דומיין הטרנסממברני Oligomerization הנטייה נקבע על ידי Assay ToxR

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור נטיות קשירה של חלבון, תחומים טרנסממברניים או T MDs בסביבת ממברנה טבעית. זה מושג על ידי ביטוי תחום העניין הטרנסממברני באי קולי כחלבון כימרי עם חלבון קושר מלטוז ללוקליזציה לפרי פלזמה ורעלים. R כמדווח שעתוק, רצועה המושרה על ידי תחום טרנסממברני מביאה לדימריזציה של רעלן R והפעלת שעתוק LXi כשלב שני תאים עוברים ליזה ומטופלים ב-ONPG, אשר עובר הידרוליזה על ידי בטא גלקטו למין סופג האור O ניטרו פולאט או ONP.

רמות ה-ONP הבאות מכומתות על ידי מדידת ספיגת האור ב-405 ננומטר. על מנת לקבוע את רמות התחום הטרנסממברני, תוצאות הרצועה חושפות את נטיית הרצועה של התחומים הטרנסממברניים על סמך בדיקת מדווח רעל R. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות ביופיזיקליות קיימות כגון דף SDS או פלואורסצנטי, הוא שהתנהגות התחום הטרנסממברני נחקרת בשכבה דו-שכבתית טבעית של פוספוליפידים על ידי ביטוי באי קולי ולא במערכת חיקוי ממברנה כמו חומר ניקוי בעצמי.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חלבון הממברנה, כגון הבהרת תכונות מבניות מרכזיות המעורבות באיגוד סליל טרנסממברני לפני תחילת פרוטוקול זה, אבעבועות שבעה פלסמידים המבטאים את החלבון הכימרי הנדרש מוכנים מאוליגונוקלאוטידים מסונתזים מסחרית, המייצגים את ה-TDS המעניין המוקף ב-NHE אחד ו-BMH אחד. אתרי הגבלה לאחר הכנת פלסמידים מפשירים בעדינות fhk 12 תאים מוכשרים על קרח. לאחר ההפשרה, העבירו את התאים לצינורות תרבית של 15 מיליליטר ב-200 ננוגרם מכל DNA פלזמה לצינור נפרד ודגרו את התאים על הקרח למשך 30 דקות.

לאחר מכן מחשמלים את התאים בחום למשך 90 שניות ב-42 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן דגירה על קרח למשך שתי דקות ב-800 מיקרוליטר של מדיה SOC ודגירה של הדגימות ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור במשך שעה לאחר הדגירה מחסנים חמישה מיליליטר של מדיה LB המכילה כלורמפניקול ו-aose עם 50 מיקרוליטר מתערובת הטרנספורמציה באמצעות צינורות תרבית של 15 מיליליטר במשולש עבור כל דגימה. לבסוף, דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך 20 שעות. כדי למדוד את כל הרצועות של TDS בטא גלקטו פעילות TASE.

ראשית, מחממים את קורא הצלחות ל -28 מעלות צלזיוס. השתמש במאגר Z כדי להכין פתרונות מאגר Z טריים כמתואר בפרוטוקול הכתוב. העבירו את כלורופורם מאגר Z מהצינור למאגר, והקפידו לזרום רק את השכבה המימית העליונה של כלורופורם מאגר Z.

הנח את צלחת 96 הבארות על פיסת נייר עם רשת מצויירת כדי להבטיח העברת פיפטינג מדויקת של 100 מיקרוליטר של כלורופורם חיץ Z לכל באר של צלחת של 96 בארות, ואחריה חמישה מיקרוליטר מכל תרבית במרובע. שכפול השמיט את התרבות מארבע הבארות שישמשו כחסר. מדוד את ה-OD 5 95 של הצלחת כדי לקבוע את צפיפות התא.

הוסף 50 מיקרוליטר של Z buffer SDS לכל בארות הצלחת. לאחר מכן נער את הצלחת בקורא הצלחות למשך 10 דקות כדי להניע את התאים לאחר ליזה של תאים ב-50 מיקרוליטר של ZPA עבור ONPG לכל הבארות. החזר את הצלחת לקורא הלוחות ומדוד OD 4 0 5 כל 30 שניות למשך 20 דקות.

קבע את רמת הפעילות של בטא לקטו סאס באמצעות חישוב של יחידות מילר המנורמלות לריק. Western Blotting מבוצע כדי לאמת ביטוי חלבון שווה ערך בין מבנים. ראשית, שלב 50 מיקרוליטר של התרביות המשולשות ולאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות באמצעות מיקרו צנטריפוגה.

הסר את הסופרנטנט על ידי פיפטינג והחייאה. השעו את הגלולה השיורית בשני עומס חיץ טעינת דגימה x 7.5 מיקרוליטר מכל דגימה על ג'ל סטנדרטי של 8% ובצעו אלקטרופורזה ב-125 וולט למשך שעה וחמש דקות לאחר ההעברה. דגירה של הממברנה עם נוגדן מצומד נגד M-V-P-H-R-P כדי לדמיין את החלבון הכימרי נצפה בכ-70 קילודלטון, כאשר כמה תוצרי פירוק נראים לפעמים בסביבות 48 קילודלטון.

MVP אנדוגני נצפה גם ב-45 קילודלטון. על מנת להעריך החדרה נכונה של הממברנה של מבנה ה-TMD הכימרי, נעשה שימוש בקו התאים PD 28 חסר חלבון קושר מלטוז כאשר הוא גדל במדיה מינימלית עם מלטוז כמקור הפחמן היחיד רק תאים המבטאים תוצר ביטוי אינטגרלי של ממברנה עם חלבון קושר מלטוז הממוקם נכון בפרי פלזמה יכולים לגדול. טרנספורמציה של תאי PD 28 כמתואר עבור תאי fhk 12 וחיסון שני מיליליטר של מדיום LB.

גדל את התאים ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-300 סל"ד למשך הלילה לאחר הדגירה. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ושטיפה על ידי תרחיף Resus בשני מיליליטר PBS ופיפטינג עדין עם קצה גדול. לאחר הגלולה, התאים נשטפים שוב עם PBS בפעם השנייה, ואז מבצעים צנטריפוגה אחרונה והשעיית החייאה במיליליטר אחד של PBS.

השתמש ב-25 מיקרוליטר של התאים המרחפים כדי לחסן חמישה מיליליטר של מדיה מינימלית. לדגור על התאים של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור לאחר 15 שעות. העבירו 200 מיקרוליטר מכל דגימה לצלחת של 96 בארות, וקחו את קריאת OD 5 9 5 באמצעות קורא הצלחות.

חזור על תהליך זה כל שעתיים עד 25 שעות. נטיית כל הרצועות של תחומים טרנסממברניים בודדים מהמולטי המשתרעים על פני חלבון אינטגרלי ממברנה סמויה נותחה באמצעות מבחן מדווח השעתוק של tox R. תחום טרנסממברני חמש מציג נטייה חזקה לעליית ליגה כפי שמודגם על ידי יחידות מילר גבוהות, הניתנת להשוואה לרצף הדימריזציה המבוסס היטב של GPAA בקרה חיובית.

מוטציה מזיקה בתחום הטרנסממברני חמש D אחד 50 A מפחיתה את יכולת הרצף לכל עליית הליגה LMP אחת, TM אחת לא עולה באופן משמעותי כל הליגה ומציגה אות יחידת מילר נמוך מאוד ממש מעל האות לריק, שהוא תאי FHK 12 שאינם מותמרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע אם לסליל טרנסממברני מעניין יש את היכולת ליצור קומפלקסים מסדר גבוה יותר בסביבת ממברנה טבעית תוך כדי ניסיון הליך זה, חשוב להחדיר פיפטה בזהירות רבה לתוך צלחת 96 הבארות כדי למנוע שגיאות גדולות ולהבטיח שלא יוכנסו בועות אוויר.