FSL בונה: שיטה פשוטה שינוי Cell / Virion משטחים עם מגוון רחב של סמנים ביולוגיים מבלי להשפיע ליכולת הקיום שלהם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתייג באופן לא מזיק ומהיר את פני השטח של תאים חיים או S במבנים ביו-אקטיביים. זה מושג על ידי הכנת תמיסת מבנה מרווח פונקציה, ליפיד או FSL. לאחר מכן, חלק שווה מתמיסת הבנייה מעורבב עם חלק שווה מתמיסת התאים או ה- VIRs.

כשלב שלישי, התערובת מודגרת במשך 60 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. השלב האחרון הוא לשטוף את התאים או הציטים ששונו או ה-VIRs או ה-VIRs ששונו ולהשתמש בהם באופן ניסיוני כרגיל. בסופו של דבר, ניתן לדמיין תאים חיים שעברו שינוי פני השטח או S באמצעות כל טכניקות הניתוח הניסיוניות השגרתיות, כולל ציטומטריית זרימה, מיקרוסקופיה ואגלוטינציה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תיוג קוולנטי, הוא שהיא מהירה, חזקה, גמישה ואינה משפיעה על החיוניות של התא השונה או ה-Varian. כדי להכין תחילה את תמיסת מלאי הבנייה של FSL, הוסף מיליליטר אחד של מדלל לקובץ המוצר כדי להרכיב מחדש את מוצר ה-FSL היבש, וליצור תמיסת מלאי של מיליגרם אחד למיליליטר. סוניקציה של הבקבוקון למשך 30 שניות, הכניסו את הציר למיכלים סטריליים של 100 מיקרוליטר ואחסנו את המיכלים בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס עד שבוע.

כדי להכין פתרונות בניית FSL עובדים להחדרה ממש לפני השימוש בסוניקציה יש להחדיר את התמיסה שוב למשך 30 שניות כדי להומוגניזציה של כל תאי מיס, ואז לדלל את מבנה ה-FSL ולחצץ לריכוז הנדרש. אחסן את תמיסת העבודה בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס עד שבוע לאחר תרחיף Resus במדיה נטולת שומנים או בצנטריפוגה PBS התאים לשינוי FSL ללא שומנים לא קשורים. לאחר מכן אורזים את התאים ב-100 מיקרוליטר של מדלל, שוטפים את התאים לבקרות באותם תנאים ל-100 מיקרוליטר של תאים ללא שינוי.

הוסף 100 מיקרוליטר של דילול מתאים של תמיסת FSL אם תרצה. במקביל, צור גם בקרות שליליות עם פתרונות FSL ו/או PBS לא קשורים. לאחר מכן דגרו על כל תת-קבוצות התאים למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס לאחר הדגירה.

שטפו את כל התאים פעמיים עם מדיה נטולת שומנים או PBS כדי להסיר כל מבני FSL חופשיים והכינו תרחיף מתאים במדיה נטולת שומנים. לאחר השלמת תהליך שינוי ה-FSL, ניתן לאחסן את ה-coys בארבע עד שמונה מעלות צלזיוס כמו פרח. מבני FSL מורכבים משלושה מרכיבים עיקריים, הראש הפונקציונלי או F, שיכולים להיות מגוון קבוצות פונקציונליות ביולוגית.

המרווח RS נועד לגרום למרווח של הראש הפונקציונלי הרחק מהממברנה כדי לשפר את פיזור המים ולהיות לא מגיב עם סרום אנושי ושומן DAL או L, המאפשר למבנה להשתלב באופן ספונטני במשטחים ארבעה. קבוצות FSL מייצגות מוצגות בחמש התמונות הבאות. עוברי עכברים חיים סומנו ישירות בשיטת FSL fluorescein בשיטת שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס במצע תרבית תאים חופשיים בסרום שנשטף ולאחר מכן נצפה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בתמונה הראשונה הזו, ניתן לראות עובר שיקוף של שני תאים ללא זופ פאליטה. הצביעה האינטנסיבית באמצע העובר מייצגת צביעה קוטבית קלאסית של הגוף. בשתי התמונות הבאות, עוברי שיקוף חופשיים של ארבעה תאים ושמונה תאים המציגים צביעה צללית של התאים שנמצאים מחוץ למיקרוסקופ P של המיקוד מוצגים כאן.

תמונה של עובר משקף 16 תאים ללא זופ פליטה מוצגת בתמונה האחרונה הזו של FSL fluorescein המסומן בעוברים משקפים חיים בני ארבעה עד חמישה ימים שלמים עוברים עם עובר ו-zop LUCITA מסומנים מוצגים בסדרת התמונות הבאה. מוצג תיוג פלואורסצאין FSL של דג הזברה. תמונה ראשונה זו היא של מיקרו-אנגיוגרפיה של זחלי דג זברה 52 שעות לאחר ההפריה שקיבלו FSL פלואורסצאין הוזרק ישירות למחזור הדם.

ניתן לראות כאן מכתים של כלי הדם של דג הזברה. פלואורסצאין FSL, תאי רקמת כליה הטרוגניים של דג הזברה או ציטי ZK נוצרו exvivo ולאחר מכן הוזרקו מיקרו למחזור של 52 שעות לאחר ההפריה דג זברה in vivo תצפיות של ציטי ZK נעשו שעתיים לאחר ההזרקה על ידי הדמיה של כלי הדם תחת פלואורסצנטיות עם מיקרוסקופ זמן-lapse המוצג הוא מסגרת וידאו בודדת עם תאים גדולים הנעים לאט או לא ניידים המסומנים בחצים כתומים ותאים הנעים במהירות, שנראו מטושטשים בשל תנועתם המסומנת בחיצים ירוקים. בתמונה זו, מוצג תיוג פלואורסצאין FSL על ידי קליטה אוראלית של המבנה שהושג על ידי טבילת עוברי דג זברה ומדיה המכילה פלואורסצאין FSL למשך עד חמישה ימים.

מיקרוסקופ השדה הבהיר של דג הזברה שטופל בפלואורסצאין FSL משמאל תואם את התמונה הפלואורסצנטית הסמוכה מימין. הקרינה הייתה ממוקמת באופן מועדף במערכת העיכול. לא נצפה כתמים בעוברי הביקורת הלא מטופלים המוצגים כאן.

כאן נגיף סטומטיטיס שלפוחית או VSV מתויג ישירות עם 10 מיקרוגרם למיליליטר של פלואורסצאין FSL למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן קיבוע עם 4% אלדהיד פרפורם, ולאחר מכן ניתוח על ידי סריקת עובדות לא הראה טיהור של VSV vir. היה צורך בתיוג לאחר FSL. היסטוגרמה זו מציגה תאי אשך חזירים הנגועים בבני אדם A Puerto Rico 8 19 34 או H one N one VIRs המסומנים ב- FSL fluorescein.

תאים לא נגועים שאינם פלואורסצנטיים מיוצגים על ידי הקו השחור בעוד שאיחוי של H one N אחד עם תאי החזירים, שהביא לפלואורסצנטיות מסומן על ידי הקו האדום. בסדרת התמונות הבאה, התאים סומנו תחילה בביוטין FSL למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, לאחר מכן נשטפו והגיבו עם פלואור ארבע עם תווית avadon ולאחר מכן נשטפו והורכבו רטובים למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. התמונה הראשונה מציגה תמונה קונפוקלית מורכבת של סיוע בפיצוצים של עובר עכבר, ואיור זה מראה פרוסה קונפוקלית מרכזית של העובר מהתמונה הקודמת.

הנה בני אדם חיים ותנועה. הטשטוש מתרחש כתוצאה מתנועתם. תמונה מייצגת מובהקת יותר של זרעונים אנושיים קבועים ב-4% אלדהיד פרפורמי לאחר החדרת ניתן לראות באיור זה כאן.

אריתרוציטים אנושיים המסומנים בביוטין FSL מוצגים קיבוע עם 4% פרפורמים אלדהיד החדרה מראש אינו משפיע על תיוג FSL כפי שמוצג בשני האיורים הבאים כאן, ניתן לצפות בתאי קרצינומה אנושית קבועים של 4% RL 95. ואילו בתמונה זו, תאי קרצינומה אנושית של רירית הרחם RL 95 אינם קבועים. כמעט ולא נצפים הבדלים בתיוג בין שתי התמונות עם או בלי קיבוע.

ביוטין FSL המסומן בציטים RBC שנצפו בדגימת דם שנלקחה שעתיים לאחר עירוי תוך ורידי של הציטים מוצגים כאן משמאל, התאים נצפו תחת מיקרוסקופ אור מימין, אותו שדה תאים נצפה תחת פלואורסצנטיות, וניתן לזהות את שני הציטים הקיימים בירוק. חישוב היחס בין הציטים לתאים ללא תווית יכול לשמש כאינדיקטור להישרדות. תמונת התא האחרונה הזו עם תווית ביוטין FSL מציגה ציטים חיים של ביוטין רירית הרחם האנושית שהודגמו על ידי קשירה לחרוזים מופחתים.

סדרת התמונות האחרונה הזו מציגה אינטראקציות של מבנה FSL עם סמני קבוצות דם. התמונה הראשונה היא של ציטי GLI של תאים אדומים אנושיים המצופים בריכוז של 500 מיקרוגרם למיליליטר של FSLG שנבדק כנגד דילול של סרום אנושי. תאים אדומים אנושיים אינם מגיבים באופן טבעי עם אנטיגן XENA GALI אנטיגן.

ככזה, ניתן להשתמש בציטים כדי לכמת את רמות הנוגדנים בסרום. בדוגמה זו, נקבע שלמטופל יש טיטר אנטיגה של 1 עד 32 על ידי יצירת ציטים עם רמות יורדות של FSL. בדומה ליצירת טיטר אנטיגן, ניתן לקבוע רמת אנטיגן אופטימלית לגילוי נוגדנים, ניתן ליצור תאים כדי לתת תוצאה חיובית רק כאשר רמת הנוגדנים עולה על טיטר ספציפי.

רמת האנטיגן FSL הנדרשת כדי לתת תוצאה חיובית תלויה באיכות וברמת הנוגדנים שזוהו. בדרך כלל עבור אנטיגנים פחמימות, תמיסת FSL של 100 מיקרוגרם למיליליטר תביא לתגובה חיובית חזקה. תאים אדומים מקבוצה אנושית O ששונו כך שיהיו להם רמה מסוימת של אנטיגן או מה שנקרא סטנדרטי.

ציטים משמשים לכימות מדויק וניתן לשחזור של אנטיה בסרום אנושי. בדוגמה זו, הציטים הוכנו מתאי הדם האדומים של התורם עצמו ורמת האנטיה בסרום ה-O שנבדק נמצאה כ-1 עד 32. מוצג כאן בצינור השישי של קבוצת הדם A ו-B אנטיגנים שהוכנסו בו זמנית לקבוצה אחת O דגימת תאים אדומים שימשו ליצירת ציטים של שבוע, B.

ניתן להשתמש בציטים אלה למטרות בקרת איכות VO. הניתוח של ציט שבוע B שנוסח במיוחד שנבדק כנגד ריאגנטים אנטיה ואנטי B נותן את התגובות החלשות הצפויות כפי שמוצג באיור זה עם התגובות המתרחשות באזור התחתון האמצעי של הצינורות. טכניקה פשוטה זו יכולה להיעשות תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.