שני מיליליטר של מדיה ממוזגת ישנה לבקבוק החדש. אז עכשיו אני צריך לשטוף את התאים שלי עם PBS לפני שאוכל להוריד אותו מעל פני השטח. אז ראשית, אני הולך להסיר את המדיה שנותרה, להוסיף כשני מיל PBS מיד מבלי להרטיב את התאים להתייבש.
אני הולך לחכות כשתי דקות לפני שאסיר את PBS ואשים מאגר דיסוציאציה למכירה על מנת להוריד את המכירות מעל פני השטח. עכשיו אני הולך להסיר PBS, ושוב, אני הולך לנסות להוסיף מאגר דיסוציאציה של תאים מיד כדי שהתאים לא יתייבשו. אז אני הולך להוסיף 1.5 מיל של מאגר דיסוציאציה של תאים.
ובניגוד ל-PBS, אני הולך להוסיף אותו ישירות לתאים ואני הולך לנסות לכסות כמה שיותר שטח. אז אני מזיז את הבקבוק מצד לצד כשאני מוסיף לאט לאט את המאגר הזה לתאים. ואני הולך לחכות עכשיו כחמש דקות עד שהתאים יתחילו לרדת מעל פני השטח.
ואני הולך להשאיר את הבקבוק בטמפרטורת החדר במכסה המנוע. כפי שאתם יכולים לראות כאן, תאים מתחילים קודם כל להתעגל כלפי מעלה ואז הם מתחילים לרדת מעל פני השטח ואתם יכולים למעשה לראות כמה תאים צפים כבר. ואם תקישו על הבקבוק בצד, זה יעזור להם לרדת.
אז עברו חמש דקות, וכפי שאתם יכולים לראות, התמיסה הפכה להיות ממש צפופה עם תאים שירדו מעל פני השטח. ועכשיו אני הולך לנטרל את ההשפעה של מאגר דיסוציאציה של תאים על ידי הוספת 4.5 מיל של מדיום המכיל סרום. אז אני הולך להשתמש בסרום בקר עוברי מומת בחום של 10% במדיה D-M-E-M-F 12, ואני הולך להוסיף אותו ישירות על פני השטח של הבקבוק כדי לוודא שלא נותרו תאים מחוברים.
ואני הולך לעשות זאת, ואני הולך להניע בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי לעקור את כל התאים שנותרו. ואז אני הולך להעביר את תמיסת התא לצינור חרוטי של 15 מיל. ואני הולך לסובב אותו באלף סל"ד למשך דקה אחת.
אז התאים סיימו להסתובב ויש לנו כאן משטח תאים יפהפה. אני הולך להסיר את מדיית הסרום בזהירות רבה מאוד מבלי לנסות להפריע למזרן. ואז אני הולך להשעות את המשטח בארבעה מיליוני תקשורת.
אז אני אנסה להשהות את הגלולה כך שיהיו, יש, לא יישארו גושי תאים כך שהתמיסה תהיה הומוגנית ותכיל, לא תכיל גושים. ומכיוון שאני עושה פיצול אחד לשניים, אני הולך לקחת שניים מתוך ארבע הטחנות ולהעביר אותם לבקבוק החדש שכבר מכיל שני מיל של מדיית המצב. ולבסוף, אני הולך לתייג את הבקבוק עם סוג התא, מספר המעבר והתאריך.
זהו מבט על התאים שעברנו לפני חצי שעה. וכפי שאתם יכולים לראות, רובם נצמדו אל פני השטח והתחילו לשלוח תהליכים. זה הכל חבר'ה.
ועכשיו אני מוכן לספור.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לגידול והעברה של תאי גזע עצביים אנושיים/מקדימים (hNSPCs) in vitro. הטכניקה שואפת לשפר את הניתנות לשכפול של מחקר תאי גזע אנושיים ולהקל על החקר של התפתחות עצבית ויישומים טיפוליים פוטנציאליים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- טכניקות תרבית תאים
רקע
- תאי גזע עצביים אנושיים/מקדימים (hNSPCs) הם חיוניים לחקר התפתחות עצבית.
- מניפולציה in vitro של hNSPCs יכולה להוביל לקידומים טיפוליים.
- הניתנות לשכפול במחקר תאי גזע היא חיונית להתקדמות מדעית.
- טכניקות תרבית תאים הן בסיסיות במחקר מדעי העצב.
מטרת המחקר
- לספק שיטה אמינה לגידול hNSPCs.
- להקל על השימוש ב-hNSPCs ביישומים ניסיוניים.
- לשפר את ההבנה של ההתפתחות העצבית האנושית.
שיטות ששימשו
- ציפוי פלסקות בפיברוקטין אנושי.
- שימוש במאגר פיזור תאים להרמת תאים.
- נטרול מאגר הפיזור עם תמיסת סרום.
- צנטריפוגה והשהייה מחדש של תאים במדיום טרי.
תוצאות עיקריות
- העברה מוצלחת של hNSPCs באמצעות השיטה המתוארת.
- שיפור בניתנות לשכפול בפרקטיקות תרבית תאים.
- פוטנציאל ליישומים בניסויים אימונוכימיים ובטרנספקציה.
- ביסוס שגרה לשינויי מדיום ותדירות העברה.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק גישה שיטתית לתרבית hNSPC.
- שיפורים בניתנות לשכפול יכולים להוביל לתוצאות ניסיוניות טובות יותר.
- מחקר נוסף יכול לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של hNSPCs.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Standardized passaging of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) supports reproducible in vitro models for target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease research. Reliable expansion of hNSPCs enables consistent assay inputs for phenotypic screening and lead identification programs. This protocol addresses variability in stem cell culture that can confound translational biomarker studies and preclinical model fidelity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neural pathway modulation using genetically stable hNSPCs expressing nestin and SOX2.
- Operational Value: Reduces culture-induced variability that obscures target engagement readouts in early screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides adherent, bipolar morphology hNSPCs suitable for high-content imaging of neurite outgrowth or synaptic marker expression.
- Operational Value: Standardized 1:2 split every 7 days supports scalable seeding densities for multi-well plate assays.
- Strategic Value: Fibronectin-coated flasks improve attachment efficiency, reducing well-to-well inconsistency in compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains undifferentiated marker expression, preserving multipotency for differentiation into disease-relevant neuronal subtypes.
- Operational Value: Conditioned media carryover during passaging supports paracrine factor studies relevant to neuroinflammatory pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This passaging method fits within the discovery continuum from target validation through assay optimization to preclinical model generation, where hNSPC consistency impacts data reliability across stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via controlled expansion of hNSPCs for CRISPR screening or overexpression studies.
- Screening: Enables reproducible plating densities for quantifying compound effects on cell viability or differentiation markers.
- Analytics: Yields homogeneous suspensions amenable to flow cytometry or immunocytochemistry for quantitative readouts.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a scalable source for generating neurons or glia for transplantation efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Defined coating and passaging frequency allows technology transfer across sites for multi-project stem cell programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in stem cell-derived assays through minimized passage-induced drift.
- Operational Value: Standardized dissociation and neutralization steps enhance day-to-day reproducibility.
- Strategic Value: Enables capital-efficient scale-up by reducing failed batches due to inconsistent subculture.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted decisions in neurodegenerative portfolios by improving data fidelity in target validation cascades.
Implementation Considerations
- Requires aseptic technique training for safe handling of dissociation buffers and serum supplements.
- Depends on access to human fibronectin-coated cultureware and sterile conical tubes for centrifugation.
- Necessitates standardization of passaging timing relative to confluence (~80%) to avoid overgrowth-induced differentiation.
- Adaptation to suspension or spheroid cultures would require matrix adjustments beyond adherent fibronectin coating.
- Limited to research-scale operations; GMP-compliant passaging would require closed-system bioreactors and qualified reagents.
