זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות glycosylation ספציפי אנדו ו exoglycosidases
26 בדצמבר 2011
שימוש glycosidases ספציפי להסיר סוכרים מן גליקופרוטאינים ואחריו SDS-PAGE היא שיטה ערך כדי לזהות שינויים glycan על דגימות חלבון היא בחירה טובה עבור מחקרים glycobiology הראשונית. השינויים הבאים deglycosylation ניתן לאתר כמו משמרות ניידות ג'ל או מכתים עם ריאגנטים רגיש glycan.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להדגים את השימוש ב-glycosate עבור דגליקוזילציה אנזימטית ואנליזה של glycosylation מסוג n ו-O בחלבון גליקופרוטאין מודלי. דבר זה מושג על ידי טיפול בגליקופרוטאין באמצעות PGA's F או באמצעות תערובת לדגליקוזילציה של חלבונים. בנוסף, תערובת הדגליקוזילציה של החלבונים הועשרה בתערובת של exo glyco ass נוספים, המסייעים לעיתים בהסרה של סוכרים שאלמלא כן היו עמידים.
אנו ממחישים שיטה זו באמצעות גליקופרוטאין מודל, הורמוני גונדוטרופין כוריוני אנושי רקומביננטי בטא (recombinant human chorionic gonadotropin beta), או HCG beta; בשלב הבא נבצע SDS page, ולאחריו צביעה ב-Kumasi blue ושיטת צביעה ספציפית לסוכרים. Pro Q Emerald 300 משמשים לצורך ניתוח ה-D glycosylated. התוצאות המתקבלות מדגימות HCG beta ומראות כי HCG beta עובר גליקוזילציה באופן הטרוגני ומכיל מספר גליקו-צורות (glyco forms), בהתבסס על ההבדלים בנדידת החלבון עם ובלי טיפול ב-glycosate ועל העידוד המופחת בצביעת ProQ ככל שהגליקנים מוסרים באופן הדרגתי.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אנליזת ספקטרומטריית מסות, הוא פשטותה, השימוש בציוד מעבדה נפוץ והתאמתה עבור ביולוגים של פחמימות (glyco biologists) מתחילים. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הגליקביולוגיה, כגון האם החלבון שלי גליקוזילated. כדי להתחיל בתהליך דגליקוזילציה אנזימטית, הפשיר את הבאפ :',ים המסופקים בערכת דגליקוזילציה של חלבונים.
ערבבו את המבחנות היטב ושמרו אותן בטמפרטורת החדר. הניחו את הבקבוקונים המכילים את האנזימים על קרח, המיסו את תכולת הבקבוקון של HCG beta ב-600 µL של מים מזוקקים ושמרו על קרח. לאחר הכנת 1 mL של באפר one XG seven על ידי דילול תמיסת המקור 10x במים מזוקקים, השתמשו ב-25 µL כדי לדלל 0.5 µL של PGA's f.
הכינו את תערובת ה-exo glycosate על ידי שילוב של שני מיקרוליטרים מכל אחד מארבעת ה-exo glyco diseases. לאחר מכן, הוסיפו HCG beta ו-10 x glycoprotein denaturing buffer לשבעה מבחנות PCR ממוספרות כפי שצוין בפרוטוקול הכתוב, סגרו את המבחנות והערבבו בעדינות. דנטורו את החלבונים בתרמוסייקラー על ידי דגירה למשך 10 דקות ב-94 degrees Celsius, ולאחר מכן השהייה ב-4 degrees Celsius. לאחר הוצאת המבחנות מהתרמוסייקラー, סובבו אותן בצנטריפוגה כדי להסיר עיבוי נראה. לכל מבחנת תגובה, הוסיפו את שאר הרכיבים לפי הפרוטוקול הכתוב. סגרו את מבחנות ה-PCR באמצעות מכסים חדשים.
לאחר מכן, ערבבו את המבחנות על ידי הנקשה עדינה ארבע פעמים לאחר ספינטדאון (spinning down) של התוכן, הניחו את המבחנות בטרמוסייקלר והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע שעות. לאחר מכן, קררו את הדגימות ל-4 °C. להכנת SDS page, הכינו תמיסת טעינה (loading buffer) של SDS מחזרת בריכוז 3x טרי.
בעזרת DTT, הוסיפו 12.5 µL של תמיסת טעינה מחזרת SDS בריכוז three x לכל דגימה, סגרו את הפחעות עם מכסות חדשות והקישו עליהן בעדינות כדי לערבב. דגרו את הפחעות בטרמוסייקלר בטמפרטורה של 94 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן קררו ל-4 °C. לאחר הדגירה, טענו 30 µL מכל דגימה ו-10 µL של סמן חלבון לג'ל tri glycine בריכוז 10% עד 20%. שמרו את שאר תכולת כל דגימה.
הריצו את הג'ל ב-130 volts עד שחזית ה-D תגיע לקרוב לתחתית הג'ל. עם סיום הרצת הג'ל, הוציאו את הג'ל מהתבנית והניחו אותו בקופסת פלסטיק קטנה עם כמות מספיקה של צבע kumasi blue כדי לכסות את הג'ל. צבעו את הג'ל למשך שעה אחת תוך כדי ערבוב עדין לאחר שצבע הג'ל הגיע לתוצאה הרצויה.
שטפו שלוש פעמים למשך 30 דקות. ב-50 מיליליטר של תמיסת detain, רשמו את התמונות באמצעות טרנסלומינטור של אור לבן או סורק. לחלופין, ניתן לייבש את הג'ל בין דפי סלופן.
במסגרת אחת, הרץ את השאריות מכל דגימה ואת סממן חלבון על ג'ל Tri glycine בריכוז של 10% עד 20% בזמן שהג'ל רץ. המס את ריאגנט ProQ emerald באמצעות DMF והכן את תמיסות המלאי של הקיבוע, השטיפה והחמצון עבור הצביעה, בהתאם למדריך המוצר המצורף לערכה. עם השלמת האלקטרופורזה, הוצא את הג'ל מהתבנית והנח אותו בקופסה מפלסטיק.
קבעו את הג'ל על ידי הוספת 100 milliliters של תמיסת הקיבוע שהוכנה. השאירו את הג'ל למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם ערבול עדין. שטפו את הג'ל עם 100 milliliters של תמיסת השטיפה שהוכנה למשך 10 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבול עדין, וחזרו על השטיפה פעם שנייה עם תמיסת שטיפה רעננה.
בשלב הבא, חמצנו את הפחמימות על ידי דגירה של הג'ל תחת ערבוב עדין למשך 30 דקות ב-25 milliliters של תמיסת החמצון שהוכנה; לאחר הדגירה, בצעו שתי שטיפות נוספות בזמן שג'ל נשטף. הכינו צבע ProQ emerald 300 טרי על ידי הוספת 500 microliters של תמיסת הריאגנט ProQ Emerald 300 ל-25 milliliters של באפר צביעה המסופק בערכה. צבעו את הג'ל על ידי דגירה בצבע שהוכנה בתנאי חוש עם ערבוב עדין למשך 90 עד 120 דקות לאחר צביעת הג'ל.
חזרו על שני שלבי השטיפה כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, רשמו את התמונות באמצעות מאיר חוזר UV באורך גל של 300 nanometers. כשלב סופי, השוו את התמונות של הג'ל שנצבע ב-kumasi לג'ל שנצבע ב-ProQ emerald.
ניתן לראות את השינויים בנידוד החלבון לאחר דגליקוזילציה אנזימטית כאשר משווים את דגימת הביקורת לטיפול F של ה-PGA. להסרת n-גליקנים ולטיפול בתערובת דגליקוזילציה להסרת n ו-O גליקנים, לא נראה חיסור נוסף בגודל לאחר עיכול עם גליקוזידאז נוסף. מלבד שינוי במסה, הפסים הופכים חדים יותר ככל שהגליקנים מוסרים.
פס שרץ מתחת לסמן של 17 kilodalton מייצג ככל הנראה את הפוליפפטיד HCG beta לאחר הסרה מלאה של פחמימות (deglycosylation). נתיבים חמישה עד שבעה מראים את הפסים המתאימים ל-Glyco. פסים אחרים עשויים לנבוע מהסרה חלקית של פחמימות או מחלבונים לא מזוהים מרובים שנמצאים בדגימת ה-HCG beta.
ריאגנט הירוק הزمרלדי (emerald green) מחמצן וצובע את כל הגליקנים הנוכחים במולקולת חלבון. לפיכך, עוצמת האות פוחתת ככל ש-HCG beta עובר ד-גליקוזילציה אנזימטית. האות השארי בנתיבים שלושה וארבע מעיד על נוכחותם של מוטיבי גליקן, העמידים לאנזימים שנעשה בהם שימוש.
הגליקוזאט הנוסף נמצא בנתיב ארבע. הסר מספר שאריות סוכר נוספות. נדידת החלבון נשארת זהה, אך ניתן להבחין בירידה קלה בעוצמת הצביעה.
שיירי סוכר עמידים לא היו נוכחים בכל מיני החלבונים. חלק מהפסים לא זוהו על ידי emerald Green, מה שמעיד על כך שהם עברו דגליקוזילציה נרחבת. נתונים נוספים תומכים במסקנה ש-HCG beta עוברת גליקוזילציה הטרוגנית. הפס התחתון בנתיב שני הוא חלש בתמונת ה-emerald green.
בעוד שהפס העליון במסלול שני בהיר, מה שמעיד על כך שקבוצות GLYCAN רבות עדיין נוכחות, נתונים אלו תומכים במסקנה ש-HCG beta רקומביננטי שהובע בתאי עכבר מכיל מספר צורות גליקוזילציה בשל ההטרוגניות האינהרנטית של הגליקוזילציה. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ספקטרומטריית מסות כדי לענות על שאלות נוספות כגון: מהו שיעור התפוסה? מהו היקף הגליקוזילציה, או מהו המבנה העדין של הגליקנים?
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש ב-glycosylate לצורך דה-גליקוזילציה אנזימטית וניתוח של NNO Linked Glycans על גליקופרוטאינים. בחירת שיטת הגילוי עשויה להיות מאתגרת, כיוון שצביעת חלבונים היא יעילה רק אם תהליך הדה-גליקוזילציה מביא לשינוי משמעותי במסה המולקולרית עבור חלבונים אחרים.
ראינו נדירות חריגה לאחר הסרת הגליקוזילציה ומצאנו שכל שינוי בנידירות מהווה ראיה לכך שהחלבון עבר דה-גליקוזילציה.
סקירה כללית
מחקר זה מדגים את השימוש בגליקוסידזים עבור דגליקוזיליזציה אנזימטית של גליקופרוטאינים, עם התמקדות ב-human chorionic gonadotropin beta (HCG beta) רקומביננטי. השיטה מאפשרת ניתוח של גליקוזיליזציה מסוג N ו-O באמצעות SDS-PAGE וטכניקות צביעה ספציפיות.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- גליקוביולוגיה
- ניתוח חלבונים
- ביוכימיה
רקע
- גליקוזילציה היא מודיפיקציה פוסט-טרנסלציונית קריטית המשפיעה על תפקוד חלבונים.
- טכניקות דגליקוזילציה הן חיוניות לחקר מודיפיקציות של גליקנים.
- SDS-PAGE היא שיטה נפוצה לניתוח ניידות חלבונים.
- שיטות צביעה ספציפיות יכולות להדגיש את נוכחותם של גליקנים.
מטרת המחקר
- להדגים את תהליך הדגליקוזילציה האנזימטית באמצעות גליקוזידזות.
- לנתח מודיפיקציות של גליקנים בחלבון גליקוזילציה מודלי.
- לספק שיטה פשוטה עבור חוקרים מתחילים בתחום הגליקביולוגיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טיפול אנזימטי של HCG beta באמצעות גליקוסידאזות ספציפיות.
- SDS-PAGE להפרדת חלבונים על בסיס משקל מולקולרי.
- צביעת Kumasi blue להדמיה כללית של חלבונים.
- צביעת ProQ Emerald 300 לזיהוי ספציפי של גליקנים.
תוצאות עיקריות
- HCG beta הפגין דפוסי גליקוזילציה הטרוגניים.
- נצפו שינויים בניוד של החלבון לאחר הסרת הגליקנים (deglycosylation).
- עוצמת האות פחתה עם הסרת הגליקנים.
- השוואה בין הגלים הצבועים חשפה הבדלים בנוכחות הגליקנים.
מסקנות
- השיטה יעילה לניתוח מודיפיקציות של גליקנים על חלבונים.
- היא מספקת חלופה פשוטה לטכניקות מורכבות יותר, כגון ספקטרומטריה של מסות.
- התוצאות עשויות לסייע במתן תשובה לשאלות יסודיות בביולוגיה של גליקנים (גליקוביולוגיה).
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דה-גליקוזילציה אנזימטית באמצעות גליקוזידזות מספקת שיטה מהירה ונגישה להערכת ההטרוגניות של גליקופרוטאינים, התומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים על ידי הבהרת מצב המודיפיקציות לאחר תרגום. גישה זו מאפשרת לצוותי מו"פ בביו-פארמה להעריך השפעות המתווכות על ידי גליקנים על יציבות חלבונים, תעתוע ותפקוד, ללא צורך במכשור ייעודי. השיטה תומכת בהורדת סיכונים מכניסטית בתהליכי גילוי על ידי קישור דפוסי גליקנים לתוצאות תפקודיות במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרות
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של הטרוגניות הגליקוזילציה כדי להעריך את השפעתה על תפקוד החלבון ועל קישור למטרה.
- ערך תפעולי: משתמש בציוד ובריאגנטים סטנדרטיים של מעבדה, מה שמאפשר סריקה מהירה של וריאנטים של גליקופרוטאין.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: יצירת צורות חלבון עם גליקנים מקוצרים לשימוש במבחנים סטנדרטיים הדורשים גליקופורמים מוגדרים.
- ערך תפעולי: הפקת תכשירי חלבון עקביים וניתנים לשחזור המתאימים לפורמטים של סריקה בספיקו גבוה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בניתוח של איזופורמים של גליקופרוטאינים רלוונטיים למחלות על ידי הפרדה של מיקרו-הטרוגניות המתווכת על ידי גליקנים.
- ערך תפעולי: מקל על השוואה בין מנות של גליקופרוטאינים רקומביננטיים כדי להבטיח עקביות במחקרים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי המולקולה המובילה (lead identification), כאשר אפיון הגליקופרוטאין מספק מידע על קשרי מבנה-תפקוד והערכות של יכולת פיתוח (developability).
- ביולוגיה של הגילוי: מבהירה את תפקידם של גליקנים מקושרי N ו-O בקיפול חלבונים, ביציבות ובפעילות תאית.
- סריקה: מאפשרת הכנה של בקרות ללא גליקנים (deglycosylated) עבור בדיקות אנזימטיות או קישור תלוי גליקן.
- אנליטיקה: מספקת קריאות איכותניות וחצי-כמותיות באמצעות הזזות (shifts) בגל ועוצמת צביעה ספציפית לגליקנים.
- מחקר תרגומי: מסייעת להתאמה של פרופילי גליקופרוטאין רקומביננטיים עם איזופורמים טבעיים שנצפו בדגימות קליניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מייצגת יכולת מודולרית וניתנת להרחבה, הישימה על יעדי גליקופרוטאין מרובים בפורטפוליו.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי בידוד תרומת הגליקנים להתנהגות החלבון.
- ערך תפעולי: דורש רק אינקובטורים סטנדרטיים, צנטריפוגות ומערכות אלקטרופורזה של ג'ל.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי חשיפת סיכונים הקשורים לגליקנים ביחס ליכולת הייצור ולפרמטריקה של התרופה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון של מועמדים גליקופרוטאיניים על בסיס הניתנות לטיפול בגליקוזילציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בגליקופרוטאינים ובאופטימיזציה של תגובות אנזימטיות.
- תלוי בגישה לאנזימי גליקוסידאז ספציפיים (למשל, PNGase F, O-Glycosidase, תערובות exoglycosidase).
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי דנטורציה, אינקובציה וצביעה בין צוותים שונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מבני גליקאן לא סטנדרטיים או מערכות ביטוי אתיפיות של גליקופרוטאינים.
- מוגבל לאנליזה איכותית או חצי-כמותית; נדרשות שיטות משלימות (למשל, מספקטרומטריה) עבור ריצוף מפורט של גליקנים.
