Name: כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: למדו כיצד לכמת פעילות של רכיבים רגולטוריים ברשתית עכבר באמצעות אלקטרופורציה של אקספלנט. הפרוטוקול כולל הכנת DNA, ניתוח רשתית וניתוח פלואורסצנטי לאחר שמונה ימי תרבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות קארן לורנס על עזרתה בבניית קטע המתאר של החדר electroporation.

<ol><li>Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarroll%2C+SB+%22From+DNA+to+diversity+%3A+molecular+genetics+and+the+evolution+of+animal+design%22">From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design</a>. , 2nd edn, Blackwell Pub. (2005).</li>
<li>Davidson, E. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavidson%2C+EH+%22Genomic+regulatory+systems+%3A+development+and+evolution%22">Genomic regulatory systems : development and evolution</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Ptashne, M., Gann, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22Genes+%26+signals%22">Genes & signals</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2002).</li>
<li>Blow, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq+identification+of+weakly+conserved+heart+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq identification of weakly conserved heart enhancers.</a> Nat Genet. 42, 806-810 (2010).</li>
<li>Visel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457, 854-858 (2009).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19, 120-125 (2009).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+function+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li>
<li>Lee, J., Myers, C. A., Williams, N., Abdelaziz, M., Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fine-tuning+of+photoreceptor+cis-regulatory+elements+through+affinity+modulation+of+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Quantitative fine-tuning of photoreceptor cis-regulatory elements through affinity modulation of transcription factor binding sites.</a> Gene Ther. 17, 1390-1399 (2010).</li>
<li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+II.+Autoradiographic+analysis+of+cell+generation+using+tritiated+thymidine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rods and cones in the mouse retina. II. Autoradiographic analysis of cell generation using tritiated thymidine.</a> J Comp Neurol. 188, 263-272 (1979).</li>
<li>Young, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+differentiation+in+the+retina+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cell differentiation in the retina of the mouse.</a> Anat Rec. 212, 199-205 (1985).</li>
<li>Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRX+ChIP-seq+reveals+the+cis-regulatory+architecture+of+mouse+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRX ChIP-seq reveals the cis-regulatory architecture of mouse photoreceptors.</a> Genome Res. 20, 1512-1525 (2010).</li>
<li>Kim, D. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+core+paired-type+and+POU+homeodomain-containing+transcription+factor+program+drives+retinal+bipolar+cell+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A core paired-type and POU homeodomain-containing transcription factor program drives retinal bipolar cell gene expression.</a> J Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).</li>
<li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+for+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li>
<li>Onishi, A., Peng, G. H., Chen, S., Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pias3-dependent+SUMOylation+controls+mammalian+cone+photoreceptor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pias3-dependent SUMOylation controls mammalian cone photoreceptor differentiation.</a> Nat Neurosci. 13, 1059-1065 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Electroporation Explant הוא אמצעי פשוט של לכימות cis-הרגולציה פעילות ברשתית עכבר מתפתחות. בהשוואה לניתוח cis-הרגולציה transgenesis באמצעות העכבר, electroporation הוא הרבה יותר זול, המחייב גורים עכבר היילוד בלבד, DNA, כלי לנתח, electroporation ו / תרבות ציוד רקמות. הוא גם הרבה פחות זמן רב: הניסוי אחד דורש רק כמה שעות של זמן הכנה, תקופה תרבות של כשמונה ימים, ולאחר כמה שעות בסוף הניסוי הדמיה וניתוח נתונים. Electroporation Explant היא גם מעולה לניתוח תרבות מבוססי cis-הרגולציה התא מאז רקמת הרשתית בפועל הוא מנוצל. הרשתית מתפתחת בדרך כלל די explant תרבות היא יוצרת שלוש שכבות נפרדות הסלולר (שכבת הגרעין החיצונית, שכבת הגרעין הפנימי, התא שכבת הגנגליון), למרות photoreceptors להיכשל לפרט מגזרים החיצונית. יתרון נוסף הוא כי electroporation explant ניתנת לשחזור מאוד. בונה אותו electroporated לתוך הרשתית שונים, אפילו בימים שונים, בדרך כלל התוצאות באותן הרמות ביטוי יחסית. יתר על כן, מאז פלסמידים electroporated נחשבים שמרו episomally בגרעין ולא ישולבו כרומוזומים, הם אינם מופיעים להיות כפוף לאתר אותן השפעות האינטגרציה כי לבלבל cis-הרגולציה ניתוח שבוצע העכברים הטרנסגניים. Electroporation Explant יש מספר מגבלות. ראשית, התאים רק כי הם עדיין מחזור התא יכול להיות יעיל transduced ידי electroporation 15. ב P0, מוטות ושאר מאוחר יותר, יליד סוגי תאים ברשתית (תאים דו קוטבית, תאים amacrine, גליה M ller) הם אוכלוסיות תאים העיקרי ממוקד בשיטה זו. Electroporation של photoreceptors חרוט על ידי electroporation P0 דווחה 16 אך היעילות נראה נמוך. המגבלה השנייה היא תרבות explant מעבר שתי תוצאות שבועות מום הדרגתי של הרשתית ולכן אינו מומלץ. אם כימות היזם נדרש על timepoints מאוחר, לעומת זאת, ב electroporation vivo מאי 9 להתבצע, ואחריו לנתיחה רשתית ב timepoint הרצוי שטוח הרכבה של הרשתית גזור, וכימות, כמתואר בסעיף 9. המגבלה השלישית היא assay זה הוא רק בינוני תפוקה גבוהה. בניגוד לתרבות המבוססת על מבחני התא יכול לבדוק את מאות המבנים בניסוי אחד, את הטכניקה המתוארת פרוטוקול זה דורש מינימום של הרשתית עכבר אחד שלם לכל לבנות. לפיכך, רק תריסר בונה כמה סביר electroporated ביום. אזהרה אחת נוספת לגבי כימות של הפעילות באמצעות מקדם את הגישה הנוכחית היא כי קיים פוטנציאל &quot;לדמם דרך&quot; של הקרינה DsRed לתוך התעלה GFP, במיוחד כאשר assaying היזמים חזקה מאוד. הסיבה לכך היא כי ספקטרום פליטה של ​​DsRed חופף חלקית את זה של ה-GFP. כדי לעקוף בעיה זו, מסנני פליטה מותאם אמור לשמש כי למזער את החפיפה בין ספקטרלי DsRed ו-GFP. כאשר כגון מערכות סינון אופטימיזציה אינם זמינים, עוד פתרון אפשרי יהיה להשתמש חלבון כחול מוזז ניאון (למשל, BFP או CFP) במקום ה-GFP.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> צלחת electroporation, Microslide 453 </td><td> BTX הרווארד Apparatus </td><td> 45-0105 </td><td> ראה סעיף 1 בפרוטוקול לשינויים </td></tr><tr><td> 100% גומי סיליקון מלט אקווריום </td><td> פרפקטו ייצור </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microtube פלסטיק מתלה </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 05-541 </td><td> רק להתמודד עם מתלה ישמש </td></tr><tr><td> כלי Dremel </td><td></td><td></td><td> לחיתוך את הידית מתלה צינור פלסטיק </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> 100x ריכוז </td></tr><tr><td> אינסולין </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> I-6634 </td><td> עבור המניות 1000x, resuspend ב 5mg/ml ב HCl 5mm ולסנן-לעקר </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 כיכר גל electroporator </td><td> BTX הרווארד Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore מסננים </td><td> Whatman </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0.2μm </td></tr><tr><td> רקמות תרבות חממה </td><td></td><td></td><td> 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> זכוכית coverslips # 1.5 </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 12-544E </td><td> עבה 0.16mm </td></tr><tr><td> תרכובת מיקרוסקופ פלורסנט מצויד במצלמה </td><td></td><td></td><td> המצלמה צריכה להיות חד גוני (למשל, ORCA-ER מצלמה ידי Hamamatsu) </td></tr><tr><td> EGFP / להגדיר מסנן DsRed עבור מיקרוסקופ מתחם </td><td> Chroma טכנולוגיה קורפ </td><td> 86007 </td><td> זה bleedthrough להגדיר מסנן ממזער chanenels בין אדום וירוק </td></tr><tr><td> ImageJ תוכנה </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

כימות של פעילות cis-regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation explant

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

גורמי שעתוק בתוך רשתות גנים הסלולר לשלוט דפוס spatiotemporal ורמות הביטוי של גנים היעד שלהם באמצעות קשירה cis-הרגולציה אלמנטים (צרס), קצר (~ 300-600 נ&quot;ב) מותח של הדנ&quot;א הגנומי אשר יכול לשקר במעלה הזרם, במורד הזרם, או בתוך אינטרונים הגנים הם שולטים. צרס (כלומר, משפרי / היזמים) בדרך כלל מורכב מרובים אתרי הקישור אשכולות הן activators ו repressors תעתיק 1-3. הם משמשים אינטגרטורים הלוגי של קלט תעתיק מתן פלט יחידתי בצורה של פעילות האמרגן מדויק spatiotemporally ומדויק כמותית. רוב המחקרים של יונקים cis-תקנה עד כה הסתמכה על transgenesis העכבר כאמצעי assaying משפר את הפונקציה של צרס 4-5. טכניקה זו זמן רב, יקר, על חשבון תופעות באתר הכנסת, בעיקר לא כמותי. מצד שני, מבחני כמותיים לתפקוד Cre יונקים פותחו מערכות תרבות רקמות (למשל, מבחני בלוציפראז כפול), אבל ב vivo הרלוונטיות של תוצאות אלו היא לעיתים קרובות לא ברור. Electroporation מציע אלטרנטיבה מצוינת transgenesis העכבר המסורתי בכך שהוא מאפשר גם spatiotemporal הערכה כמותית של פעילות cis-הרגולציה רקמה חיה יונקים. טכניקה זו הייתה שימושית במיוחד בניתוח של רגולציה-cis במערכת העצבים המרכזית, בעיקר בקליפת המוח ואת רשתית 6-8. בעוד electroporation עכבר הרשתית, הן in vivo לשעבר vivo, פותחה ותיאר בהרחבה על ידי מאטסודה ו Cepko 6-7,9, פיתחנו לאחרונה גישה פשוטה לכמת את הפעילות של photoreceptor ספציפי צרס ב electroporated עכבר הרשתיות 10. בהתחשב בכך את כמות ה-DNA כי הוא הציג לתוך הרשתית על ידי electroporation יכול להשתנות מניסוי לניסוי, יש צורך לכלול &quot;טעינה מלאה&quot; שותף electroporated בניסויים בכלל. במובן זה, הטכניקה דומה מאוד assay בלוציפראז כפול המשמש לכמת פעילות הפרומוטר בתאים בתרבית. כאשר assaying photoreceptor cis-הרגולציה פעילות, electroporation מתבצעת לרוב בעכברים היילוד (יום הלידה 0, P0) המהווה את זמן הייצור מוט שיא 11-12. ברגע סוגי תאים ברשתית להיות שלאחר mitotic, electroporation הוא הרבה פחות יעיל. לנוכח שיעור גבוה של לידת מוט בעכברים הילוד לבין העובדה מוטות מהוות יותר מ 70% של תאים ברשתית עכבר מבוגר, הרוב המכריע של התאים electroporated ב P0 הן מוטות. מסיבה זו, photoreceptors מוט הם סוג הקלה תא רשתית ללמוד דרך electroporation. הטכניקה שאנו מתארים כאן הוא שימושי בעיקר עבור לכימות פעילות של צרס photoreceptor.

פרוטוקול זה מתאר דרך פשוטה וזולה לכמת את הפעילות של cis-הרגולציה אלמנטים (כלומר, משפר / היזמים) לחיות הרשתיות העכבר דרך electroporation explant. הכנת ה-DNA, דיסקציה רשתית, electroporation, תרבות explant רשתית, שלאחר קיבוע ניתוח וכימות מתוארים.

כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant

גורמי שעתוק בתוך רשתות גנים תאיות שולטים בתבנית המרחבית-זמנית וברמות הביטוי של הגנים המטרים שלהם על ידי קישור ל...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע אלקטרופורציה לשתולי רשתית של עכבר עם דיווחים תעתוקיים פלואורסצנטיים ולכמת את רמות הביטוי שלהם. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד רקמת רשתית של עכבר ניאונטלי באמצעות דיסקציה. השלב השני של הפרוצדורה הוא ביצוע אלקטרופורציה לרשתית באמצעות מבני דנ"א של דיווח פלואורסצנטי.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא גידול של הרשתיות שעברו אלקטרופורציה כשתלים למשך שמונה ימים. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא קצירת נתח הרשתית (explan) וכימות רמות הביטוי של הדיווחים הפלואורסצנטיים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את רמות הביטוי היחסיות של מבני פרומוטר-דיווח שונים ברשתית של עכבר בשלבי התפתחות, באמצעות אלקטרופורציה של נתח הרשתית, ולאחריה ניתוח נתונים כמותי.שמי ג'ו קורבו ואני חבר סגל במחלקה לפתולוגיה ואימונולוגיה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס. היום נציג פרוטוקול וידאו המדגים את הטכניקה של electroporation של תכשירים (ex vivo) לרשתית של עכברים בניו born, לצורך כימות פעילות של אלמנטים רגולטורים של CYS הספציפיים לפוטורצפטורים; תדגים את הפרוטוקול הזה סינדי מונטנה, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. ראשית, סטריליזציה של תא ה-electroporation וכל המכשירים באמצעות 70% ethanol כהכנה לאיסוף העיניים.חטאו את הכפפות ואת משטח העבודה באתנול ושמרו על תנאים סטריליים לאורך כל הפרוצדורה. לאחר מכן, בתוך מנדף לתרבית רקמות, העבירו בעזרת פיפט שש מיליליטר של מדיום לדיסקציה לכלי Petri סטרילי אחד בקוטר 60 מילימטר, ושלושה מיליליטר של מדיום לשני כלי Petri סטריליים בקוטר 35 מילימטר. בחזרה על משטח העבודה, חטאו את הראש והצוואר של גור עכבר ניבולד באמצעות 70% ethanol.לאחר ביצוע עקירה מהירה של הראש באמצעות מספריים, העבירו את הראש לפיתה סטרילית של 100 מילימטר, הסִירו את קרקפת הראש בעזרת מספריים קטנים כדי לחשוף את העיניים תחת מיקרוסקופ דיסקציה. בעזרת פינצטה קמורה, הוציאו בעדינות את העין מתוך המגלף והניחו אותה בפיתה של 35 מילימטר המכילה תמיסת דיסקציה. המשיכו לאסוף עיניים כך שיהיו שלוש עד ארבע עיניים לכל מנה של DNA המיועדת לאלקטרופורציה, תוך שמירה על העיניים ותמיסת הדיסקציה בטמפרטורת החדר עד לסיום הפעולה.חטאו הן את להב התערה והן את עטיפתה של פיפטת העברה פלסטית סטרילית באמצעות 70% ethanol, ולאחר מכן השתמשו בלהב התערה כדי לחתוך את קצה הפיפטה בגובה מספיק כדי שניתן יהיה לשאוב עין שלמה. באמצעות הפיפטה שהורחבה, העבירו עין אחת מהצלחת בעלת ה-35 מילימטר למשקית בעלת ה-60 מילימטר תחת מיקרוסקופ דיסקסיבי בהגדלה גבוהה. השתמשו בפינצטה עדינה כדי להסיר רקמות, כגון שרירי העין החיצוניים ושומן, מפני השטח של העין.לאחר מכן, הסירו את העצב האופטי על ידי צביטה בבסיסו. כדי לבודד את הרשתית, צרו חור קטן בסקלרה (לחמיות העין) באזור הלימבוס; הסקלרה והאפיתל הפיגמנטי של הרשתית נראים מבריקים ביחס לרקמת הרשתית, שנראית באפור מט. הכניסו זרוע אחת מכל אחד מזוגי הפינצטות אל תוך החור וקרעו בעדינות את הסקלרה ואת ה-RPE.הקפידו להשאיר את העדשה במקומה. השתמשו בפיפטה המורחבת כדי להעביר את הרשתית המנותחת לכלי 35 מילימטר שני המכיל מצע גידול. אספו את כל הרשתיות ואחסנו אותן באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 degree Celsius.עד לשלב האלקטרופורציה, בעבודה תחת מנדף לתרביות רקמה, מלאו עבור כל מנה של DNA המיועדת לאלקטרופורציה צלחת סטרילית אחת בקוטר 35 מילימטר במדיום דיסקציה וצלחת שנייה במדיום תרבית. באמצעות פיפטה P 200, שטפו את התאים בצלחת האלקטרופורציה עם one XPBS סטרילי 3 פעמים. מלאו את התאים במנות של 60 microliter DNA, ומלאו את כל התאים שאינם בשימוש ב-60 microliters של one XPBS.חברו את האלקטרודות לצלוחית האלקטרופורציה והזינו את ההגדרות המתאימות במכשיר האלקטרופורציה. השתמשו בפינצטה עדינה כדי לתפוס את הרשתות בעזרת העדשה והעבירו אותן לתאי האלקטרופורציה. הניחו עד ארבע רשתות בכל תא.סדרו את הרשתות כך שהעדשה תישען על מוט המתכת המחובר לאלקטרודה החיובית. נגבו את הפינצטה בין תא לתא כדי למנוע מעבר של DNA מתא אחד למשנהו. לאחר שכל הרשתות מיושרות, לחצו על כפתור ההפעלה (start) במכשיר האלקטרופורזה.בועות קטנות אמורות להיווצר על מוט המתכת המחובר לאלקטרודה השלילית. נתק את האלקטרודות וכבה את מכשיר האלקטרוליזה באמצעות פינצטה. הרחק בעדינות את הרשתות מדפנות התא.העבירו את הרשתיות מהתאים אל צלחות של 35 מילימטר המכילות מדיום לניתוח. בעזרת פיפט העברה סטרילית, העבירו את הרשתיות ממדיום הניתוח אל צלחות של 35 מילימטר המכילות מדיום תרבית. סמנו את הבארות של פלטת תרבית סטרילית בעלת שש בארות ומלאו כל בארה ב-3 מיליליטר של מדיום תרבית.השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להניח מסנני watman nucleo עגולים על פני המצע בכל באר, כאשר הצד המבריק של המסננים פונה כלפי מעלה. בעזרת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting scope), העבירו רשתית אחת על המסנן באמצעות פיפטת העברה סטרילית, כאשר צד העדשה פונה כלפי מטה. אם הרשתית נחתה כאשר צד העדשה פונה כלפי מעלה, שאבו אותה חזרה אל הפיפטה ונסו שוב.הניחו לא יותר מארבע רשתות בכל באר ושמרו אותן בטיפות נפרדות. לאחר הנחת הרשתות בבארה, העבירו את פלטת התרבית למדגרה לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C וגידלו למשך הזמן הרצוי. בדרך כלל, שמונה ימים כפי שמוצג כאן, תוצאות אלקטרופורציה מוצלחות מובילות לביטוי של מבנה ה-DNA על פני רבע עד שליש משטח הרשתית.רמות הפלואורסצנציה נמדדות על ידי השוואה בין אזורים שעברו אלקטרופורציה אחידה ומבטאים את מבנה ה-CRE לבין אזורים מחוץ לרשתית, ולאחר מכן נורמליזציה ביחס לביטוי GFP של ביקורת. נראה כי פוטורצפטורים מסוג rod עוברים טרנסדוקציה ביעילות רבה במיוחד. להלן תוצאות של אלקטרופורציה שבה שני קידומים (promoters) ספציפיים ל-rod מניעים ביטוי של GFP ו-DS red בשכבה הגרעינית החיצונית.על ידי הלבשת שתי תבניות הביטוי עם צביעת DPI המוצגת כאן בכחול, ניתן להבחין בביטוי הספציפי לקולטנים הפוטו-אלקטריים. לא נצפה ביטוי לא בשכבה הבין-צלולית ולא בשכבת תאי הגנגליון. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם תמונה ברורה לגבי אופן ביצוע הדיסקציה, האלקטרו-קלטורה של השתלי רשתית מעכבר לצורך כימות הפעילות של אלמנטים רגולטוריים של ציסטות ברשתית.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

quantifying-activity-cis-regulatory-elements-mouse-retina-explant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מציגים שתי טכניקות מניפולציה ביטוי גנים בתאי הגנגליון ברשתית Murine (RGCs) על...

ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

שיטה שילוב של פלסמיד דנ"א לתוך תאים ברשתית Murine לצורך ביצוע או רווח או הפסד של מחקרים...

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

מאמר זה מתאר את ההקלטה של ​​תאים בודדים מאוכלוסיות העצבית מתויג fluorescently ברשתית עכבר ללא פגע. באמצעות שני הפוטונים עירור בתאי אינפרא אדום שכותרתו transgenetically היו מטרה הקלטה תיקון-clamp ללמוד לאור התגובות שלהם, מאפייני שדה פתוח, ומורפולוגיה.

אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

שיטה א 'תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

המטרה הכללית של סרט זה היא להראות כיצד לבצע הזרקת רשתית...

ב electroporation לג&#39;ימי ברשתית צ&#39;יק עובריים

ב electroporation חוץ גופית של השפה Rhombic התחתון של עוברי עכברים Midgestation

תרביות תאים עובריים חומוס רשתית מהוות כלים חשובים למחקר של ביולוגיה קולטי האור. פיתחנו טכניקת העברה יעילה של גנים המבוססת על לשעבר אוב electroporation פלסמיד של הרשתית לפני התרבות. טכניקה זו במידה ניכרת מגבירה את יעילות transfection על פרוטוקולים זמינים כרגע, מה שהופך את המניפולציה גנטית אפשרית למערכת זו.

העברה יעילה ג'ין בצ'יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות: אקס-אוב גישת Electroporation

פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית.

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

אנו מדגימים שיטה להשתלת תאים מתורבתים לאתרים מוגדרים של עוברי עכברים מוקדמים כדי לקבוע את הפוטנציאל שלהם in vivo. אנו מציגים גם שיטת אלקטרופורציה אופטימלית המשתמשת בנימי זכוכית בקוטר ידוע, המאפשרת העברה מדויקת של DNA אקסוגני לכמה תאים בעוברים.

שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים

פיתחנו גישה חדשנית של אובדן תפקוד הכוללת החדרה ואינטגרציה גנומית של רצפי מיקרו-רנ"א מלאכותיים לעוברי אפרוחים באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2. טכניקה זו מספקת מתודולוגיית פירוק גנים חזקה ויציבה לחקר תפקוד גנים במהלך ההתפתחות.

גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי

למדו כיצד לכמת פעילות של רכיבים רגולטוריים ברשתית עכבר באמצעות אלקטרופורציה של אקספלנט. הפרוטוקול כולל הכנת DNA, ניתוח רשתית וניתוח פלואורסצנטי לאחר שמונה ימי תרבית.

כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant

גלה סרטונים נוספים