Name: ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: למדו פרופיל transcriptomes באמצעות RNA-seq בתאי אנדותל מיקרווסקולריים ריאתיים אנושיים מטופלים בטרומבין. הפרוטוקול כולל בידוד RNA, בניית ספריית DNA, ריצוף HighSeq 1000 וניתוח נתונים לזיהוי גנים מופרשים באופן דיפרנציאלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר סטיבן Kingsmore ומרכז לרפואת הגנום ילדים בבתי החולים ומרפאות מרסי לילדים לשימוש באשכולות המחשוב שלהם לניתוח הנתונים שלנו, צוות של Illumina תחום השירות (אליזבת בוייר, סקוט קוק ומארק קוק) והטכני צוות יועצים לתגובות המהירות שלהם והצעות מועילות על הריצה של מכשיר הדור הבא של רצפי DNA, HiScanSQ, וניתוח איכות נתונים. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט HL080042 (לSQY) והקרן הזנק והנחלה של בתי החולים ומרפאות מרסי לילדים, אוניברסיטת מיזורי בקנזס סיטי (לSQY).

<html> תרשים זרימה מתאר פרוטוקול זה מוצג באיור 1. 1. טיפול בתאים עם טרומבין, RNA בידוד, הערכת איכות וכימות של RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות אנושי ריאות כלי דם (אנדותל HMVEC-LBL) למפגש 90-100% בצלחות 6-גם במדיום EGM-2 עם 5% FBS, גורמי גדילה ואנטיביוטיקה (Lonza, חתול # CC-3202). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי תקשורת לתקשורת הרעבה (0% FBS) 30 דקות לפני הטיפול עם תרומבין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את התאים עם 0.05 U / ml תרומבין או להשאיר מטופל כשלט עבור 6 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד RNA כלל מהתאים שטופלו ושליטה באמצעות Ambion מיר נה הערכה לפי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את איכות RNA עם שבב RNA האיקריוטים StdSense Experion פי הפרוטוקול הסטנדרטי בתחנת אלקטרופורזה האוטומטית Experion (= &quot;_blank&quot;&gt; Www.bio-rad.com). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את RNA באמצעות שיטת spectrophotometric סטנדרטית. </li></ol> 2. בניית הספרייה ורצף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מיקרוגרם 1 של RNA באיכות הגבוהה הכולל לדוגמה כחומר מוצא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבנות את הספרייה, בצע את ההליך הסטנדרטי מIllumina (פרוטוקול # 15008136 כומר). בפרוטוקול זה, שני סיבובים של פולי () בחירות mRNA מכילים מבוצעים כדי להסיר rRNA כדי למזער את רצפי rRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את איכות הספריות באמצעות שבב ה-DNA 1K Experion פי הפרוטוקול הסטנדרטי בתחנת אלקטרופורזה האוטומטית Experion <a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">(www.bio-rad.com).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הספרייה באמצעות qPCR: השתמש בספרייה שבעבר כבר רצף כעקומה ופריימרים ספציפיים למתאמי הגבעול סטנדרטי. השתמש במגוון של דילולים של ספריות לא הידועות (כלומר 1:100, 1:500 ו1:1,000). הפעל qPCR עכוrding לפרוטוקול MM SyberGreen ולחשב את ריכוז המנייה המקורית של כל ספרייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את המניות לספריית 10 ננומטר ולאחסן ב -20 ° C עד מוכן לאשכול תא זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכן לאשכול תא זרימה, להפשיר את הצלחת מגיבה CBOT באמבט מים. CBOT הוא מכשיר Illumina משמש כדי לייעל את תהליך יצירת האשכול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את מכשיר CBOT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל ספריות: שלב 13 מיקרומטר ספריית 6 μl 10 1x TE μl ו, לצדו של הצינור, להוסיף 1 μl 1 N NaOH (המסופק על ידי Illumina). מערבולת, ספין למטה, דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולמקם את הספריות המפוגלות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הספריות: לדלל את הספריות המפוגלות עם חיץ הכלאה מראש מצונן (HT1, המסופק על ידי Illumina) על ידי שילוב HT1 ו4 ספריית μl מפוגלת μl 996 לריכוז סופי של 12 PM. הנח את הספריות מפוגלות ומדוללות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך כל שורה של צינורות של צלחת CBOT,להבטיח כי כל ריאגנטים מופשרים. הספין למטה הצלחת, להסיר / לנקב את חותמות רדידים ולהעמיס CBOT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 120 μl aliquot של ספריות המדוללות, המפוגלות לצינור רצועה, שכותרתו 1-8. הוסף 1.2 ספריית μl מדוללת, מפוגלת PhiX שליטה (מIllumina) לכל צינור כמחודד בשליטה. מערבולת וספין למטה את הצינורות ולטעון אותם על CBOT בכיוון הנכון (צינור # 1 בצד ימין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען תא זרימה וסעפת על CBOT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם את הזרימה לבדוק ולהתחיל לרוץ באשכולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הריצה תושלם, לבדוק משלוח מגיב בכל הנתיבים. שים לב לתופעות חריגות. גם להתחיל לרוץ רצף מייד או לאחסן את תא הזרימה בצינור ספק ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר את כל סידור אחר הסינתזה (SBS, Illumina) ריאגנטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ריאגנטים למקומות המתאימים במגשים המגיבים, כדי לוודא שלא לגעת בחומרים הכימיים האחרים לאחר שנגע תמהיל המחשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש לאתא n-רצף זרימה (כלומר אחד שמיצה בעבר), ממשלת הקווים המגיבים פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקות ביסודיות את תא רצף זרימה עם EtOH 70% וKimwipes, ואחרי EtOH 70% ונייר עדשה. בדוק את תא זרימה לכל פסים. מחדש לנקות אותו במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תא הזרימה על הרצף ולבצע זרימה לבדוק כדי להבטיח שחותם בין הסעפות ותא הזרימה הוא הדוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל לרוץ רצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את מדדי האיכות (לדוגמה, צפיפות האשכול, אשכולות שעברו סינון, Q30, עצמה) כפי שהם מתפרסמים בזמן הריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח עצמה לאורך הריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 101 מחזורי הסקרים, לבצע תפנית כימיה כדי להשלים את 2 קראו: הפשר את ריאגנטים הקצה לזווג והצפת התאגדות הקריאה השנייה (ICB, מרכיב של ריאגנטים SBS, Illumina) ולטעון את החומרים כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ריצת הרצף, הערכת 2 nd לקרוא עצמה, Q30מדדים אחרים nd איכות כמו התקדמות הריצה. </li></ol> 3. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בגרסה העדכנית ביותר של CASAVA (Illumina, כרגע 1.8.2) כדי להמיר את קבצי הבסיס (הטלפוניים. BCL) קבצים לקבצים. Fastq, הגדרת fastq-אשכול ספירה ל 0 כדי להבטיח יצירת קובץ fastq יחיד עבור כל דגימה . לפתוח את קבצי fastq לניתוח במורד זרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע יישור הסוף לזווג שימוש בגרסות האחרונות של TopHat (1.4.1) 5, שמיישרת RNA-seq קורא לגנומים של יונקים בגודל באמצעות אולטרה aligner התפוקה גבוהה הקצר הקריאה (BOWTIE, 0.12.7) 6 וSAMtools (0.1. 17) 7. SAMtools מיישם כלי עזר שונים למערכים לאחר עיבוד בפורמט SAM. Transcriptome אנושי ההתייחסות ניתן להוריד מiGenomes <a href="http://www.illumina.com" target="_blank">(www.illumina.com).</a> בריצת TopHat והשתמשנו בכל הגדרות ברירת המחדל של הפרמטרים כוללים אפשרות סוג הספרייה כfr-unstranded (ברירת מחדל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנוing CuffDiff התכנית, חלק מחפת (1.3.0) חבילת תוכנה 8, להשוות את תאי תרומבין שטופל לתאי הבקרה לסנן את תמלילי הגנים מתבטאים באופן דיפרנציאלי בעבר על בסיס transcriptome ההתייחסות האנושית. השוואה זו מזהה את ביטוי ההפרש של תמלילים ידועים. השתמש ב-Microsoft Excel מציג את התוצאה בצורת טבלה. בהפעלת תכנית חפת והשתמשנו בכל הגדרות ברירת המחדל של הפרמטרים. אלה תעתיקי גנים עם FPKM &lt;0.05 ו-p&gt; 0.05 מסוננים החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות isoforms רומן, לרוץ בלי חפת transcriptome הפניה. השווה את קבצי תמליל הדוגמא להתייחסות הגנום באמצעות Cuffcompare ולבדוק את ביטוי ההפרש עם Cuffdiff באמצעות קבצי תמליל תרומבין המשולבים כהגנום התייחסות לניתוח אחד ואת קבצי תמליל בקרה המשולבות כהגנום התייחסות לניתוח שני. השתמש ב-Microsoft Excel מציג את התוצאה בתבנית טבלאית. שוב, thosתעתיקי גני E עם FPKM &lt;0.05 ו-p&gt; 0.05 מסוננים החוצה. לאחר שלב זה, חוקרים יכולים לבחור כדי להעלות רשימה של תמלילים שדווחו לאחרונה לאתר UCSC הגנום הדפדפן <a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">(http://genome.ucsc.edu/)</a> כדי לאמת את תוקפם על ידי בדיקה ידנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח רשימות של גנים הביעו באופן דיפרנציאלי לניתוח נתיב שנינות (IPA, <a href="www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com)</a> לאפיון של הגנים והשבילים המושפעים מטיפול תרומבין. בשלב זה, חוקרים יכולים לבחור להשתמש באבנט <a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">(http://compbio.mit.edu/cummeRbund/),</a> חבילת R אשר נועדה לסייע ולפשט את המשימה של ניתוח חפת פלט RNA-seq, כדי לסייע בניהול, לדמיין ולשלב את כל נתונים המיוצרים על ידי ניתוח Cuffdiff. </li></ol> 4. אימות של תוצאות RNA-seq ידי בזמן אמת-פו כמוניתגובת שרשרת lymerase (qRT-PCR) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בידוד RNA מוחלט משליטה ותאי תרומבין טופל HMVEC-LBL, RNA איכות הערכה וכימות רנ&quot;א תאר בצעדים 1.4-1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר דנ&quot;א משלים מ1 RNA מיקרוגרם הכולל של כל דגימה עם ערכות עיליות III ראשון גדיל סינתזת מערכת RT, בעקבות הוראות היצרן (Invitrogen, 18080-051). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח qRT-PCR על מערכת Applied Biosystems ViiA 7 Real-Time PCR באמצעות TaqMan oligonucleotides נועד Assay על פי דרישה לגילוי CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor גורם הקשור 1 (TRAF1, Hs01090170_m1), וβ-יקטין (ACTB, Hs99999903_m1). כל דגימה הייתה תבנית שווה ערך ל 5 ננוגרם של רנ&quot;א בסך הכל. למדוד לכמת בשיטת DDCt ולנרמל לβ-תקטין. כל assay בוצע על פני לפחות שלוש ביולוגיים משכפל. </li></ol>

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li>
<li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229(2012).</li>
<li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat%3A+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25(2009).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li>
<li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+pathway+analysis%3A+current+approaches+and+outstanding+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375(2012).</li>
<li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Working with RNA.</a> Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+and+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">De novo assembly and analysis of RNA-seq data.</a> Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).</li>
<li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li>
<li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transcriptome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שלבים עיקריים טיפול RNA: RNases לבזות אפילו את רוב RNA באיכות גבוהה, ולכן יש להקפיד בעת הבידוד, האחסון והשימוש של רנ&quot;א 10. כפפות תמיד שחוקות על מנת למנוע זיהום על ידי RNases שנמצא על ידי אדם. כפפות צריכות להיות שונות לעתים קרובות, במיוחד לאחר עור נוגע, ידיות של דלתות או משטחים נפוצים אחרים. קבוצה של pipettes צריכה להיות מוקדשת אך ורק לעבודת RNA וכל הטיפים וצינורות צריכים להיות RNase ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td width="183"> ריאגנטים או ציוד </td><td width="85"> חברה </td><td width="185"> מספר קטלוגים </td><td width="359"> תגובות </td></tr><tr><td> תאי ריאת כלי דם האנדותל אדם </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, קיט Bullet </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> מכיל EGM-2, FBS, גורמי גדילה ואנטיביוטיקה </td></tr><tr><td> תרומבין </td><td> סיגמא </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion מיר נה קיט </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-Zap </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens רנ&quot;א </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq רנ&quot;א הכנהקיט </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> חרוזי AMPureXP </td><td> Beckman Coulter </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> עילי הפוך transcriptase השני </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> 1K Experion DNA </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE Cluster דור קיט </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX בקרת הקיט </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 מחזור SBS קיט </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> מכונת qPCR - Viia7 </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> # VIIA7 / ציוד דגם # 10631261 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> Experion מערכת </td><td> Bio Rad </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer היא מערכת חלופית </td></tr><tr><td> ספקטרופוטומטר </td><td> Bio-Tek </td><td> אפוק Microplate ספקטרופוטומטר </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> צנטריפוגה - Sorvall המקרא XTR </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004521 </td><td> או שווה ערך </td></tr><tr><td> מעמד מגנטי </td><td> חי טכנולוגיות </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96-היטב thermocycler </td><td> ספק מעבדת כללית </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> לוח 3. רשימה של ריאגנטים מפתח ומי מז&#39;ורquipment. *, בוידאו, HiSeq1000 במקום HiScanSQ הודגם. </td></tr></tbody></table>

ניתוח rna-seq של transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

האפיון של ביטוי גנים בתאים באמצעות מדידת רמות ה-mRNA הוא כלי שימושי בקביעה כמה מכונות התעתיק של התא מושפעות מאותות חיצוניים (לדוגמה: טיפול תרופתי), או כמה תאים שונים בין מצב בריא ומצב חולה. עם כניסתו ועידון מתמיד של טכנולוגיית רצפי DNA של הדור הבא, RNA-רצף (RNA-seq) הפך שיטה פופולרית יותר ויותר של ניתוח transcriptome לקטלג את כל המינים של תמלילים, כדי לקבוע את מבנה התעתיק של כל הגנים הביעו ולכמת הרמות המשתנות הביטוי של המערך הכולל של תמלילים בניתן 1,2 תא, רקמה או אורגניזם. RNA-seq הדרגה מחליף מערכי DNA כשיטה מועדפת לניתוח transcriptome כי יש לו את היתרונות של אפיון transcriptome מלא, ומספק נתון סוג דיגיטלי (מספר העתק של כל פרוטוקול) ולא להסתמך על כל sequen הגנומי ידוע3 לספירה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מלא ומפורט כדי להחיל RNA-seq לtranscriptomes פרופיל בתאי כלי דם ריאתי אדם אנדותל עם או בלי טיפול תרומבין. פרוטוקול זה מבוסס על המחקר שפורסם לאחרונה תחת הכותרת שלנו &quot;RNA-seq חושף transcriptome רומן של גנים וisoforms בתאי כלי דם ריאתי אדם שטופלו באנדותל טרומבין,&quot; 4 שבבצענו ניתוח transcriptome המלא הראשון של תאי כלי דם ריאתי אדם אנדותל בהצלחה טופל בתרומבין באמצעות RNA-seq. הוא הניב משאבים חסרי תקדים לניסויים נוספים כדי לקבל תובנה לתוך מנגנונים מולקולריים שבבסיס תפקוד האנדותל תרומבין בתיווך בפתוגנזה של מצבים דלקתיים, סרטן, סוכרת, ומחלת לב כלילית, ומספק לידים חדשים פוטנציאליים למטרות טיפוליות למחלות אלה. טקסט התיאורים של פרוטוקול זההוא מחולק לארבעה חלקים. החלק הראשון מתאר את הטיפול בתאים אנושיים ריאות כלי דם אנדותל עם תרומבין ו-RNA בידוד, איכות ניתוח וכימות. החלק השני מתאר את בניית ספרייה וסדר. החלק השלישי מתאר את ניתוח הנתונים. החלק הרביעי מתאר assay אימות RT-PCR. תוצאות מייצגות של כמה צעדים מרכזיים מוצגות. טיפים או אזהרות שימושיים כדי לשפר את ההצלחה בשלבים עיקריים מובאים בסעיף הדיון. למרות שפרוטוקול זה משתמש בתאי אנדותל כלי דם ריאתי אדם שטופלו בתרומבין, זה יכול להיות כללי לtranscriptomes הפרופיל בשני תאי יונקים ושאינם יונקים וברקמות שטופלו בגירויים שונים או מעכבים, או להשוואת transcriptomes בתאים או רקמות בין מצב בריא ומצב של מחלה.

עבור שלב 1: -28: יחס 18s משמש באופן מסורתי כאינדיקציה לפירוק רנ&quot;א. באופן אידיאלי, -28 השיא צריך להיות בערך פי שניים מהשטח של להקת 18s (יחס של 2), אולם יחס אידיאלי זה הוא לעתים קרובות לא ראה בפועל. יתר על כן, יחסים -28: 18S המתקבלים משיטות spectrophotometric יכולים לזלזל בסכום של השפלה של רנ&quot;א. באופן מדויק יותר כדי לכמת את ההשפלה, ולכן האיכות של מדגם RNA, המערכת מחשבת Experion איכות מחוון מספר רנ&quot;א (RQI). אלגוריתם RQI משווה electropherogram של דגימות...

פרוטוקול זה מציג הליך מלא ומפורט להחלת RNA-seq, טכנולוגיית דור הבא DNA עצמת רצף, לtranscriptomes פרופיל בתאים אנושיים ריאות כלי דם אנדותל עם או בלי טיפול תרומבין. פרוטוקול זה הוא להכליל לתאים או רקמות שונים שנפגעו על ידי חומרים כימיים שונים או במחלות.

ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להציג תהליך שלם ומפורט ליישום RNA-Seq, טכנולוגיית ריצוף DNA רבת עוצמה מהדור הבא לפרופיל טרנסקריפטומים. זה מושג על ידי בידוד RNA כולל מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים אנושיים עם או בלי טיפול בטרומבין ובדיקת איכות ה-RNA. השלב השני הוא בניית ספריות DNA מדגימות RNA אלה.ייעל את יצירת האשכול באמצעות מכשיר ה-cbot ובצע את משימת ריצוף ה-DNA ב-HighSeq 1000. ניתוח הנתונים הבא מבוצע כדי לזהות ולהציג בסופו של דבר תעתיקי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי. השלב האחרון הוא אימות תוצאות RN aeq על ידי RT, TP, CR. היתרון העיקרי של IC על פני שיטות קיימות כמו מערך מיקרו DNA לניתוח טרנסקריפטום הוא ש-IC יכול ליצור פרופיל של טרנסקריפטום שלם, לספק סוג דיגיטלי של נתונים, ולא להסתמך על שום איזציה גנומית ידועה של ביטוי גנים בתאים.בעוד שמדידת רמת MRA היא כלי שימושי בקביעת האופן שבו שעתוק המכונות של התא מושפע מאותות חיצוניים או כיצד תאים שונים בין מצב בריאותי למצב מחלה. בפרוטוקול זה, נדגים ניתוח IC של טרנסקריפטומים בטרובין שטופלו ובקרת תאי הודו-סינתר מיקרו-וסקולריים ריאתיים אנושיים. פרוטוקול זה מבוסס על המחקר שפורסם לאחרונה בו ביצענו בהצלחה את ניתוח הטרנסקריפטום המלא הראשון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים אנושיים שטופלו בתרומבין באמצעות RNA-Seq ב-High SEQ 1000, פלטפורמת ריצוף DNA פופולרית מהדור הבא. באמצעות מערכת VS 7 R-T-P-C-R, ד"ר דנובה תדגים את הטיפול בתטרומבין בתאי ריאה אנושיים, תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ובידוד RNA כולל של תאים.גב' מרגרט גיבסון תדגים את מערכת Experian לבדיקת איכות RNA וספריית DNA כמו גם יצירת אשכולות ב-cbot.וד"ר דימיטרי גרגור ידגים ניתוח נתונים כדי להתחיל בתרבות פרוטוקול זו. תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של ריאות אנושיות בין 90 ל-100% מפגש בשש צלחות באר ב-EGM שני בינוניים עם גורמי גדילה של 5% FBS ואנטיביוטיקה. החלף את המדיה למצע ההרעבה 30 דקות לפני הטיפול בתרומבין.לאחר 30 דקות יש לטפל בתאים עם 0.05 יחידות למיליליטר, תרומבין, או להשאיר ללא טיפול כביקורת. דגרו על התאים במשך שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר טיפול של שש שעות.בודד את סך ה-RNA מהתאים המטופלים והביקורת באמצעות ערכת נירוונה בהתאם להוראות היצרן. העריכו את איכות ה-RNA עם שבב רנ"א אאוקריוטי בעל חוש סטנדרטי של Experian על פי הפרוטוקול הסטנדרטי בתחנת האלקטרופורזה האוטומטית של Experian. לבסוף, כמת את ה-RNA באמצעות שיטה פוטומטרית ספקטרו סטנדרטית לבניית ספרייה.השתמש במיקרוגרם אחד של RNA כולל באיכות גבוהה לכל דגימה כחומר מוצא לבניית הספרייה. פעל לפי הפרוטוקול הסטנדרטי של היצרן. בפרוטוקול זה מבוצעים שני סבבים של פולי המכילים בחירות Mr.mRNA.כדי להסיר את ה-RNA שלנו כדי למזער את ריצוף ה-RNA שלנו, העריכו את איכות הספריות באמצעות שבב Experian DNA one K. על פי הפרוטוקול הסטנדרטי בתחנת האלקטרופורזה האוטומטית של Experian. כמת את הספרייה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת.בקיצור Q-R-T-P-C-R כמתואר בפרוטוקול הכתוב. בליווי סרטון זה, הפעל את ה-Q-R-T-P-C-R על פי פרוטוקול ה-MM הירוק של הסייבר וחשב את ריכוז המלאי המקורי של כל ספרייה. יש לדלל את מלאי הספרייה ל-10 ננו-מולאר ולאחסן ב-20 מעלות צלזיוס.כאשר מוכנים לאכול תא זרימה, הפשירו את לוחית המגיב cbot באמבט מים. CBOT הוא מכשיר המשמש לייעול תהליך יצירת האשכול. לאחר שטיפת מכשיר ה-cbot, דנטור את הספריות על ידי שילוב של 13 מיקרוליטר של XTE אחד ושישה מיקרוליטר של 10 ננו-מולר.ספרייה לאחר מכן לצד כל צינור, הוסף מיקרוליטר אחד של נתרן הידרוקסיד רגיל אחד, מערבול את הצינורות מסתובבים למטה ודוגר אותו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן הניחו את הספריות המפורקות על קרח. לאחר מכן, יש לדלל את הספריות המפוקפקות עם מאגר הכלאה מקורר מראש על ידי שילוב של 996 מיקרוליטר של מאגר ו-4.0 מיקרוליטר של ספרייה מפוקפקת לריכוז סופי של 12 פיקו טוחנת.הניחו את הספריות המדוללות המפורקות. לאחר מכן הפוך כל שורת צינורות של צלחת הבוט, וודא שכל הריאגנטים מופשרים. לאחר סיבוב הצלחת, הסר את אטם נייר הכסף משורת צינורות הנתרן הידרוקסיד והעמיס על ה-cbot aliquot.120 מיקרוליטר מהספריות המדוללות שעברו דנטורציה לצינור רצועה המסומן אחת עד שמונה. הוסף 1.2 מיקרוליטר של ספריית הבקרה PHI X המדוללת לכל צינור כעלייה בשליטה. לאחר מערבולת וסיבוב הצינורות, טען אותם על ה-cbot בכיוון הנכון עם צינור מספר אחת מימין.טען תא זרימה וסעפת על ה- cbot. השלם את בדיקת הזרימה והתחל את הפעלת האשכולות. לאחר השלמת ההפעלה, בדוק את אספקת הריאגנטים בכל הנתיבים.רשום לעצמך חריגות. התחל את ריצת הריצוף מיד או אחסן את תא הזרימה בצינור המסופק בארבע מעלות צלזיוס. כדי להתחיל ברצף.להפשיר את הרצף על ידי ריאגנטים לסינתזה. טען את הריאגנטים למקומות המתאימים במגשי הריאגנטים, הקפד לא לגעת בשאר הריאגנטים. לאחר נגיעה בתערובת המחשוף, באמצעות תא זרימה רצף שאינו ראש, קווי המגיב מנקים פעמיים ביסודיות את תא זרימת הריצוף עם 70% אתנול ומגבוני קים, ואחריהם 70% אתנול ונייר עדשות.בדוק את תא הזרימה לאיתור פסים ונקה אותו מחדש במידת הצורך. טען את תא הזרימה על הרצף ובצע בדיקת זרימה כדי לוודא שהאיטום בין הסעפות לתא הזרימה הדוק. התחל את ריצת הרצף.העריכו את מדדי האיכות כשהם הופכים לזמינים במהלך הריצה עקוב אחר עוצמת הריצה. לאחר השלמת 101 מחזורים. בצע כימיה מפנה כדי להשלים את הקריאה השנייה.האב הראשון זיווג וריאגנטים, והשני קרא מאגר שילוב. לאחר מכן טען את הריאגנטים, המשך ברצף, הפעל הערכה. שנית, קרא את עוצמת הרבעון השלישי ומדדי איכות אחרים ככל שהריצה מתקדמת.כדי להתחיל בניתוח נתונים, השתמש בגירסה העדכנית ביותר של קסאווה כדי להמיר את קבצי קריאת הבסיס לקבצי FAST Q. הגדרת ספירת אשכולות Q מהירה לאפס כדי להבטיח יצירת קובץ Q מהיר אחד. עבור כל דגימה, פתח את קבצי ה-Q המהירים לניתוח במורד הזרם.בצע התאמה ויישור באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של הכובע העליון, המיישרת את קריאות RNA-Seq לגנומים בגודל יונקים באמצעות כלי קריאה קצרה ו-SAM בתפוקה גבוהה במיוחד, המיישמים כלי עזר שונים ליישור לאחר עיבוד בפורמט SAM. ניתן להוריד את הטרנסקריפטום האנושי ההתייחסות מהגנום I בכובע העליון הפועל נעשה שימוש בכל הגדרות הפרמטרים המוגדרות כברירת מחדל, כולל אפשרות סוג הספרייה כקטע לא תקוע באמצעות החלק ההבדלים של שרוול התוכנית בחבילת התוכנה cufflinks. השווה את התאים שטופלו בתטרומבין לתאי הביקורת.סנן את תעתיקי הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בתאים שטופלו בתטרומבין על סמך טרנסקריפטום הייחוס האנושי. לאחר מכן השתמש בגיליון אלקטרוני כדי להמחיש את התוצאה בצורת טבלה. במקרה זה, נעשה שימוש בכל הגדרות ברירת המחדל של הפרמטרים ואותם תעתיקי גנים עם FPKM קטן מ-0.05 ו-p גדול מ-0.05 סוננו החוצה כדי לזהות איזופורמים חדשים ללא הפניה.טרנסקריפטום משווה את קבצי תמלול הדגימה לגנום הייחוס באמצעות השוואת שרוול. בדוק את הביטוי הדיפרנציאלי עם הבדל שרוול באמצעות קבצי תעתיק התרומבין המשולבים כגנום הייחוס לניתוח אחד וקבצי תעתיק הבקרה המשולבים כגנום הייחוס לניתוח שני, שוב, השתמש בגיליון אלקטרוני כדי לדמיין את התוצאה בפורמט טבלאי. כמו קודם, אותם תעתיקי גנים עם FPKM קטן מ-0.05 ו-p גדול מ-0.05 סוננו החוצה.לאחר שלב זה, החוקרים עשויים לבחור להעלות רשימה של תמלילים שדווחו לאחרונה לאתר דפדפן הגנום של uc SC כדי לאמת את תקפותם על ידי בדיקה ידנית. ניתן גם להגיש רשימות של גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי לניתוח מסלול המצאה לאפיון הגנים והמסלולים המושפעים מהטיפול בטרומבין. בשלב זה, החוקרים עשויים לבחור להשתמש ב-cummerbund חבילת R שנועדה לסייע ולפשט את המשימה של ניתוח פלט RN aeq של חפתים כדי לעזור לנהל, לדמיין ולשלב את כל הנתונים המופקים על ידי ניתוח הבדלים בשרוול.לאחר מכן מבוצע אימות תוצאות ה-RN aeq על ידי Q-R-T-P-C-R תחילה, לבצע בידוד RNA כולל מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של ריאות אנושיות שטופלו בטרומבין, הערכת איכות RNA וכימות RNA כפי שהודגם קודם לכן בסרטון. לאחר מכן צור DNA משלים ממיקרוגרם אחד של RNA כולל של כל דגימה עם מערכת סינתזה של שלושה גדיל ראשון rt בהתאם להוראות היצרן. לבסוף, בצע ניתוח Q-R-T-P-C-R על מערכת PCR VI של שבעה בזמן אמת באמצעות נוקלאוטידים מתוכננים לפי דרישה של TAC MAN המפורטים בפרוטוקול הכתוב הנלווה לסרטון זה ומדדו כימות כמתואר שם.היחס בין 28 שניות ל-18 S משמש באופן מסורתי כאינדיקטור לפירוק RNA כדי לכמת בצורה מדויקת יותר את הפירוק, מערכת החוויה מחשבת אינדיקטור איכות RNA או מספר RQI. אלגוריתם RQI משווה את האלקטרופרוגרמה של דגימות RNA לנתונים מסדרה של דגימות RNA מתוקננות ומחזיר אוטומטית מספר בין 10 לאחד. דגימת ה-RNA צריכה להיות בעלת RQI של לפחות שבע ובאופן אידיאלי גדול משמונה.תוצאות Experian אלה מצביעות על דגימת RNA באיכות גבוהה עם RQI של 8.4. הספריות צריכות להיות בעלות פס רחב בכ-250 עד 300 זוגות בסיסים כפי שמוצג באיור זה של תוצאות Experian עבור ספרייה באיכות גבוהה. כאן מוצגות תוצאות Q-R-T-P-C-R של דגימות עקומה סטנדרטיות ודגימה אחת לא ידועה.יש לעקוב כל הזמן אחר ההתקדמות והאיכות של ריצת הריצוף לאורך כל הריצה. איור זה מציג את צפיפות האשכול המתאימה במהלך שלב ההדמיה של המחזור הראשון. זו האינדיקציה הראשונה לריצה.אשכולות איכותיים צריכים להיות בהירים וממוקדים. מוצגת דוגמה לדוח הבסיס הראשון שנוצר לאחר השלמת המחזור הראשון. חשוב להעריך את רמות העוצמה המשוערות של צפיפות האשכולות ואיכות המיקוד בשלב זה.מחסום האיכות הבא לאחר המחזור הרביעי מוצג כאן. זה מראה את צפיפות האשכול המוחלטת עבור כל נתיב. צפיפות האשכול לא צריכה להיות מעל 850 K למילימטר מרובע לאחר מחזור 13.נתונים סטטיסטיים של שלבים ושלבים מקדימים מחושבים. מספרים אופייניים הם בין 0.1 ל-0.25. הערכת האיכות העיקרית אפשרית לאחר מחזור 24 כאשר מחושבים מספר מדדי איכות.אחוז הקריאות מעל הרבעון השלישי הוא מדד לביטחון בבסיס. קריאה עם ציון Q של שלוש פירושה שיש סיכוי של 1 ל-1000 שקריאת הבסיס שגויה. ציוני ה- Q יפחתו ככל שההפעלה מתקדמת, אך הם אמורים להתחיל עם יותר מ- 95% מהקריאות שנפגשות או עולות על Q3. האשכולות העוברים מסנן או pf הם האשכולות שמהם יילקחו נתוני הרצף בפועל.באופן אידיאלי, זה צריך להיות מעל 85%האשכול pf מבוסס על גורמים רבים כולל שלבים, עוצמת קדם שלבים, Q3.It לא ישתנה ככל שהריצה מתקדמת. האחוז המיושר הוא מדד לקריאות שמתיישרות בזמן אמת לגנום FI x. מכיוון שספריית x של כ-1%FI הוכנסה לספריות המדגם, האחוז המיושר צריך להיות בין 0.5 ל-1.נתון זה מראה כי תוכן הספרייה מיוצג היטב על ידי האשכולות ולא הייתה הטיית יצירת אשכולות המפורטים כאן הם גנים ואיזופורמים בקרה ובתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים אנושיים שטופלו בתרופמבין. יש לציין כי זוהו כ-26,000 איזופורמים חדשים, מה שממחיש את חוזקו של RN aeq. זה יכול לזהות RNA לא ידועים.לחלופין, תעתיקים מחוברים ושימוש במקדם חלופי, שאינם ניתנים לזיהוי על ידי טכניקות מיקרו-מערך. RNA-Seq יכול גם למדוד את התעתיקים הפחות נפוצים שזוהו באופן לא מדויק, מכומת או לא מזוהה על ידי מיקרו-מערכים כדי לאמת את תוצאות ה-RNA-Seq באמצעות גישה חלופית. ניסוי A-Q-R-T-P-C-R בוצע כדי לבחון שלושה גנים שונים בנתוני RNA-Seq TR אחד היה מווסת פי 7.96 עצמי.אחד הורד פי 1.16 ותודה לשניים הפחית פי 1.70 בנתוני Q-R-T-P-C-R, המספרים המקבילים הללו הם פלוס פי 7.25 פחות פי 1.15 ופי 2.07 בהתאמה. התוצאות של שלושת הגנים הללו שנבדקו על ידי RNA-Seq ו-Q-R-T-P-C-R תואמות היטב, מה שמאשש את תוצאות ה-RNA-Seq. פרוטוקול זה הוא ספציפי ל-IC בנקודת זמן אחת של מיקרו-וסקולרי ריאתי אנושי שטופל בטרובין בתאים הבכירים, אך ניתן להתאים אותו בקלות למחקר רב-זמני או למחקרים ברקמות תאים אחרות שטופלו בגירויים או מעכבים שונים או השוואה של טרנסקריפטומים בתא או ברקמות בין מצב בריא למצב המחלה.למרות שהוא ספציפי ל-SQ 1000 הגבוה, פרוטוקול זה ישים לכל אחד ממשפחת HighSeq או מנתח הגנום. שני מכשירים עם שינויים קלים בשלבי יצירת האשכול וריאגנטים לרצף. פלטפורמות ריצוף DNA אחרות מהדור הבא כגון הסדרה המוצקה.מערכות ה-GS, כמו גם כמה מערכות חדשות יותר, משמשות גם הן למטרת RNA-Seq. למרות שנהלי בניית הספרייה והרצף שלהם עשויים להיות שונים במקצת, עצות הטיפול ב-RNA, חלקי ניתוח הנתונים והאימות על ידי R-T-P-C-R המוצגים בפרוטוקול זה יכולים להיות בעלי ערך ייחוס ליישומי ה-RNA-Seq שלהם.

rna-seq-analysis-transcriptomes-thrombin-treated-control-human

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ניתוחי RNA-רצף וביואינפורמטיקה שמשו לזהות גורמי שעתוק הביעו באופן משמעותי ואופן דיפרנציאלי בתת אוכלוסיות לין-CD34 + ולין-CD34- של EMLcells עכבר. גורמי שעתוק אלו עשויים לשחק תפקיד חשוב בקביעה לעבור בין תאי לין-CD34- לין-CD34 + ומובחן באופן חלקי עצמי חידוש.

זיהוי של גורמי מפתח עם הרגולציה עצמית התחדשות והתמיינות בתאי EML המטופואטיות מבשר על ידי ניתוח RNA-רצף

אנדותל כלי הדם שולט בחוזקה ליקוציט גיוס. ליקוציט לקוי extravasation תורם למחלות דלקתיות. לכן, בחיפוש אחר הרומן יסודות ההפעלה אנדותל תקינה יש צורך לעצב משופרת טיפולים עבור הפרעות דלקתיות. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה מקיפה לאפיון הרומן הרגולטורים אנדותל היכולות לשנות ליקוציט סחר בעת דלקת.

הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית

עבור במבחנה אינדוקציה של המעבר אנדותל-mesenchymal (EndMT), אשר הוא שימושי עבור חוקרים הסלולר איתות המסלולים מעורב EndMT, פרוטוקול המתואר. במודל זה ניסיוני, EndMT הנגרמת על ידי טיפול עם TGF-β בתאי האנדותל MS-1.

אנליזה מולקולרית של אנדותל-mesenchymal מעבר המושרה על ידי הפיכת גורם גידול-β איתות

miRNA הרפוי יש פוטנציאל משמעותי בוויסות התקדמות סרטן. המודגמות כאן גישות אנליטיות משמשים לצורך זיהוי הפעילות של טיפול miRNA קומבינטורית להפסקת מחזור התא, אנגיוגנזה.

ניתוח של miRNA קומבינטורית טיפולים כדי להסדיר מחזור התא, אנגיוגנזה

אנו מציגים גישה כדי לטהר את הריבוכמה מאוגד-mRNA מתאי כלי הדם (ECs) ישירות במוח העכבר, הריאות ורקמות הלב באמצעות התגית הגנטית ספציפית EC של חלבון פלואורסצנטית ירוק משופר (EGFP) ב ריבוזומים בשילוב עם טיהור RNA .

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

אנו מציגים מודל מחלת כלי דם במבחנה לחקור אינטראקציות דם שלם עם אנדותל נגזר המטופל. מערכת זו מאפשרת לחקור תכונות טרומבוגניות של תאי אנדותל ראשוניים בנסיבות שונות. השיטה מתאימה במיוחד להעריך את הטיפול situ thrombogenicity ונוגדי קרישה בשלבים שונים של קרישה.

במודל מחלה מיקרופלוידיקית במבחנה ללמוד אינטראקציות דם-אנדותל שלם ודינמיקת קריש דם בזמן אמת

הפרוטוקול מתאר את הבידוד, התרבית והפרופיל של תאי האנדותל מהעורק המזנטרי האנושי. בנוסף, מסופקת שיטה להכנת העורק האנושי לתעתיק מרחבי. פרוטאומיקה, תעתיק ובדיקות תפקודיות יכולות להתבצע על תאים מבודדים. פרוטוקול זה יכול להיות repurposed עבור כל עורק בגודל בינוני או גדול.

בידוד ופרופיל של תאי אנדותל עורקים מזנטריים ראשוניים אנושיים ברמת השעתוק

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מתרביות תאים ex vivo או in vitro לעיבוד מקדים של נתוני תמלול לסינון תרופות מבוסס תמלול חסכוני.

בדיקת תרופות מבוססת תמלול חסכונית

פרוטוקול זה כולל תהליך עבודה שלב אחר שלב עבור דגימות וסקולריות מסוידות: טיפול ברקמות, דה-קלציפיקציה, אימות RNA, זיהוי רמות סיידון ואסטרטגיות בחירת אזור עניין ב-Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). המטרה היא להציג שיטה מקיפה לשימור מורפולוגיית רקמת כלי דם ו-RNA לניתוח טרנסקריפטומי מרחבי אמין.

הכנה ועיבוד עורקים מסויד עם מורפולוגיה ו-RNA משומרים לפרופילינג מרחבי דיגיטלי

עבודה זו מתארת בדיקה מיקרופלואידית המשתמשת במאמץ גזירה כדי להפעיל יצירת קרישי דם בדם ומאפיינת את הקריק באמצעות ממדים מרובים של קריאה. הבדיקה יכולה למדוד את הנטייה הפרותרומבוטית של דגימות דם, ולכן היא שימושית באבחון מחלות, גילוי תרופות, וכן במחקרים מכניים בסיסיים הקשורים לטרומבוזיס.

מבחן פרופיל תרומבוס: פלטפורמה מבוססת מיקרופלואידיקה לאפיון מקיף של תרומבוגנזה ביומכנית

למדו פרופיל transcriptomes באמצעות RNA-seq בתאי אנדותל מיקרווסקולריים ריאתיים אנושיים מטופלים בטרומבין. הפרוטוקול כולל בידוד RNA, בניית ספריית DNA, ריצוף HighSeq 1000 וניתוח נתונים לזיהוי גנים מופרשים באופן דיפרנציאלי.

ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל

גלה סרטונים נוספים