כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant

פרוטוקול זה מתאר דרך פשוטה וזולה לכמת את הפעילות של cis-הרגולציה אלמנטים (כלומר, משפר / היזמים) לחיות הרשתיות העכבר דרך electroporation explant. הכנת ה-DNA, דיסקציה רשתית, electroporation, תרבות explant רשתית, שלאחר קיבוע ניתוח וכימות מתוארים.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לטהר שתלי רשתית של עכברים עם מדווחי שעתוק פלואורסצנטיים ולכמת את רמות הביטוי שלהם. זה מושג על ידי בידוד רקמת רשתית של עכבר יילוד באמצעות דיסקציה. השלב השני של ההליך הוא אלקטרו את הרשתית עם מבני מדווח DNA פלואורסצנטיים.

השלב השלישי של ההליך הוא תרבית הרשתית האלקטרופוטרית כשתלים למשך שמונה ימים. השלב האחרון של ההליך הוא לקצור את הוצאת הרשתית ולכמת את רמות הביטוי של המדווחים הפלואורסצנטיים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המציגות את רמות הביטוי היחסיות של מבני מדווח מקדמים שונים ברשתית העכבר המתפתחת באמצעות אלקטרופורציה של x explan, ואחריה ניתוח נתונים כמותיים.

שמי ג'ו קורבו ואני חבר סגל במחלקה לפתולוגיה ואימונולוגיה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס. והיום אנו הולכים להציג פרוטוקול וידאו המדגים את הטכניקה של אלקטרופורציה של X לתוך רשתית עכברים שזה עתה נולדו לצורך כימות הפעילות של אלמנטים רגולטוריים ספציפיים של CYS והדגמה של פרוטוקול זה תהיה סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי, סינדי מונטנה. ראשית יש לעקר את תא האלקטרופורציה ואת כל המכשירים עם 70% אתנול כהכנה לאיסוף העיניים.

חיטוי כפפות וספסל באתנול ושמירה על תנאים סטריליים לאורך כל ההליך. לאחר מכן, במכסה מנוע תרבית רקמות פיפטה שישה מיליליטר של מדיום דיסקציה לצלחת פטרי סטרילית אחת של 60 מילימטר, ושלושה מיליליטר של מדיום לשתי כלים סטריליים של 35 מילימטר. בחזרה לספסל, חטאו את הראש והצוואר של גור עכבר שזה עתה נולד עם 70% אתנול.

לאחר עריפת ראש הראש במהירות באמצעות מספריים, העבירו את הראש לכלי סטרילי של 100 מילימטר, חתכו את הקרקפת במספריים קטנים כדי לחשוף את העיניים תחת מיקרוסקופ מנתח. בעזרת מלקחיים מעוקלים, הוציאו בעדינות את העין מהמסלול ולאחר מכן הניחו את העין בצלחת בגודל 35 מילימטר המכילה דיסקציה. בינוני. המשיכו לאסוף את העיניים כך שיהיו שלוש עד ארבע עיניים לכל כמות של DNA שיש לאלקטרופורציה, תוך שמירה על העיניים ומדיום הדיסקציה בטמפרטורת החדר עד לסיום.

יש לחטא גם סכין גילוח וגם את העטיפה של פיפטה סטרילית מפלסטיק עם אתנול 70%, ולאחר מכן להשתמש בסכין הגילוח כדי לחתוך את קצה הפיפטה גבוה מספיק כדי שניתן יהיה לזרוק עין שלמה. באמצעות הפיפטה המורחבת העבירו עין אחת מצלחת ה-35 מילימטר לצלחת ה-60 מילימטר תחת מיקרוסקופ מנתח בעוצמה גבוהה. השתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר כל רקמה כגון שרירים חוץ עיניים ושומן מפני השטח של העין.

לאחר מכן הסר את עצב הראייה על ידי צביטה בבסיסו. על מנת לבודד את הרשתית, לתקוע חור קטן בסקלרה בלימבוס, הסקלרה והאפיתל הפיגמנטי ברשתית נראים מבריקים ביחס לרקמת הרשתית, שהיא מאט גריי. הכנס חוד אחד משני זוגות המלקחיים לתוך החור וקרע בעדינות את הסקלרה וה-RPE.

הקפד להשאיר את העדשה במקומה. השתמש בפיפטה המורחבת כדי להעביר את הרשתית המנותחת לתוך הצלחת השנייה בגודל 35 מילימטר המכילה מדיום. אוספים את כל הרשתית ומאחסנים אותה באינקובטור תרבית רקמות של 37 מעלות צלזיוס.

עד לאלקטרופורציה שעובדת במכסה המנוע של תרבית רקמות עבור כל DNA Eloqua שיש לאלקטרפורציה, מלאו צלחת סטרילית אחת בגודל 35 מילימטר במדיום דיסקציה וצלחת שנייה במדיום תרבית. בעזרת פיפטה P 200 יש לשטוף את התאים בצלחת האלקטרופורציה עם XPB S3 סטרילי אחד. מלאו את התאים ב-60 מיקרוליטר DNA aliquots ומלאו את כל התאים שאינם בשימוש ב-60 מיקרוליטר של XPBS אחד.

חבר את האלקטרודות לצלחת האלקטרופורציה והזן את ההגדרות המתאימות באלקטרו. השתמש במלקחיים עדינים כדי לתפוס את הרשתית על ידי העדשה ולהעביר אותן לתאי האלקטרופורציה. הנחת עד ארבע רשתית בכל תא.

סדרו את הרשתית כך שהעדשה תישען על מוט המתכת המחובר לאלקטרודה החיובית. נגב את המלקחיים בין כל תא כדי למנוע העברת DNA מחדר אחד למשנהו. לאחר שכל הרשתית מיושרת, לחץ על התחל באלקטרו.

בועות זעירות צריכות להיווצר על מוט המתכת המחובר לאלקטרודה השלילית. נתק את האלקטרודות וכבה את האלקטרו באמצעות מלקחיים. הרחיקו בעדינות את הרשתית מדפנות החדר.

העבירו את הרשתית מהתאים לתוך צלחות 35 מילימטר המכילות מדיום דיסקציה. בעזרת פיפטת העברה סטרילית, העבירו את הרשתית ממדיום החיתוך לצלחות בגודל 35 מילימטר המכילות מדיום תרבית. סמן את הבארות של צלחת תרבות סטרילית של שש בארות ומלא כל באר בשלושה מיליליטר תרבית. בינוני.

השתמש במלקחיים סטריליים כדי לצוף מסנני גרעין ווטמן עגולים על גבי המדיום בכל באר כשהצד המבריק של המסננים פונה כלפי מעלה. בעזרת היקף ניתוח, העבירו רשתית בודדת על המסנן עם עדשת פיפטה סטרילית כלפי מטה. אם הרשתית נוחתת עם צד העדשה כלפי מעלה, משוך אותה בחזרה לתוך הפיפטה ונסה שוב.

מניחים לא יותר מארבע רשתית בכל באר ושומרים אותן בטיפות נפרדות. לאחר הנחת הרשתית בבארות, העבירו את צלחת התרבית לאינקובטור תרבית רקמות של 37 מעלות צלזיוס וגדלו למשך הזמן הרצוי. בדרך כלל שמונה ימים שנראים כאן מוצלחים אלקטרופורציה מביאה לביטוי של מבנה ה-DNA על פני רבע עד שליש משטח הרשתית.

רמות הקרינה מכומתות על ידי השוואת אזורים אלקטרופוטיים אחידים המבטאים את מבנה ה-CRE לאזורים מחוץ לרשתית ולאחר מכן מנרמל כדי לשלוט בביטוי GFP. קולטני אור מוט בפרט מתמרים ביעילות מוצג. להלן התוצאות של אלקטרופורציה שבה שני מקדמים ספציפיים למוט מניעים ביטוי של GFP ו-DS אדום בשכבה הגרעינית החיצונית.

על ידי כיסוי שני דפוסי הביטוי עם צביעת DPI המוצגת כאן בכחול, הביטוי הספציפי לקולטן הצילום ניכר. לא נצפה ביטוי בשכבת הבין-קליר או בשכבת תאי הגנגליון. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד אתה מנתח אלקטרו ותרבית של צמחי רשתית עכברים לצורך כימות הפעילות של אלמנטים מווסתים של ציסטה ברשתית.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.