Name: Passaging אדם בתאי גזע עצביים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: למד שיטה לגידול והעברת תאי גזע עצביים אנושיים (hNSPCs) בתרבית, הכוללת ציפוי בפיברונקטין אנושי, שימוש בממס פירוק תאים וסריקה. שיטה זו משפרת את השחזרותיות במחקר תאי גזע עצביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים בתודה ד&quot;ר פיליפ שוורץ ח של המשאבים הלאומיים האדם עצבית לתאי גזע בבית החולים לילדים, אורנג&#39; קאונטי מכון המחקר למתן hNSPCs והדרכה ראשונית culturing שלהם.

הערה: לקבלת culturing שגרתית של hNSPCs שלנו, אנו משנים 50-100% של התקשורת בכל יום אחר, ובדרך כלל מעבר להם 01:02 פעם בשבוע. תרבות התקשורת מכיל סיביות 9500 20%, 1X גורמים אנטיביוטי / antimycotic, וצמיחה (EGF, FGF, ואת כל PDGF ב 40 ng / ml) ב DMEM: F12 התקשורת הבסיס. הכנת Flask מצופה dissociating תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין צלוחיות חדש עבור התאים passaged, מעיל T25 צלוחיות עם 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פיברונקטין האדם EMEM במשך 4 שעות או לילה, בתוך 37 ° C רקמות התרבות בחממה. ממש לפני passaging התאים, להסיר את הפתרון פיברונקטין ולשטוף את צלוחיות עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הישן &quot;מותנית&quot; התקשורת מתאי להיות passaged את פיברונקטין מצופה צלוחיות חדשים (כגון כי במחצית נפח הסופי של המדיה עבור כל בקבוק יהיה &quot;מותנה&quot; התקשורת). אלה התנאים culturing לסייע לשמור על התאים האלה במצב מובחן שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שכל התקשורת היא להסיר את התאים להיות passaged, יש לשטוף את התאים פעם עם PBS. שימו לב שלא לייבש את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תא דיסוציאציה הצפת (CDB) ישירות על גבי התאים (1.0-1.5 מ&quot;ל עבור בקבוק T25). דגירה תאים למאגר כ -5 דקות בטמפרטורת החדר. בעדינות את הבקבוק הקשה תסייע להאיץ את ניתוק התא. </li></ol> Centrifuging, Resuspending, ותאי ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סרום המכיל מדיה (DMEM: F12 עם 10% חום מומת בסרום שור עוברי) (להשתמש ~ נפח 3X של CDB) כדי הבקבוק עם תאים מנותקת. הסר את המדיה התאים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. השתמש נפח קטן של סרום המכיל התקשורת טרי לשטוף את הבקבוק ולשחזר תאים שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התקשורת תאים ב 1000 סל&quot;ד (~ 200xg) במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יניקה מעל סרום המכיל מדיה resuspend התאים בתקשורת תרבות טריים, pipetting מעלה ומטה כדי ליצור השעיה תא הומוגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מחצית התאים resuspended לתוך בקבוק אחד חדש לפצל 01:02. שים לב למספר קטע חדש על הבקבוק. </li></ol>

<ol><li>Flanagan, L. A., Rebaza, L. M., Derzic, S., Schwartz, P. H., Monuki, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+neural+precursor+cells+by+laminin+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins.</a> J. Neurosci. Res. 83, 845-856 (2006).</li>
<li>Nethercott, H. N., Maxwell, H., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Stem+Cell+Manual%3A+A+Laboratory+Guide%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell culture.</a> Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. W., Schwartz, P. H. , Elsevier/Cell Press. (2007).</li>
<li>Palmer, T. D., Schwartz, P. H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S. A., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture.+Progenitor+cells+from+human+brain+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture. Progenitor cells from human brain after death.</a> Nature. 411, 42-43 (2001).</li>
<li>Schwartz, P. H., Bryant, P. J., Fuja, T. J., Su, H., O'Dowd, D. K., Klassen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+neural+progenitor+cells+from+post-mortem+human+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex.</a> J Neurosci Res. 74, 838-851 (2003).</li>
</ol>

מצאנו כי פרוטוקול זה מספק אמין של תרבויות hNSPCs. גורם אחד קריטי עבור התאים שלנו היא שהם צריכים להיות כל הזמן כמו תרבויות צפוף למדי, ולא ניתן passaged עד כדי כך התאים דלילה. בידיים שלנו, תרבויות דליל לצמוח באיטיות רבה או לחלוטין הפסקת חלוקת. מסיבה זו, אנו בדרך כלל לפצל התרבויות שלנו 01:02 או 01:03, כאשר התרבות היא צפופה מאוד. את פני השטח של ציפוי צלחת תרבות עם פיברונקטין חשוב שכן הוא מקדם מצורף תא הגירה טוב, אבל, בניגוד laminin, הוא גם מאפשר את השימוש Cell דיסוציאציה חוצץ (CDB) לנתק את התאים. מצורף Ce...

<table><tbody><tr><td>BIT-9500 (BSA, Insulin, Transferrin)</td><td>ריאגנט</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>09500</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12 (1X)</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>EMEM (1X)</td><td>ריאגנט</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>MT-10-010-CV</td><td>מופץ על ידי Fisher תחת מספר הקטלוג המצוין</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>FGF, human basic recombinant</td><td>ריאגנט</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AB</td><td>ריאגנט</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-00AB</td><td></td></tr><tr><td>EGF, human recombinant</td><td>ריאגנט</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40052</td><td>מופץ על ידי Fisher תחת מספר הקטלוג המצוין</td></tr><tr><td>Cell Culture Flask, 25 cm2</td><td>כלי</td><td>Corning</td><td>10-126-28</td><td>מופץ על ידי Fisher תחת מספר הקטלוג המצוין</td></tr><tr><td>Fibronectin, human, natural</td><td>ריאגנט</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40008A</td><td>מופץ על ידי Fisher תחת מספר הקטלוג המצוין</td></tr><tr><td>Human Neural Stem/Precursor Cells</td><td>תאים</td><td>National Human Neural Stem Cell Resource</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Buffer</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>13150-016</td><td></td></tr></tbody></table>

passaging אדם בתאי גזע עצביים

Passaging Human Neural Stem Cells

היכולת לתפעל האדם גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs) במבחנה מספק אמצעי לחקור את השירות שלהם, כמו השתלות תאים למטרות טיפוליות, כמו גם לחקור תהליכים בסיסיים רבים של ההתפתחות העצבית הפתולוגיה האנושית. פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה של ​​culturing ו hNSPCs passaging בתקווה סטנדרטיזציה בטכניקה זו והגדלת reproducibility המחקר תא גזע אנושיים. HNSPCs אנו משתמשים נותקו מן cadaveric בקורטקס המוח לאחר הלידה על ידי משאב לאומי אנוש עצבית לתאי גזע גדל כמו תרבויות חסיד על צלוחיות מצופה פיברונקטין (פאלמר et al, 2001;.. שוורץ et al, 2003). אנחנו תרבות hNSPCs שלנו DMEM: F12 סרום ללא מדיה בתוספת EGF, FGF ו PDGF ומעבר להם 01:02 בערך כל שבעה ימים. שימוש בתנאים אלה, רוב התאים בתרבות לשמור על מורפולוגיה דו קוטבית להביע סמנים של מובחן בתאי גזע עצביים (כגון nestin ו Sox2).

היכולת לתפעל האדם גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs) במבחנה מאפשרת לחקור את השירות שלהם, כמו השתלות תאים למטרות טיפוליות לחקור ההתפתחות העצבית האנושית. פרוטוקול זה מציג שיטה culturing ו hNSPCs passaging בתקווה reproducibility גדל והולך של מחקרים תא גזע אנושיים.

Passaging אדם בתאי גזע עצביים

היכולת לתמרן תאי גזע/קדם-תאים עצביים אנושיים (hNSPCs) במערכת in vitro מספקת אמצעי לבחינת התועלת שלהם כהשתלות תאים עבור...

שלום, אני סטיב. אני עובד במעבדתו של ד"ר פלאנאגן במחלקה לפתולוגיה ב-uc, Irvine. היום אראה לכם כיצד לבצע פיצול של תאי אב עצביים אנושיים.טכניקה זו כוללת ציפוי של בקבוק תרבית חדש בתמיסה של פיברונקטין אנושי, הפרדת התאים באמצעות בופר לפירוק תאים (cell dissociation buffer), ניטרול של בופר פירוק התאים באמצעות תמיסת סרום 10%, סרכוז של תגלי התאים, השהיה מחדש של התאים במצע טרי, והעברת תגלי התאים לבקבוק תרבית חדש. במעבדה שלנו, אנו מתרבטים תאי אב עצביים אנושיים על ידי החלפת מחצית מהמצע שלהם מדי יומיים, ומבצעים להם מעבר (passage) בערך פעם בשבוע על ידי פיצול ביחס של אחד לשניים. בעת ביצוע מעבר לתאים, אני עשוי לספור אותם אם ברצוני להשתמש בהם לניסוי אימונוכימיה, או אם אני מעוניין לבצע טרנספקציה עם אפקטור גרעיני.חשוב להשתמש בתמיסת הפרדת תאים (cell dissociation buffer) בעת אריזת תאים משתי סיבות: ראשית, היא אינה אנזימטית, בניגוד לטריפסין, ושנית, היא עדינה הרבה יותר כלפי התאים. שלום, אנחנו נמצאים כעת בחדר תרביות רקמה, ולפני שאראה לכם איך נראה בקבוק עם תאי אב אנושיים בצפיפות מקסימלית (confluent), אכין תחילה את עמדת תרביות הרקמה. ראשית, אכבה את נורת ה-UV ואדליק את התאורה ואת זרימת האוויר.בשלב הבא, אחטא את תא המטראות באמצעות 70% ethanol על ידי ריסוס נייר סופג וניגוב של התא. חשוב לרסס נייר סופג ב-70% ethano

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

היכרות עם גן עניין לתא היא שיטה חזקה הבהרת תפקידה in vivo. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה transfecting תרבות של גזע אנושי / מבשר תאים עצביים (hNSPCs) באמצעות מנגנון electroporation Nucleofector שנעשו על ידי Amaxa.

Transfecting אדם בתאי גזע עצביים עם Nucleofector Amaxa

ידיעת מספרם המדויק של תאים קיימא נדרש מניפולציות תרבות רבים רקמות. פרוטוקול זה מתאר כיצד להבדיל בין תאים חיים ומתים ולכמת תאים באמצעות hemacytometer. למרות שזה מתאר הספירה האנושית גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs), ניתן להשתמש בו עבור סוגי תאים אחרים.

ספירת אדם בתאי גזע עצביים

בתאי גזע עצביים הוכנו מן ההיפוקמפוס של מבוגרים שאינם חורף סנאים בן שנה הארקטי הקרקע (AGS). תאים אלה גזע עצביים ניתן להרחיב באמצעות מעברים רבים, להיבדל ומתוך רצון להישמר כמו נוירון 50:50 כמעט לתרבות גליה.

גדילה והתמיינות של מבוגרים בהיפוקמפוס סנאי הארקטי קרקע תאים גזע עצביים

שיטה פשוטה ואמינה על בידוד תרבות בתאי גזע עצביים של רקמה אנושית מושלכים קליפת המוח העוברי מתואר. תרבויות שמקורם ידוע הפרעות נוירולוגיות האדם יכול לשמש אפיון של תהליכים פתולוגיים תאית ומולקולרית, כמו גם לספק פלטפורמה כדי להעריך את יעילות תרופתי.

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

הגידול בחולים המוח שגרתי לעבור הקרנות גולגולתי, ואף מועיל, טיפול זה לעתים קרובות תוצאות תפקוד קוגניטיבי מתישה. זו הבעיה הבלתי פתורה רציני כרגע, לא נותר קליני, העלתה את המאמצים שלנו כדי לתכנן תא גזע טיפולים מבוססי להתאוששות של קרינה הנגרמת decrements קוגניטיבי.

גזע להשתלות אסטרטגיות Cell לשיקום של ליקוי קוגניטיבי נגרמת על ידי הקרנות גולגולתי

סרטון זה מדגים את השיטה להבדיל תאי גזע עצביים אנושיים מנוירוספרות לאבות עצביים ואסטרוציטים באמצעות טיפול אנזימטי ותרבית בתווך עשיר בגורמי גדילה, מה שמוביל בסופו של דבר להבשלה לתאי אב מיוחדים.

התמיינות תאי גזע עצביים אנושיים לאבות עצביים ואסטרוציטים

תאי גזע עצביים שנקטפו מהמוח הבוגר מתרבים מנוצלים ביישומים החל המחקר הבסיסי של התפתחות מערכת עצבים לחקור יישומים קליניים פוטנציאליים ברפואת רגנרטיבית. זה הופך את השליטה קפדנית בתנאי הבידוד וculturing משמשים לגידול תאים אלה קריטיים להישמע תוצאות ניסוי.

גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

פרוטוקול זה מתאר שיטת חיתוך מכאנית רומן המאפשרת ההתרחבות של אגרגטים גזע ותאים אב עצביים כדוריים ללא ניתוק להשעית תא בודד. שמירה על קשר תא / תא מאפשרת צמיחה מהירה ויציבה במשך 40 מעברים.

שיטת הרחבת cGMP-ישימה עבור מצרפים של עצבי אנושי ותאים שמקורם בתאי גזע pluripotent או רקמת מוח עוברית

שיטה פותחה לנובעת באופן ישיר בתאי גזע עצביים אנושיים מתאי אבות היווצרות הדם מועשרים מתאי דם היקפיים.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

מתוך כוונה לאפיין שינויים ב-miRNAs על תאי גזע עצביים אנושיים מובחנים (hNSCs) אנו מתארים התמיינות hNSC במערכת תלת מימדית, הערכת שינויים בביטוי microRNA על ידי מערך miRNA PCR, וניתוח חישובי לחיזוי יעד miRNA ואימותו על ידי בדיקת לוציפראז כפולה.

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

חוט השדרה של יונקים בוגרים מכיל תאי גזע/אב עצביים (NSPCs) שניתן לבודד ולהרחיב בתרבית. פרוטוקול זה מתאר את הקציר, הבידוד, התרבית והמעבר של NSPCs שנוצרו מהאזור הפרי-חדרי של חוט השדרה הבוגר מהחולדה ומתורמי השתלת איברים אנושיים.

בידוד של תאי גזע / עצביים מהאזור סביב חדרי המוח של העכברוש למבוגרים וחוט השדרה אנושי

למד שיטה לגידול והעברת תאי גזע עצביים אנושיים (hNSPCs) בתרבית, הכוללת ציפוי בפיברונקטין אנושי, שימוש בממס פירוק תאים וסריקה. שיטה זו משפרת את השחזרותיות במחקר תאי גזע עצביים.

Passaging אדם בתאי גזע עצביים

גלה סרטונים נוספים