FSL בונה: שיטה פשוטה שינוי Cell / Virion משטחים עם מגוון רחב של סמנים ביולוגיים מבלי להשפיע ליכולת הקיום שלהם

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לסמן באופן בטוח ומהיר את פני השטח של תאים חיים או S באמצעות מבנים ביו-אקטיביים. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תמיסת מקשר תפקודי, ליפיד או מבנה FSL. לאחר מכן, חלק שווה מתמיסת המבנה מעורבב עם חלק שווה של תמיסת התאים או ה-VIRs.

כשלב שלישי, התערובת מדגירת למשך 60 דקות ב-37 degrees Celsius. השלב הסופי הוא שטיפת התאים או הציטים המעובדים, או ה-VIRs המעובדים, ושימוש בהם בניסויים כרגיל. לבסוף, ניתן להדגים תאים חיים שעברו שינוי פני שטח או S באמצעות כל טכניקות הניתוח הניסוייות השגרתיות, כולל פלואו Cytometry, מיקרוסקופיה ואגלוטינציה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון סימון קוולנטי, הוא שהיא מהירה, חסונה, גמישה ואינה משפיעה על חיות התא או ה-Varian שעברו שינוי. כדי להכין תמיסת מומס של מבנה ה-FSL, ראשית, הוסף 1 mL של מדלל לבקבוק המוצר כדי להמיס מחדש את מוצר ה-FSL היבש, ובכך ליצור תמיסת מומס בריכוז של 1 mg/mL. בצע סוניקציה לבקבוק למשך 30 שניות, חלק את תמיסת המומס למכלים סטריליים של 100 µL, ואחסן את המכלים בטמפרטורה של 2°C עד 8°C למשך עד שבוע אחד.

כדי להכין תמיסות עבודה של מבנה FSL להחדרה רגע לפני השימוש, בצעו סוניקציה שוב לתמיסה למשך 30 שניות כדי להומוגניזציה של תאים שאינם תקינים, ולאחר מכן דללו את מבנה ה-FSL ואת הבאפר לריכוז הנדרש. שמרו את תמיסת העבודה בטמפרטורה של 2 עד 8 °C למשך עד שבוע. לאחר השעיה (resuspension) במצע נטול ליפידים או ב-PBS, סבבו את התאים בצנטריפוגה עבור מודפיקציית FSL ללא ליפידים לא קשורים. לאחר מכן, ארזו את התאים ב-100 µL של מדלל; שטפו את התאים עבור הביקורות תחת אותם תנאים ל-100 µL של תאים לא מודפקים.

במידת הצורך, הוסיפו 100 µL של דילול מתאים של תמיסת FSL. במקביל, צרו בקרים שליליים עם תמיסות FSL לא קשורות ו/או PBS. לאחר מכן, דגרו את כל תתי-אוכלוסיות התאים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C לאחר הדגירה.

שטפו את כל התאים פעמיים במצע ללא ליפידים או ב-PBS כדי להסיר מבני FSL חופשיים, והכינו תגובה מתאימה במצע ללא ליפידים. לאחר השלמת תהליך המודיפיקציה של ה-FSL, ניתן לאחסן את התאים בטמפרטורה של ארבע עד שמונה מעלות צלזיוס. מבני FSL מורכבים משלושה רכיבים עיקריים: הראש התפקודי או F, שיכול להיות מגוון של קבוצות בעלות תפקוד ביולוגי.

הספייסר RS תוכנן כדי להוביל לריווח של הראש הפונקציונלי מהממברנה במטרה לשפר את הפיזור במים ולהיות לא ריאקטיבי עם סרום אנושי והליפיד DAL או L, מה שמאפשר למבנה להשתלב באופן ספונטני במשטחים ארבע. קבוצות FSL מייצגות מוצגות בחמש התמונות הבאות. עוברים של עכברים חיים סומנו ישירות באמצעות FSL fluorescein למשך שעותיים ב-37 °C בתוך מצע תרבית תאים ללא סרום, נשטפו ולאחר מכן נבחנו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה.

בתמונה ראשונה זו ניתן לראות עובר בשלב שני תאים עם שיקוף (mirroring), נטול zop palita. הצביעה העזה במרכז העובר מייצגת צביעה קלאסית של הגוף הקוטבי. בשתי התמונות הבאות מוצגים עוברי שיקוף בשלב ארבעה תאים ושמונה תאים, נטולי zop palita, המראים צביעה דהויה של התאים שנמצאים מחוץ למיקוד (focus) של המיקרוסקופ.

תמונה שלוול פאליטה (zop palita) חופשי של עובר בשלב 16 תאים המראה שיקוף מוצגת בתמונה אחרונה זו של עוברים חיים עם שיקוף המסומנים ב-FSL fluorescein. עוברים שלמים בשלב הבלסטולה עם שיקוף בני ימים ארבעה עד חמישה, כאשר הן העובר והן ה-zop LUCITA מסומנים, מוצגים בסדרת התמונות הבאה. סימון FSL fluorescein של דגי זברה מוצג כאן. תמונה ראשונה זו היא של מיקרו-אנגיוגרפיה של לרבה של דג זברה 52 שעות לאחר ההפריה, לה הוזרק FSL fluorescein ישירות למחזור הדם.

ניתן לצפות כאן בצביעה של מערכת כלי הדם של דג הזברה. תאי כליה של דג זברה (ZK cytes) או תאי רקמה הטרוגניים של כליה של דג זברה, שסומנו ב-FSL fluorescein, הוכנו exvivo והוזרקו באמצעות מיקרו-הזרקה למחזור הדם של דג זברה רקפן 52 שעות לאחר ההפריה. תצפיות in vivo של ה-ZK cytes בוצעו שעתיים לאחר ההזרקה באמצעות דימות של מערכת כלי הדם תחת פלואורסצנציה במיקרוסקופיה של צילום רצף (time-lapse). מוצג כאן פריים בודד מהסרטון, שבו תאים גדולים הנעים לאט או תאים ללא תנועה מסומנים בחצים כתומים, ותאים הנעים במהירות, שנראים מטושטשים עקב תנועתם, מסומנים בחצים ירוקים. בתמונה זו מוצג סימון ב-FSL fluorescein באמצעות ספיגה פומית של המבנה, שהושגה על ידי טבילת עיברי דג זברה במצע המכיל FSL fluorescein למשך עד חמישה ימים.

מיקרוסקופיית שדה בהיר של דגי הזברה המטופלים ב-FSL fluorescein משמאל תואמת לתמונה הפלואורסצנטית הסמוכה מימין. הפלואורסצנציה התמקדה בעיקר בדרכי העיכול. לא נצפתה צביעה בעוברים של קבוצת הביקורת שלא טופלו המוצגים כאן.

כאן מוצג נגיף הסטומטיס וסיקולרי (vesicular stomatitis virus) או VSV שסומן ישירות עם 10 µg/mL של פלואורסצאין FSL למשך שעתיים ב-37 °C, ולאחריו קיבוע ב-4% פאראפורמאלדהיד, ולאחר מכן ניתוח באמצעות סריקת FAST המראה כי לא נדרח טיהור של חלקיקי ה-VSV לאחר סימון ה-FSL. היסטוגרמה זו מראה תאי אשכים של חזיר שהודבקו בנגיפי שפעת אנושית H1N1 מזן Puerto Rico 8 19 34 שסומנו בפלואורסצאין FSL.

תאים לא מזוהרים שאינם נגועים מיוצגים על ידי הקו השחור, בעוד שהיתוך של נגיף H1N1 עם תאי חזיר, שהביא לפלואורסצנציה, מסומן על ידי הקו האדום. בסדרה הבאה של תמונות, התאים סומנו תחילה ב-FSL biotin למשך שעה אחת ב-37 °C, לאחר מכן נשטפו והגיבו עם avadon המסומן ב-Fluor 4, ואז נשטפו ועברו הרכבה רטובה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. התמונה הראשונה מציגה תמונת קונפוקלית מורכבת של בלאסטוציסטה של עובר עכבר, ואיור זה מציג חתך קונפוקלי מרכזי של העובר מהתמונה הקודמת.

להלן תאי זרע אנושיים חיים וניידים. הטשטוש מופיע כתוצאה מתנועתם. תמונה נ Representative ברורה יותר של תאי זרע אנושיים שקיבוע ב-4% Paraformaldehyde לאחר ההחדרה ניתן לראות בדמות זו כאן.

תאי דם אדומים של בני אדם המסומנים בביוטין FSL מוצגים עם קיבוע ב-4%paraform aldehyde; הקיבוע אינו משפיע על סימון ה-FSL כפי שמוצג בשתי הדמויות הבאות. כאן, ניתן להבחין בתאי קרצינומה של רירית הרחם אנושית מסוג RL 95 שקובעו ב-4%parmal. לעומת זאת, בתמונה זו, תאי הקרצינומה של רירית הרחם האנושית RL 95 אינם מקובעים. לא נצפו הבדלים ממשיים בסימון בין שתי התמונות, עם או בלי קיבוע.

כאן מוצגים משמאל RBC cytes מסומני FSL biotin שנצפו בדגימת דם שנלקחה שעתיים לאחר עירוי תוך-ורידי של התאים; מימין, התאים נבחנו תחת מיקרוסקופיה של אור, ואותו שדה תאים נבחנו תחת פלואורסצנציה, כאשר ניתן לזהות את שני ה-cytes הנוכחים בצבע ירוק. חישוב היחס בין ה-cytes לתאים שאינם מסומנים יכול לשמש כאינדיקטור להישרדות. תמונת התא האחרונה עם סימון FSL biotin מראה biotin cytes חיים של אנדומטריום אנושי שחזותם הועגבה באמצעות קישור לחרוזי abated.

סדרה זו של תמונות מציגה אינטראקציות של מבנה FSL עם סממנים של Gruppen דם. התמונה הראשונה מציגה תאי GLI אדומים של בני אדם המצופים בריכוז של 500 microgram per milliliter של FSLG שנבדקו מול דילולים של סרום אנושי. תאים אדומים אנושיים אינם מגיבים באופן טבעי לאנטיגן Xena GALI.

כך, ניתן להשתמש ב-cytes כדי לכמת את רמות הנוגדנים בסרום. בדוגמה זו, נקבע כי למטופל יש תיתר נוגדנים (antigen titer) של 1 ל-32, זאת על ידי יצירת cytes עם רמות FSL יורדות. בדומה לקביעת תיתר נוגדנים, ניתן לקבוע את רמת האנטיגן האופטימלית לזיהוי נוגדנים, וניתן ליצור תאים שיתנו תוצאה חיובית רק כאשר רמת הנוגדנים עולה על תיתר ספציפי.

רמת האנטיגן ב-FSL הנדרשת לקבלת תוצאה חיובית תלויה באיכות וברמה של הנוגדן המזוהה. בדרך כלל, עבור אנטיגנים פחמימתיים, תמיסת FSL בריכוז של 100 micrograms per milliliter תביא לתגובה חיובית חזקה. תאי דם אדומים אנושיים מקבוצת O שעברו שינוי כדי להגיע לרמה ספציפית של אנטיגן, או מה שמכונה תאים סטנדרטיים.

Cytes משמשים לכימות מדויק וניתן לשחזור של antia בסרום אנושי. בדוגמה זו, ה-cytes הוכנו מתאי הדם האדומים של התורם, ורמת ה-antia בסרום של קבוצת דם O שנבדק נמצאה להיות אחת ל-32. מוצג כאן במבחנה השישית, שבה אנטיגנים של קבוצות דם A ו-B שהוכנסו בו-זמנית לדגימה אחת של תאי דם אדומים מקבוצת דם O, כדי ליצור cytes מסוג week A, week B.

ניתן להשתמש בתאים אלו למטרות בקרת איכות של VO. ניתוח של תאי "שבוע A" ו"שבוע B" שנוסחו באופן ספציפי, שנבדקו מול ריאגנטים של anti-A ו-anti-B, מראה את התגובות החלשות המצופות כפי שמוצג בדמות זו, כאשר התגובות מתרחשות באזור התחתון המרכזי של המבחנות. ניתן לבצע טכניקה פשוטה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.