זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות glycosylation ספציפי אנדו ו exoglycosidases

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להמחיש את השימוש בגליקוסט לדה-גליקוזילציה אנזימטית וניתוח של גליקוזילציה מקושרת n ו-O על גליקופרוטאין מודל. זה מושג על ידי טיפול בגליקופרוטאין עם F של PGA או עם תערובת דה-גליקוזילציה של חלבון. כמו כן, תערובת הדגליקוזילציה של החלבון נוספה בתערובת של אקסו גליקו אס נוסף, שלפעמים מסייע בהסרת סוכרים עמידים אחרת.

אנו מדגימים שיטה זו באמצעות מודל גליקופרוטאין רקומביננטי גונדוטרופין גונדוטרופין כוריוני אנושי בטא, או HCG beta בדף SDS הבא, ואחריו צביעה כחולה קומאסי ושיטת צביעה ספציפית לסוכר. Pro Q Emerald 300 משמשים על מנת לנתח את הגליקוזילציה D. מתקבלות תוצאות דגימת HCG beta, המראות כי HCG beta הוא גליקוזילציה הטרוגנית ומכיל צורות גליקו מרובות המבוססות על ההבדלים בנדידת החלבון עם ובלי טיפול בגליקוזה והאות המופחת על צביעת ProQ כאשר הגליקנים מוסרים ברצף.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניתוח ספקטרומטריית מסה, הוא שהיא פשוטה, משתמשת בציוד מעבדה נפוץ וטובה לביולוג הגליקו המתחיל. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הגליקו, כגון האם החלבון שלי מסוכרר. כדי להתחיל בדה-גליקוזילציה אנזימטית, יש להפשיר את המאגרים המסופקים מערכת הדגליקוזילציה של החלבון.

מערבבים היטב את הצינורות ושומרים בטמפרטורת החדר. מניחים את האנזים המכיל בקבוקונים על קרח, ממיסים את תכולת בקבוקון הבטא HCG ב-600 מיקרוליטר מים מזוקקים ושומרים על קרח. לאחר הכנת מיליליטר אחד של מאגר XG 7 אחד על ידי דילול מלאי ה-10 x במים מזוקקים, השתמש ב-25 מיקרוליטר כדי לדלל 0.5 מיקרוליטר של f של PGA.

הכן את תערובת האקסו גליקוז על ידי שילוב של שני מיקרוליטר, כל אחת מארבע מחלות האקסו גליקו. לאחר מכן, הוסף HCG beta ו-10 x glycoprotein denaturing buffer לשבעה צינורות PCR ממוספרים כפי שמצוין בפרוטוקול הכתוב, כסה את הצינורות וערבב בעדינות את דנטורציה של החלבונים בתרמו-סייקלר על ידי דגירה של 10 דקות ב-94 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן החזקה של ארבע מעלות צלזיוס לאחר הוצאת הצינורות מהצנטריפוגה התרמו-ציקלרית כדי להסיר כל עיבוי גלוי לכל צינור תגובה, הוסף את הריאגנטים הנותרים על פי הפרוטוקול הכתוב. סגור את צינורות ה-PCR באמצעות מכסים חדשים.

לאחר מכן מערבבים את הצינורות על ידי הקשה עדינה ארבע פעמים לאחר סיבוב התוכן, מניחים את הצינורות בדגירה התרמו-ציקלרית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר מכן קירור הדגימות לארבע מעלות צלזיוס. כדי להגדיר דף SDS, הכן טרי פי שלושה מאגר טעינת SDS.

עם DTT, הוסף 12.5 מיקרוליטר ממאגר הטעינה המוכן של שלושה x להפחתת SDS לכל דגימה, סגור את הצינורות עם מכסים חדשים והקש בעדינות על הצינורות כדי לערבב. דגרו את הצינורות בתרמו-סייקלר בטמפרטורה של 94 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן מצננים לארבע מעלות צלזיוס לאחר עומס הדגירה, 30 מיקרוליטר מכל דגימה ו-10 מיקרוליטר של סמן החלבון על ג'ל טרי גליצין של 10 עד 20%. שמירת שארית כל דגימה.

אלקטרו את הג'ל ב-130 וולט עד שחזית D קרובה לתחתית הג'ל. לאחר שהג'ל סיים לפעול, הוציאו את הג'ל מהגבס והניחו אותו בקופסת פלסטיק קטנה עם מספיק כתם כחול קומאסי כדי לכסות את כתם הג'ל. הג'ל למשך שעה עם תסיסה עדינה לאחר שהג'ל מוכתם.

שוטפים שלוש פעמים למשך 30 דקות. ב-50 מיליליטר של תמיסת עיכוב, הקלט את התמונות באמצעות מתמר אור לבן או סורק. לחלופין, ניתן לייבש את הג'ל בין יריעות צלופן.

במסגרת, הפעל את השארית מכל דגימה וסמן חלבון על ג'ל טרי גליצין של 10 עד 20% בזמן שהג'ל פועל. ממיסים את מגיב האמרלד ProQ עם DMF והכינו את תמיסות תיקון, שטיפה וחמצון לכתם בהתאם למדריך המוצר המצורף לערכה. בסיום האלקטרופורזה, הוציאו את הג'ל מהגבס והניחו אותו בקופסת פלסטיק.

תקן את הג'ל על ידי הוספת 100 מיליליטר מהתמיסה הקבועה המוכנה. השאירו את הג'ל למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה למחרת. שוטפים את הג'ל עם 100 מיליליטר מתמיסת הכביסה המוכנה למשך 10 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה, וחוזרים על הכביסה פעם שנייה עם תמיסת כביסה טרייה.

לאחר מכן, חמצנו את הפחמימות על ידי דגירה של הג'ל בתסיסה עדינה למשך 30 דקות ב -25 מיליליטר מתמיסת החמצון המוכנה, עקוב אחר הדגירה בשתי שטיפות נוספות בזמן שהג'ל שוטף. הכן כתם ProQ emerald 300 טרי על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של תמיסת ריאגנט ProQ Emerald 300 ל-25 מיליליטר של מאגר צביעה המסופק בערכה. מכתים את הג'ל על ידי דגירה בכתם המוכן בתנאים חשוכים עם תסיסה עדינה למשך 90 עד 120 דקות לאחר צביעת ג'ל.

חזור על שני שלבי הכביסה כמתואר קודם לכן. לאחר מכן הקלט את התמונות עם תאורת טרנס UV ב-300 ננומטר. כשלב אחרון, השווה את התמונות של הג'ל המוכתם של קומאסי עם ג'ל הכתמים אמרלד ProQ.

ניתן לראות את השינויים בנדידת החלבון לאחר דה-גליקוזילציה אנזימטית כאשר משווים את דגימת הבקרה לטיפול F של ה-PGA. להסרת n גליקנים ולטיפול בתערובת דה-גליקוזילציה להסרת n ו-O גליקנים, לא נראית הפחתה נוספת בגודל לאחר עיכול עם גליקוזט נוסף. מלבד שינוי במסה, הרצועות הופכות חדות יותר ככל שמסירים גליקנים.

רצועה העוברת מתחת לסמן של 17 קילודלטון מייצגת ככל הנראה את הפוליפפטיד HCG בטא דה-גליקוזילט במלואו. מסלולים 5 עד 7 מציגים את הרצועות המתאימות לגליקו. רצועות אחרות עשויות לנבוע מדגליקוזילציה לא שלמה או ממספר חלבונים לא מזוהים הקיימים בדגימת הבטא של HCG.

המגיב בצבע ירוק אמרלד מתחמצן ומכתים את כל הגליקנים הקיימים במולקולת חלבון. לכן, עוצמת האות פוחתת ככל ש-HCG בטא מסוכרר אנזימטית. האות השיורי בנתיב 3 ו-4 מעיד על נוכחות של מוטיבים גליקניים, העמידים לאנזימים המשמשים.

הגליקוזיט הנוסף משמש בנתיב ארבע. הסר כמה שאריות סוכר מיותרות. נדידת החלבון זהה, אך ניתן לראות ירידה קלה בעוצמת הצביעה.

חלקי סוכר עמידים לא היו קיימים בכל מיני החלבונים. חלק מהרצועות לא זוהו על ידי אמרלד גרין מה שמצביע על כך שהן עברו דה-גליקוזילציה באופן נרחב נתונים נוספים תומכים במסקנה ש-HCG בטא הוא גליקוזילציה הטרוגנית. הרצועה התחתונה בנתיב השני חיוורת בתמונה הירוקה אזמרגד.

בעוד שהרצועה העליונה בנתיב השני בהירה ומצביעה על כך שקבוצות GLYCAN רבות עדיין קיימות, נתונים אלה תומכים במסקנה כי HCG בטא רקומביננטי המתבטא בתאי עכבר מכיל צורות גליקו מרובות בשל ההטרוגניות המובנית של גליקוזילציה. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות נוספות כגון ספקטרומטריית מסה על מנת לענות על שאלות נוספות כגון, מהו שיעור התפוסה? מה מידת הגליקוזילציה, או מהו המבנה העדין של הגליקנים?

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בגליקוזילט לדה-גליקוזילציה אנזימטית וניתוח של גליקנים מקושרים NNO. על גליקופרוטאינים. בחירת הזיהוי יכולה להיות קשה מכיוון שאזורי צביעת חלבון שימושיים רק אם הגליקוזילציה מביאה לשינוי משמעותי במסה המולקולרית עבור חלבונים אחרים.

ראינו נדידות חריגות לאחר דה-גליקוזילציה ומצאנו שכל שינוי בנדידה הוא עדות לכך שהחלבון עבר דה-גליקוזילציה.