Name: זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות glycosylation ספציפי אנדו ו exoglycosidases (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: למדו שיטת דיגליקוזילציה אנזימטית של חלבונים באמצעות גליקוזידאזים ספציפיים לניתוח גליקנים מקושרים מסוג N ו-O בחלבון HCG beta. השיטה משלבת SDS-PAGE וצביעה ספציפית לגליקנים באמצעות ProQ Emerald 300.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

דון מסרק

<html> 1. אנזימתי deglycosylation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש צינורות PCR כדי להקטין את איבוד המים בשל התאדות. תווית אחת מערכת של צינורות 1-7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה חיץ G7 10X, 10X החיץ גליקופרוטאין denaturing, ושל 10% NP-40 ו לטפוח בעדינות את הצינורות כדי לערבב את תוכנו. שמור בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האנזים בקבוקונים המכילים על הקרח. נסו למזער את ההפשרה / ההקפאה מחזורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את תכולת הבקבוקון hCGβ (150 מיקרוגרם) ב 600 μl של DH 2 O ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מ&quot;ל של חיץ 1X G7 על ידי דילול המניות 10X ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל 0.5 μl של PNGase F במאגר μl 25 G7 1X ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת exoglycosidase (EG לערבב) על ידי שילוב של 2 μl כל α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, β1 Galactosidase-3, ו α1-3, 6 Galactosidase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת צינורות PCR כמצוין: </li></ol>AK &quot;&gt; <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Tube / מדגם # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> hCGβ (0.25mg/ml) </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> גליקופרוטאין 10X Denaturing הצפת </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td><td> 1μl </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td><td> 9μl </td></tr></tbody></table><ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שווי הצינורות, מערבבים בעדינות ומניחיםthermocycler, לסגור את המכסה לפגל את החלבונים על ידי דוגרים 10 דקות 94 ° C, ואחריו להחזיק 4 מעלות צלזיוס (באמצעות צינורות PCR ב thermocycler מאוד ומונע אידוי בדגימות נפח קטן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורות מן thermocycler ו צנטריפוגות כדי להסיר כל התעבות גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ריאגנטים הבאים כמצוין: </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לדוגמה # </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> 10% NP-40 </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> מאגר ה-G7 10X </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5μl </td><td> 2.5 &amp; mu; L </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> PNGase F 1:50 דיל. </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Deglycosylation Mix </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> לערבב EG </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td><td> - </td><td> - </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> DH 2 O </td><td> 10μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td><td> 8μl </td><td> 8μl </td><td> 6μl </td></tr><tr><td> התגובה סך vol. </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l &lt;/ Td&gt; <td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td><td> 25 μ l </td></tr></tbody></table><ol start="12" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הצינורות באמצעות PCR כובעים חדשים (להשליך את אלה המשמשים מאז הם לא מתאימים כמו שצריך אחרי מחזור אחד הדגירה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות את הצינורות על ידי הקשה 4 פעמים ואז לסובב את התוכן כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינורות thermocycler ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות לאחר מכן לקרר את דגימות עד 4 ° C. </li></ol> 2. SDS-PAGE של דגימות deglycosylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 130 μl טרי חיץ 3X הפחתת SDS טוען ידי הוספת 4 μl של DTT 1.25M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 12.5 μl של החיץ מוכן 3X SDS הפחתת העמסה לטעום כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הצינורות עם כובעים חדשים לטפוח בעדינות את הצינורות כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינורות thermocycler על 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן לצנן עד 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 30 μl של המדגם כל 10 μl של הסמן חלבון על ג&#39;ל טריס-גליצין 10-20%. שמור את שארית המדגם עבור חלק 3.1. טען 10μl של דה מרקר ColorPlus חלבון Prestained. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electrophorese את הג&#39;ל על 130 וולט בטמפרטורת החדר עד הכניסה לצבוע קרוב לתחתית הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ג&#39;ל סיימה ריצה, להסיר את הג&#39;ל של השחקנים ולמקם אותו בתוך קופסת פלסטיק קטנה עם מספיק Coomasie כתם כחול על מנת לכסות את הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם ג&#39;ל למשך שעה 1 עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הג&#39;ל שלוש פעמים במשך 30 דקות ב 50 מ&quot;ל של תמיסת destain. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את התמונות באמצעות transilluminator אור לבן או סורק. לחלופין, ג&#39;ל יכול להיות מיובש בין דפי צלופן בתוך מסגרת. </li></ol> 3. Pro-Q אמרלד 300 לגילוי של חלבונים glycosylated ב SDS-PAGE ג&#39;לים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל הג&#39;ל ב 2.1), עומס יתר של הדגימות על הג&#39;ל טריס-גליצין 10-20%. טען 10 &amp; mu; L של דה מרקר חלבון ColorPlus Prestained. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הג&#39;ל פועל לפרק את מגיב Pro-Q אמרלד עם DMF ולהכין את תקן מלאי, שטפי ואת חמצון פתרונות אמרלד Pro-Q 300 כתם הבאים במדריך מוצר המסופק עם הערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אלקטרופורזה תושלם, להסיר את הג&#39;ל מתוך יצוק למקם אותו בתוך קופסת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הג&#39;ל על ידי הוספת 100 מ&quot;ל של הפתרון לתקן ולהשאיר אותו לילה בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הג&#39;ל עם 100 מ&quot;ל של הפתרון לשטוף עבור 10 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר בהתרגשות גוי. חזור על לשטוף עם פתרון לשטוף טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמצן את הפחמימות על ידי דוגרים את הג&#39;ל עם תסיסה עדינה במשך 30 דקות ב 25 מ&quot;ל של חמצון פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הג&#39;ל כמתואר בשלב 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד הוא ג&#39;ל כביסה להכין טרי Pro-Q אמרלד 300 כתם על ידי הוספת 500 μl של הפתרון Pro-Q 300 מגיב אמרלד מומס צעד 3.2 ל 25 מ&quot;ל שלמכתים חיץ המסופק בערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם ג&#39;ל על ידי הוספת 25 מ&quot;ל של הכתם מוכן בשלב 3.8 ו דוגרים בחושך עם תסיסה עדינה במשך 90 עד 120 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שני השלבים המתוארים לשטוף צעד 3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את התמונות עם transilluminator UV ב 300nm. השתמש בסמן 80 kDa, אשר מסומן עם Pro-Q אמרלד גרין, לחפוף את התמונה UV לתמונה אור לבן של הג&#39;ל המציגה את הסולם prestained. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את התמונות של הג&#39;ל מוכתם Coomasie בשלב 2.10 עם ג&#39;ל האזמרגד Pro-Q מוכתם משלב 3.11. </li></ol> 4. נציג תוצאות השינויים הגירה חלבון לאחר deglycosylation האנזימטית מוצגות באיור 2. השווה את מדגם הביקורת (לוח א &#39;, מסלול 1) עם הטיפול F PNGase (הסרת N-glycans, מסלול 2), מערבבים Deglycosylation (PNGase F; פלוס אנדו ו exoglycosidases להסיר O-glycans, מסלול 3). הפחתה נוספת לאבגודל נתפס לאחר עיכול עם glycosidases נוספים (מסלול 4). מלבד שינוי המוני, להקות להיות חדה כמו glycans יוסרו. הלהקה פועלת תחת סמן 17 kDa (כוכבית) מייצג את (MW: 16 KDA) deglycosylated מלא hCGβ פוליפפטיד. להקות אחרות שאולי נובעות deglycosylation שלם או את החלבונים מזוהה מרובים הנוכחי במדגם hCGβ (ראה מסלול 1). Lanes 5-7 (שולטת) להראות את להקות המתאימים glycosidases. מכתים גליקופרוטאין ידי אמרלד גרין מוצג בלוח זה ב מגיב oxidizes וכתמים כל glycans נוכח מולקולת חלבון. לכן עוצמת האות יורדת ככל hCGβ הוא deglycosylated enzymatically (מסלול 1 לנתיב 4). האות שיורית במסלולים 3 ו -4 להעיד על נוכחות של מוטיבים glycan, אשר עמידים בפני אנזימים בשימוש. Glycosidases נוספים המשמשים במסלול 4 להסיר שאריות כמה סוכר נוסף: ההגירה חלבון זהה, אבלירידה קלה בעוצמה של מכתים ניתן לראות. Moieties סוכר עמיד לא נכחו כל מיני חלבון: כמה להקות לא היו מזוהים על ידי אמרלד גרין (נעדר בתמונה UV, בסוגריים), המציין שהם deglycosylated בהרחבה. נתונים נוספים תומכים למסקנה hCGβ glycosylated הוא הטרוגני. הלהקה נמוך על מסלול 2 (חץ) הוא קלוש על התמונה אמרלד גרין, בעוד הלהקה העליון על מסלול 2 הוא בהיר, המציין כי הרבה קבוצות glycans עדיין קיימות. נתונים אלו מחזקים את המסקנה כי hCGβ רקומביננטי לידי ביטוי בתאים העכבר מכיל glycoforms מספר 9. אלה glycoforms שונים הן בשל ההטרוגניות הטבועה glycosylation שם כמה פוליפפטידים לא מקבלים glycan בכל אתר הסכמה ו / או כמה glycans מורחבות וחלקם אפילו על אותו חלבון לא. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig1.jpg" /> באיור 1.Glycosylation דפוסים אופייניים המופרשים או גליקופרוטאינים על פני קרום התא. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3749/3749fig2.jpg" /> 2. איור SDS-PAGE ג&#39;לים מראה deglycosylation האנזימטית של hCGβ. לוח מראה כתמים כחולים Coomasie תוך לוח B מראה את התוצאות של Pro-Q אמרלד 300 עבור להדמיה של חלבונים glycosylated. מספר דוגמאות: 1, שליטה hCGβ; 2, PNGase F העיכול; 3, מערבבים העיכול Deglycosylation: 4, מערבבים Deglycosylation פלוס עיכול exoglycosidases, דגימות 5-7 הם שולטת מגיב (O-Glyc, O-Glycosidase; GNA, β-N -Acetylglucosaminidase; Fucosidase גל / Fuc, β1-3 Galactosidase, α1-3, 6 Galactosidase ו α1-2; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase; Neu, neuraminidase; PNGase; F PNGase)

<ol><li>Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation%3A+nature%2C+distribution%2C+enzymatic+formation%2C+and+disease+implications+of+glycopeptide+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds.</a> Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).</li>
<li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+in+Cellular+Mechanisms+of+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation in Cellular Mechanisms of Health and Disease.</a> Cell. 126, 855-867 (2006).</li>
<li>Arnold, J. N., Wormald, M. R., Sim, R. B., Rudd, P. M., Dwek, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+glycosylation+on+the+biological+function+and+structure+of+human+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins.</a> Annual Review of Immunology. 25, 21-50 (2007).</li>
<li>Mitra, N., Sinha, S., Ramya, T. N. C., Surolia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+oligosaccharides+as+outfitters+for+glycoprotein+folding%2C+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">N-linked oligosaccharides as outfitters for glycoprotein folding, form and function.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31, 156-163 (2006).</li>
<li>Carlsen, R. B., Bahl, O. P., Swaminathan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chorionic+gonadotropin.+Linear+amino+acid+sequence+of+the+beta+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human chorionic gonadotropin. Linear amino acid sequence of the beta subunit.</a> Journal of Biological Chemistry. 248 (19), 6810-6812 (1973).</li>
<li>Tarentino, A. L., Plummer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deglycosylation+of+Asparagine-linked+Glycans+by+PNGaseF%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Glycoscience+and+Glycotechnology%22%5BJournal%5D)">Deglycosylation of Asparagine-linked Glycans by PNGaseF.</a> Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 5 (23), 163-170 (1993).</li>
<li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-N4-%28N-acetyl-%CE%B2-glucosaminyl%29asparagine+amidase+F+cannot+release+glycans+with+fucose+attached+%CE%B11-3+to+the+asparagine-linked+N-acetylglucosamine+residue%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1-3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199, 647-652 (1991).</li>
<li>Koutsioulis, D., Landry, D., Guthrie, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+endo-%CE%B1-N-acetylgalactosaminidases+with+broader+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Novel endo-α-N-acetylgalactosaminidases with broader substrate specificity.</a> Glycobiology. 18 (10), 799-805 (2008).</li>
<li>Thakur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+glycoforms+of+the+intact+alpha+subunit+of+recombinant+human+chorionic+gonadotropin+by+high-resolution+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Profiling the glycoforms of the intact alpha subunit of recombinant human chorionic gonadotropin by high-resolution capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (2), 8900-8907 (2009).</li>
<li>Park, S., Lee, M. R., Shin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+microarrays+as+powerful+tools+in+studies+of+carbohydrate-mediated+biological+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate microarrays as powerful tools in studies of carbohydrate-mediated biological processes.</a> Chemical Communications. 37, 4389-4399 (2008).</li>
<li>Zachara, N. E., Vosseller, K., Hart, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+proteins+modified+by+O-linked+N-acetylglucosamine%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of proteins modified by O-linked N-acetylglucosamine.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 95, 17-17 (2011).</li>
<li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVarki%2C+A+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. , 2nd Ed, Clod Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
</ol>

המחברים הם מועסקים על ידי ניו אינגלנד Biolabs, המייצר חומרים כימיים רבים המשמשים במאמר זה.

השיטה המתוארת כאן על ידי שימוש deglycosylation האנזימטית SDS-PAGE יכול לספק מידע רב ערך על מצב glycosylation של חלבון של עניין, בעוד glycan ספציפי ריאגנטים להקל על הפרשנות של הנתונים. פרוטוקול זה מיועד המחקרים הראשוניים של glycosylation חלבון זה מתאים במיוחד עבור הפרשה ואת גליקופרוטאינים בממברנה של בתאי יונקים: האנזימים נבחר במקרה הזה יהיה דווקא להסיר את כל N-glycans, ו או N-glycans פלוס ואת סוכרים הנפוצים ביותר הארכת ויוצרים הליבה של O-glycans. Glycosidases יש את היתרון הנוסף של להיות קלה, בהשוואה לשיטות deglycosylation כימיים, תוך שמירה על שלמות עמוד השדרה הן סוכרים וחלבונים. כדי להבהיר את תפוסת (אשר חומצות אמינו הן glycosylated), היקף glycosylation, או על מנת לקבוע את המבנה העדין של glycans, טכניקות מתוחכמות יותר, כגון מ &#39;ספקטרומטריית התחת, כרומטוגרפיה נוזלית או NMR נדרשים. בגלל הפשטות שלו, מספר צעדים בפרוטוקול זה יכול להיות מותאם, להחליף ו / או בשילוב כדי להתאים לצרכים ניסיוניים שונים. עם זאת, על מנת להשיג תוצאות כי ניתן לפרש בבירור חשוב להבין את נקודות החוזק שלו ואת המגבלות. ראשית, סגוליות וטוהר glycosidases הם קריטיים: אנזימים היטב מאופיין רק נבדק להשתחרר פרוטאזות ופעילויות מזהמים אחרים יש להשתמש. למרבה הצער, אין תקן יחידת אנזים הגדרה glycosidases: המשתמש צריך לקבוע את התחליף המתאים על פי מפרט של היצרן. שנית, בחירה זהירה של זיהוי צורך: א) מכתים ריאגנטים חלבון שימושיים רק אם תוצאות deglycosylation בשינוי משמעותי מסה מולקולרית. תוצאה כזו ברורה כפי שמוצג כאן לא מתקבל תמיד. במקרים אחרים, שראינו mi נורמליgration לאחר deglycosylation (רחוק משקל מולקולרי חזה, או אפילו הגירה איטי יותר). תופעה זו אינה מובנת היטב, אך ניתן לומר כי כל שינוי הגירה ראיות כי החלבון כבר deglycosylated. ב) זיהוי סוכר עם נוגדנים מציבה אתגרים ייחודיים הגבלת התחולה שלהם. זה כבר קשה מאוד כדי ליצור כללי אנטי glycan נוגדנים, הם גדלים בדרך כלל נגד יעד glycan מורכבים, אשר מגבילה את השימוש בהם. יתר על כן, מספר חד שבטיים נוגדנים נגד glycan להציג תגובתיות לחצות רצויים 10. ג) לקטינים (חלבונים עם סוכר זיקה מהותית) מתאימים היטב לאיתור סוכר, ובנוסף הם נותנים תובנה על מבנה glycan. עם זאת, לא כולם יש סגוליות צר; רבים מאופיינים באופן חלקי בלבד (כלומר, הם יכלו זיקות לא ידוע). בתור מכתים חיובי תוצאה מספקת לקטינים, אינדיקציה לא הוכחה, נוכחותם של given סוכר. ד) ערכות כימית תיוג (מבוסס על periodate חמצון של סוכרים) הן את שיטת הבחירה להכתים את כל גליקופרוטאינים, ומתאים וכך גם לעקוב deglycosylation. כאשר עיבוד מדגם לא ידוע, זהו תרגול טוב כדי לכלול שולטת גליקופרוטאין. Fetuin הוא N זמינים - ו - O-גליקופרוטאין, גונדוטרופין כוריוני (הן יחידות משנה) היא גם בחירה טובה. שור אלבומין (BSA) יכול לשמש כביקורת שלילית. עם זאת, יש לציין כי חלק לא glycosylated חלבונים להגיב עם מעט אמרלד Pro-Q 300, במיוחד כאשר נעשה שימוש בריכוזים גבוהים. Non-glycosylated סטנדרטים משקל מולקולרי, כגון סמן את החלבון prestained שימוש בפרוטוקול זה, יש את היתרון של הצגת להקות חדה. רק במקרה אחד של החלבונים האלה (80 KDA) תגובתי Pro-Q אמרלד 300. לכן, ייתכן שהמשתמש רוצה להפעיל סולם רגיל גליקופרוטאין במקום, כמו קנדי ​​מ-Cane Invitrogeהערה לבסוף, זיהוי פשוט ג&#39;ל של גליקופרוטאינים nucleocytosolic (אשר שונה עם אחד O-GlcNAc) אפשרי עם שימוש של נוגדנים חד שבטיים, יחד β-N-Acetylglucosaminidase שליטה סגוליות 11. התיאור של טכניקה זו היא מעבר היקפו של מאמר זה, אבל זה צריך להיות כאמור glycosidases הם כלי שימושי לחקר גליקופרוטאינים אחרים glycoconjugates רבים הנמצאים בתאים. טיפול מקיף של כל הצורות הידועות של glycosylation ניתן למצוא במהדורה השנייה של &quot;יסודות של glycobiology&quot;; מקוון חינם בכתובת מדף הספרים צמח השדה (ID Bookshelf: NBK1908; PMID: 20301239) 12.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> האדם β גונדוטרופין כוריוני </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> C6572 </td><td></td></tr><tr><td> מנורות ה-PCR </td><td> VWR </td><td> 20170-004 </td><td></td></tr><tr><td> PCR Thermocycler </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4359659 </td><td></td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P0704 </td><td> מסופקים עם חוצצי </td></tr><tr><td> Deglycosylation חלבון מערבבים </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P6039 </td><td> מסופקים עם חוצצי </td></tr><tr><td> α-N-Acetylglalactosaminidase </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P0734 </td><td> מסופקים עם חיץ </td></tr><tr><td> α1-2 Fucosidase </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P0724 </td><td> מסופקים עם חיץ </td></tr><tr><td> α1-3, 6 Galactosidase </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P0731 </td><td> מסופקים עם חיץ </td></tr><tr><td> β1-3 Galactosidase </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P0726 </td><td> מסופקים עם חיץ </td></tr><tr><td> מאגר 10X ה-G7 (500 סודיום פוספט mM) </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> --- </td><td> מסופקים עם PNGaseF או Degl Mix </td></tr><tr><td> גליקופרוטאין הצפת 10X Denaturing (5% SDS, 400 מ&quot;מ DTT) </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> --- </td><td> מסופקים עם PNGaseF או Degl Mix </td></tr><tr><td> 10% NP-40 </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> --- </td><td> מסופקים עם PNGaseF או Degl Mix </td></tr><tr><td> 3X SDS טוען חיץ (187.5 mM טריס-HCl pH 6.8, SDS 6%, 30% גליצרול, ברום 0.03%ophenol כחול) </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> B7703 </td><td> מסופקים עם 1.25M DTT </td></tr><tr><td> ColorPlus Prestained מרקר חלבון </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> P7709 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% טריס-גליצין Multigel </td><td> קוזמו ביו ושות </td><td> DCB-414893 </td><td></td></tr><tr><td> אלקטרופורזה קלטת יחידה </td><td> קוזמו ביו ושות </td><td> DCB-303111 </td><td></td></tr><tr><td> Power Supply אלקטרופורזה EPS 301 </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-01 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Q אמרלד 300 גליקופרוטאין כתמים Kit </td><td> Invitrogen </td><td> P-21857 </td><td></td></tr><tr><td> בריליאנט בלו R </td><td> סיגמא אולדריץ&#39; </td><td> B0149 </td><td></td></tr><tr><td> AlphaImager HP System </td><td> תא Biosciences </td><td> 92-13823-00 </td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות glycosylation ספציפי אנדו ו exoglycosidases

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, תוספת של סוכרים קשורים קוולנטית, הוא שינוי חשוב שלאחר translational של חלבונים יכול להשפיע באופן משמעותי על תהליכים כגון הידבקות התא, סחר מולקולרית, אישור, ואת הולכת אותות 1-4. ב אאוקריוטים, את השינויים glycosylation הנפוץ ביותר במסלול הפרשה הן תוספות ב asparagine שאריות הקונצנזוס (N-linked); או סרין או תראונין שאריות (O-linked) (איור 1). ייזום סינתזה של N-glycan נשמרת מאוד אאוקריוטים, בעוד מוצרי קצה יכולים להשתנות במידה רבה בין המינים, רקמות שונות, או חלבונים. Glycans חלקם יישארו ללא שינוי (&quot;גבוה מנוז N-glycans&quot;) או עיבוד נוסף של Golgi (&quot;מורכב N-glycans&quot;). המגוון הגדול נמצא עבור O-glycans, אשר מתחיל עם משקע משותף (GalNAc) N-Acetylgalactosamine בתאים חיים, אך נבדלים אורגניזמים נמוכה 1. אף אוזן גרון &quot;&gt; ניתוח מפורט של glycosylation של חלבונים הוא תחום בפני עצמו ודורש משאבים רבים ומומחיות כדי לבצע כראוי. עם זאת מגוון רחב של אנזימים זמין להסיר סוכרים (glycosidases) מאפשר לקבל מושג כללי על המצב של glycosylation . חלבון במעבדה הגדרה סטנדרטית כאן אנו מדגימים את השימוש glycosidases לניתוח גליקופרוטאין מודל:. רקומביננטי גונדוטרופין כוריוני אנושי בטא (hCGβ), אשר מחזיקה שני N-glycans וארבעה O-glycans 5 הטכניקה פשוטה דורשת רק מכשור וחומרים מתכלים טיפוסי, והוא יכול להתאים בקלות ניתוח של דגימות גליקופרוטאין מרובים. מספר אנזימים יכול לשמש במקביל מחקר גליקופרוטאין. PNGase F הוא מסוגל להסיר כמעט את כל סוגי N-linked glycans 6,7. עבור O-glycans, אין אנזים זמין לדבוק יכול oligosaccharide שלמים מתוך הדואר עמוד השדרה חלבון. במקום זאת, O-glycans הם גזומים ידי exoglycosidases לליבה קצר, אשר לאחר מכן להסיר בקלות על ידי Glycosidase-O. מערבבים Deglycosylation חלבון מכיל PNGase F, O-Glycosidase, neuraminidase (sialidase), β1-4 Galactosidase, ו β-N-Acetylglucosaminidase. הוא משמש בו זמנית להסיר N-glycans וכמה O-glycans 8. לבסוף, מערבבים את Deglycosylation נוספו בתערובת של exoglycosidases אחרים (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, α1-3, 6 Galactosidase ו β1 Galactosidase-3), אשר מסייעים להסיר מונוסכרידים עמידים אחרת זה יכול להיות נוכח בטוח O-glycans. SDS-PAGE/Coomasie הכחול משמש כדי להמחיש הבדלים הגירה חלבון לפני ואחרי הטיפול glycosidase. בנוסף, סוכר ספציפי שיטה מכתים, ProQ אמרלד-300, מראה אות פחתה כפי glycans הם succeהוסר ssively. פרוטוקול זה מיועד לניתוח של כמויות קטנות של גליקופרוטאין (0.5-2 מיקרוגרם), למרות deglycosylation האנזימטית וניתן לשנותם עד כדי להכיל כמויות גדולות יותר של חלבון לפי הצורך.

שימוש glycosidases ספציפי להסיר סוכרים מן גליקופרוטאינים ואחריו SDS-PAGE היא שיטה ערך כדי לזהות שינויים glycan על דגימות חלבון היא בחירה טובה עבור מחקרים glycobiology הראשונית. השינויים הבאים deglycosylation ניתן לאתר כמו משמרות ניידות ג&#39;ל או מכתים עם ריאגנטים רגיש glycan.

גליקוזילציה, הוספת סוכרים הקשורים באופן קוולנטי, היא מודיפיקציה פוסט-טרנסלציונית מרכזית של חלבונים שעלולה להשפיע באופן משמעותי על תהליכים ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להדגים את השימוש ב-glycosate לצורך דגליקוזילציה אנזימטית ואנליזה של גליקוזילציה מסוג n ו-O בחלבון גליקוזילי מודלי. זאת מושג על ידי טיפול בחלבון גליקוזילי באמצעות PGA's F או באמצעות תערובת לדגליקוזילציה של חלבונים. בנוסף, תערובת הדגליקוזילציה של חלבונים הועשרה בתערובת של exo glyco ass נוספים, המסייעים לעיתים בהסרה של סוכרים העמידים בדרך כלל.אנו מדגימים שיטה זו באמצעות גליקופרוטאין מודל, הורמון גונדוטרופין כוריוני אנושי רקומביננטי בטא, או HCG beta, באמצעות SDS page, ולאחר מכן צביעה ב-Kumasi blue ושיטת צביעה ספציפית לסוכר. Pro Q Emerald 300 משמשים לצורך ניתוח הגליקוזילציה. התוצאות שהתקבלו מדגימות HCG beta מראות כי HCG beta עובר גליקוזילציה הטרוגנית ומכיל מספר גליקו-צורות, בהתבסס על ההבדלים בניוד הפרוטאין עם ובלי טיפול בגליקוזידאז ועל האות המוחלש בצביעת ProQ ככל שהגליקנים מוסרים באופן רציף.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אנליזה באמצעות ספקטרומטריית מסות, הוא פשטותה, השימוש בציוד מעבדה נפוץ והתאמתה עבור ביולוגים של גליקנים מתחילים. שיטה זו יכולה לספק תשובות לשאלות מפתח בתחום הגליקו-ביולוגיה, כגון האם החלבון שלי עבר גליקוזילציה. כדי להתחיל בדגליקוזילציה אנזימטית, הפשיר את הבאפרים המסופקים מהערכה לדגליקוזילציה של חלבונים.ערבבו את המבחנות ביסודיות ושמרו אותן בטמפרטורת החדר. הניחו את מבחנות האנזים על קרח, המיסו את תכולת מבחנת ה-HCG beta ב-600 microliters של מים מזוקקים ושמרו על קרח. לאחר הכנת מיליליטר אחד של בופר one XG seven על ידי דילול של מלאי ה-10 x במים מזוקקים, השתמשו ב-25 microliters כדי לדלל 0.5 microliters של PGA's f.הכינו את תערובת ה-exo glycosate על ידי שילוב של שני מיקרוליטרים מכל אחד מארבעת ה-exo glyco diseases. לאחר מכן, הוסיפו HCG beta ו-10 x glycoprotein denaturing buffer לשבעה מבחנות PCR ממוספרות כפי שצוין בפרוטוקול הכתוב, סגרו את המבחנות וערבבו בעדינות. דנאטורו את החלבונים בתרמוסייקלר על ידי דגירה במשך 10 דקות ב-94 °C, ולאחר מכן השהייה ב-4 °C. לאחר הוצאת המבחנות מהתרמוסייקלר, סובבו אותן בצנטריפוגה כדי להסיר עיבוי נראה לעין. לכל מבחנת תגובה, הוסיפו את שאר הריאגנטים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. סגרו את מבחנות ה-PCR באמצעות פקקים חדשים.לאחר מכן, ערבבו את המבחנות על ידי הנקשה עדינה ארבע פעמים לאחר ספינט-דאון (spinning down) של התוכן, הניחו את המבחנות בטרמוסייקלר והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע שעות. לאחר מכן, קררו את הדגימות ל-4 °C. להכנת SDS page, הכינו תמיסת טעינה (loading buffer) של SDS מחזרת בריכוז 3x טרייה.הוסיפו 12.5 µL של באפר טעינה SDS מחזר ריכוז 3x שהוכן עם DTT לכל דגימה, סגרו את המבחנות עם פקקים חדשים והקישו עליהן בעדינות כדי לערבב. דגרו את המבחנות בטרמוסייקלר בטמפרטורה של 94 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן קררו ל-4 °C. לאחר הדגירה, טענו 30 µL מכל דגימה ו-10 µL של סמן חלבון על ג'ל tri glycine בריכוז 10% עד 20%. שמרו את שאר תכולת כל דגימה.בצע אלקטרופורזה לג'ל במתח של 130 volts עד שחזית ה-D תגיע לקרוב לתחתית הג'ל. בסיום ההרצה, הוצא את הג'ל מהתבנית והנח אותו בקופסת פלסטיק קטנה עם כמות מספקת של צבע kumasi blue שתכסה את הג'ל. צבע את הג'ל למשך שעה אחת תוך כדי ערבוב עדין לאחר שביצעו את צביעת הג'ל.שטפו שלוש פעמים למשך 30 דקות. ב-50 מיליליטר של תמיסת detain, רשמו את התמונות באמצעות transluminator לאור לבן או סורק. לחלופין, ניתן לייבש את הג'ל בין דפי צלופן.במסגרת הניסוי, הרץ את השאריות מכל דגימה ואת סמן חלבון על ג'ל Tri glycine בריכוז של 10% עד 20% בזמן שהג'ל רץ. המסס את ריאגנט ProQ emerald באמצעות DMF והכן את תמיסות המלאי לקיבוע, לשטיפה ולהחמצן עבור הצביעה בהתאם למדריך המוצר המצורף לערכה. עם סיום האלקטרופורזה, הוצא את הג'ל מהתבנית והנח אותו בתוך קופסה מפלסטיק.קבע את הג'ל על ידי הוספת 100 milliliters של תמיסת הקיבוע שהוכנה. השאר את הג'ל למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין למחרת. שטוף את הג'ל עם 100 milliliters של תמיסת השטיפה שהוכנה למשך 10 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין, וחזור על השטיפה פעם שנייה עם תמיסת שטיפה רעננה.בשלב הבא, חמצנו את הפחמימות על ידי דגירה של הג'ל עם ניעור עדין למשך 30 דקות ב-25 milliliters של תמיסת החמצון שהוכנה, ולאחר הדגירה בצעו שני שטיפות נוספות בזמן שטיפת הג'ל. הכינו צביעה טרייה של ProQ emerald 300 על ידי הוספת 500 microliters של תמיסת הריאגנט ProQ Emerald 300 ל-25 milliliters של בופר צביעה המסופק בערכה. צבעו את הג'ל על ידי דגירה בצבע שהוכן בתנאי חוש עם ניעור עדין למשך 90 עד 120 דקות לאחר צביעת הג'ל.חזור על שני שלבי השטיפה כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, רשום את התמונות באמצעות מאיר חוזר (trans illuminator) UV ב-300 nanometers. כשלב סופי, השווה בין התמונות של הג'ל שצבע ב-kumasi לבין הג'ל שצבע ב-ProQ emerald.ניתן לראות את השינויים בנדידת החלבון לאחר דגליקוזילציה אנזימטית כאשר משווים את דגימת הביקורת לטיפול F של ה-PGA. להסרת n-glycans וטיפול בתערובת דגליקוזילציה להסרת n- ו-O-glycans, לא נצפה צמצום נוסף בגודל לאחר עיכול עם glycosate נוסף. מלבד שינוי במסה, הפסים הופכים חדים יותר ככל שהגליקנים מוסרים.פס שנמצא מתחת לסמן של 17 kilodalton מייצג ככל הנראה את הפוליפפטיד HCG beta לאחר הסרה מלאה של הגליקוזילציה. נתיבים חמישה עד שבעה מראים את הפסים המתאימים ל-Glyco. פסים אחרים עשויים לנבוע מגליקוזילציה חלקית או מחלבונים לא מזוהים מרובים הנוכחים בדגימת ה-HCG beta.ריאגנט הירוק הزمרדי (emerald green) מחמצן וצובע את כל הגליקנים הנמצאים במולקולת חלבון. לכן, עוצמת האות פוחתת ככל ש-HCG beta עובר ד-גליקוזילציה אנזימטית. האות השארי בנתיבים שלושה וארבע מעיד על נוכחות של מוטיבים של גליקנים, העמידים לאנזימים שנעשה בהם שימוש.הגליקוזאט הנוסף משמש בנתיב ארבע. הסר מספר שאריות סוכר נוספות. נדידת החלבון היא זהה, אך ניתן להבחין בהפחתה קלה בעוצמת הצביעה.שאריות סוכר עמידות לא היו נוכחות בכל מיני החלבונים. חלק מהפסים לא זוהו על ידי emerald Green, מה שמעיד על כך שהם עברו דה-גליקוזילציה נרחבת. נתונים נוספים תומכים במסקנה ש-HCG beta הוא בעל גליקוזילציה הטרוגנית. הפס התחתון בנתיב שתיים הוא חלש בתמונת ה-emerald green.בעוד שהפס העליון בנתיב שתיים הוא בהיר, מה שמעיד על כך שקבוצות GLYCAN רבות עדיין נוכחות, נתונים אלו תומכים במסקנה ש-HCG beta רקומביננטי המבוטא בתאי עכבר מכיל צורות גליקו-מרובות בשל ההטרוגניות האינהרנטית של הגליקוזילציה. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ספקטרומטריית מסה כדי לענות על שאלות נוספות כגון, מהו שיעור התפוסה? מהו היקף הגליקוזילציה, או מהו המבנה העדין של הגליקנים?לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש ב-glycosylate לצורך דגליקוזילציה אנזימטית ואנליזה של NNO Linked Glycans על גליקופרוטאינים. בחירת שיטת הדטקציה עלולה להיות מאתגרת, כיוון שצביעת חלבונים יעילה רק אם הדגליקוזילציה גורמת להסטה משמעותית במסה המולקולרית של חלבונים אחרים.ראינו הגירות לא תקינות לאחר הסרת הגליקוזילציה (deglycosylation) ומצאנו שכל שינוי בהגירה מהווה עדות לכך שהחלבון עבר הסרת גליקוזילציה.

identification-characterization-protein-glycosylation-using-specific

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים שיטה לניתוח שינוי של N-linked glycans דרך חיים המוקדם של גליקופרוטאינים לאחר ביוסינתזה שלהם בתאי יונקים. זו מושגת על ידי ניתוח הדופק מרדף של glycans שכותרתו מטבולית, לשחרר האנזימטית של גליקופרוטאינים ובחינה על ידי HPLC.

Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

שיטה ספציפית ורגישה לגיבוש תובנה לפרופיל הביטוי של אנטיגנים glycosphingolipid באיברים ותאי חיסון מתוארת. השיטה מנצלת את ספקטרומטריית מסות מלכודת היונים המאפשר פיצול צעד חכם של מולקולות glycosphingolipid לניתוח מבני בהשוואה לסטנדרטים מסונתזים כימי.

ניתוח ספקטרומטריה של אנטיגנים Glycosphingolipid

על מנת לחקור באופן מקיף את המגוון של גליקנים מקושרים O, הליך חדש לסילוק β רדוקטיבי בתוך הג'ל, בשילוב עם פרמתילציה ושיטת חלוקת פאזה מהירה, מיושם לניתוח גליקנים מקושרים O המשתחררים ישירות מגליקופרוטאינים שנפתרו על ידי SDS-PAGE וניתנים לניתוח גליקומי לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.

השתפר בג&#39;ל Sulfo-glycomics β-ביעור עבור מקיף O צמוד וReductive ידי ספקטרומטריית מסה

פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה פותח לטיהור משולב של פרוטאומיקה וגליקומיקה וכימות LC-MS/MS בפלזמה. ניתוח Deamidation של מוטיבים של גליקוזילציה המקושרים ל-N היה ספציפי לאתרים דה-גליקוזיליים. כימות מדויק של N-גליקנים הושג על ידי צימוד הפרדת N-גליקן בסיוע מסנן לנורמליזציה של האינדיבידואליות בעת תיוג עם אסטרטגיית תגי גליקן הידרזיד.

Glycomics כמוני ואסטרטגית טיהור המשולבת פרוטאומיקה

מאמר זה מתאר מתודולוגיה להכין דגימות רקמות וכלי דם לצורך ניתוח MS המאפשרת (1) ניתוח של הרכב החלבון ECM, (2) זיהוי של אתרי glycosylation, ו (3) אפיון ההלחנה של צורות glycan. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת, עם שינויים קלים, כדי המחקר של ECM ברקמות אחרות.

Glycoproteomics של מטריקס: שיטה Intact ניתוח Glycopeptide באמצעות ספקטרומטריית מסה

חיפוש פתוח מאפשר זיהוי של גליקופפטידים מעוטרים בקומפוזיציות גליקאן שלא היו ידועות קודם לכן. בתוך מאמר זה, גישה יעילה לביצוע חיפוש פתוח וחיפושי גליקופפטיד ממוקדי גליקן הבאים מוצגים עבור דגימות חיידקים באמצעות Acinetobacter baumannii כמודל.

היישום של גישות מבוססות חיפוש פתוח לזיהוי של Acinetobacter baumannii O מקושר Glycopeptides

פרוטוקול זה מפרט את שיטת הגליקופרוטאומיקה מונחית הגליקומיקה, טכנולוגיית אומיקס משולבת המציעה תובנות מקיפות על הגליקופרוטאום ההטרוגני במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות הדרושות להבנה טובה יותר של הגליקוביולוגיה של סרטן.

גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות 

כאן אנו מתארים טכניקה חדשה proteomics כמותיים לזיהוי מתחמי חלבון cerevisiae Saccharomyces. במחקר הנוכחי, השתמשנו בשיטה SILAC יחד עם טיהור זיקה ואחריו טנדם ספקטרומטריית מסה להזדהות עם סגוליות גבוהה השותפים המחייב של חלבון ER, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

פרוטוקול קצר מכתים חלבון עם Coomassie מבריק כחול (CBB) G-250 ב ג'לים polyacrylamide מתואר ללא שימוש בממיסים אורגניים או חומצה אצטית כמו הנהלים מכתים קלאסית עם CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

הסרטון מלווה מתאר את השימוש של מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה, אשר מחיצות דגימות חלבון מורכב על בסיס משקל מולקולרי ומשחזרת את השברים בשלב נוזלי. הסרטון מתאר כיצד הטכנולוגיה עובדת, וכיצד נעשה בו שימוש, ומספק נתונים כתוצאה, עם ניתוח ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide של homogenate מופרדים בכבד בקר.

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

למדו שיטת דיגליקוזילציה אנזימטית של חלבונים באמצעות גליקוזידאזים ספציפיים לניתוח גליקנים מקושרים מסוג N ו-O בחלבון HCG beta. השיטה משלבת SDS-PAGE וצביעה ספציפית לגליקנים באמצעות ProQ Emerald 300.

זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות glycosylation ספציפי אנדו ו exoglycosidases

גלה סרטונים נוספים