שילוב גנים ממוקד בתיווך TALEN: שימוש בנוקלאזות ספציפיות לרצף מהונדס להחדרה מדויקת של גן חלבון פלואורסצנטי לתוך hiPSCs
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
טכניקות ביולוגיות
0 צפיות • 4:24 דק׳ • July 8th, 2025
התחל עם תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם או תרחיף hiPSC במדיה. הוסף זוג נוקלאז אפקטור דמוי מפעיל שעתוק או פלסמידים מקודדי TALEN. תוסף עם פלסמיד תורם הנושא גן חלבון פלואורסצנטי, יחד עם גן עמידות לאנטיביוטיקה, עם זרועות הומולוגיה סמוכות ליישור ספציפי למיקומי המטרה.
אלקטרופוראט את התערובת כדי ליצור נקבוביות חולפות בקרומי התאים, מה שמאפשר הפנמת פלסמיד. ברגע שנכנסים לתאים, הפלסמידים המקודדים ל-TALEN מעובדים, ומייצרים TALENs - חלבונים כימריים המורכבים מתחום קשירת DNA TALE ספציפי לאתר שהתמזג לתחום מחשוף אנדונוקלאז הגבלת FokI לא ספציפי.
כל מונומר TALEN באמצעות תחום קשירת ה-DNA שלו - הכולל מודולים חוזרים של חומצות אמינו טנדם - מזהה ונקשר למיקומי מטרה, מודול אחד לכל נוקלאוטיד, על כל גדיל DNA בכיוונים מנוגדים, מופרדים על ידי רצף מרווח. לאחר מכן, תחומי FokI מתעמעמים ומבקעים את ה-DNA בתוך רצף המרווח, ויוצרים הפסקות דו-גדיליות עם תלויים.
בנוכחות פלסמיד תורם המכיל זרועות הומולוגיה משלימות לאזורים המאגפים את האתר השסוע, מתרחש תיקון מכוון הומולוגיה תוך שימוש ברצף ההומולוגי כתבנית לסינתזה של תיקון DNA כדי לגשר על שבירת הגדילים הכפולים. לאחר קשירת החריצים, החלבון הפלואורסצנטי המתערב והגנים העמידים לאנטיביוטיקה משולבים בגנום המארח.
טפל ב-hiPSCs, שנזרעו על שכבת תא מזין כדי לתמוך בגדילה, בחו
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים